I Vivo Overvåking av Circadian klokke genuttrykk i musen Suprachiasmatic kjernen bruker fluorescens journalister
Summary
Denne nyutviklet fluorescens-basert teknologi gjør langsiktig overvåking av transkripsjon av circadian klokke gener i suprachiasmatic kjernen (SCN) av fritt flytte mus i sanntid og høy timelige oppløsning.
Abstract
Denne teknikken kombinerer optisk fiber mediert fluorescens opptak med presis levering av rekombinant adeno-assosiert virus basert genet journalister. Denne nye og brukervennlig i vivo fluorescens overvåking system ble utviklet for å registrere transcriptional rytmen av klokken genet, Cry1, i suprachiasmatic kjernen (SCN) av fritt flytte mus. Gjør ble Cry1 transkripsjon fluorescens reporter designet og pakket inn i Adeno-assosiert virus. Renset, konsentrert virus var injiseres i mus SCN etterfulgt av innsetting av en optisk fiber, som var så fast på overflaten av hjernen. Dyrene ble returnert til burene sine hjem og tillatt en 1-måned postoperativ restitusjonsperiode å sikre tilstrekkelig reporter uttrykk. Fluorescens ble deretter innspilt i fritt flytte mus via en i vivo overvåkingssystem som ble bygget på våre institusjonen. For de i vivo system, ble en 488 nm laser kombinert med en 1 × 4 bjelke-splitter som delt lyset i fire laser eksitasjon utganger lik strøm. Dette oppsettet aktiveres oss ta opp fra fire dyr samtidig. Hver av slippes ut fluorescens signalene ble samlet inn via et photomultiplier rør og et datakort oppkjøpet. I motsetning til tidligere bioluminescens i vivo circadian klokke opptak teknikk tillatt denne fluorescens i vivo systemet innspillingen av circadian klokke genuttrykk under lyset syklus.
Introduction
I pattedyr styrer suprachiasmatic kjernen (SCN) hele kroppens døgnrytme koordinere en individuell respons til eksogene miljøendringer (f.eks, lys, temperatur, stress, etc.)1. Core klokke komponenter består av Per1-3, Cry1-2, klokkenog Bmal1, og spille en sentral rolle i å regulere circadian klokken av hver celle. Hver celle i SCN inneholder transcriptional aktivatoren, klokke/BMAL1, som fungerer som en heterodimer til induserer uttrykk for PER og GRÅTE. PER / CRY komplekse deretter hemmer funksjonen til klokken/BMAL1 danner en transkripsjon-oversettelse feedback loop som tar ca 24 h komplett2,3.
Tidligere studier på SCN har hovedsakelig ansatt ex vivo SCN skive kultur metode4,5,6 , og mens denne tilnærmingen har gitt verdifull informasjon, begrensninger hemmet vår evne til å hente data om påvirkning av andre hjernen kjerner på SCN, samt effekten av ytre stimuli (f.ekslys) på, som bor i dette viktige området. I 2001 var Hitoshi Okamura gruppe først til å bruke bioluminescens systemet i vivo skjermen circadian klokke genuttrykk i SCN i fritt flytte mus7. Ken-ichi Honmas gruppe har brukt de siste årene videreutvikle bioluminescens i vivo systemet i SCN8,9,10. Sammen har disse studiene gitt forskerne muligheten til å overvåke circadian klokken i konstant mørke eller etter en. Men fordi bioluminescens er også svak å ha kontinuerlig overvåking under lys/mørke syklus, kombinert med det faktum at lys er dominerende signalet kreves for SCN-mediert entrainment circadian klokker11, er det økende behov for utvikling av eksperimentelle metoder som overvinne begrensningene knyttet bioluminescens opptak. Gjeldende rapport beskriver et fluorescens-basert system som ble bygget til å overvåke circadian klokken for SCN i vivo fritt flytte mus. Denne lett-å-bruke metoden tillater kontinuerlig overvåking under lys/mørke syklus og gir langsiktig observasjon av transkripsjon av circadian klokke gener i SCN i sanntid og tidsmessige høyoppløselig.
Protocol
Representative Results
Discussion
I motsetning til ex vivo metoder, for eksempel skive kultur4,5, RT PCR16og i situ hybridisering17, som krever at dyr bli drept, lar de i vivo metoden etterforskerne å studere circadian genuttrykk i et levende dyr. Som sådan, gjør denne teknologien mulighet å evaluere effekten av ulike fysiske forstyrrelser (f.eks, søvnmangel, stress, matinntaket, etc.) på neural cir…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker medlemmer i Zhang lab for å stimulere diskusjoner og medlemmer i Zhan lab for å gi teknisk assistanse. Denne forskningen ble støttet av tilskudd 31500860 (til C.Z.) av NSFC, 2012CB837700 (til E.E.Z. og C.Z.) av programmet 973 fra M.O.S.T. i Kina, og finansiering fra Beijing bystaten. E.E.Z. ble støttet av kinesiske “Rekruttering Program av Global Youth eksperter”.
Materials
| KOD Plus Neo | TOYOBO | KOD-401 | Reagent |
| pVENUS-N1 | addgene | #61854 | Plasmid |
| pcDNA3.3_d2eGFP | addgene | #26821 | Plasmid |
| pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA | addgene | #20297 | Plasmid |
| MluI | Thermo Scientific | FD0564 | Reagent |
| EcoRI | Thermo Scientific | FD0274 | Reagent |
| Gibson Assembly Mix | NEB | E2611s | Reagent |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Scientific | 12566014 | Reagent |
| Syringe Filter | EMD Millipore | SLHV033RS | 0.45 µm |
| HiTrap heparin columns | gelifesciences | 17-0406-01 | 1 mL |
| Amicon ultra-4 centrifugal filter | EMD Millipore | UFC810024 | 100,000 MWCO |
| Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Reagent |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D5670 | Make fresh solution for each batch |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| pentobarbital | SigmaAldrich | #1507002 | Reagent |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| Hydrogen peroxide solution | SigmaAldrich | #216763 | Reagent |
| Optical Fiber | Thorlabs | FT200EMT | 0.39 NA, Ø200 µm |
| microsyringe pump | Nanoliter 2000 Injector, WPI | Equipment | |
| ceramic ferrule | Shanghai Fiblaser | 230 μm I.D., 2.5 mm O.D. | |
| Gene Observer | BiolinkOptics | Equipment |
References
- Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties. Annual Review of Physiology. 72, 551-577 (2010).
- Zhang, E. E., Kay, S. A. Clocks not winding down: unravelling circadian networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 764-776 (2010).
- Takahashi, J. S. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nature Reviews Genetics. 18, 164-179 (2017).
- Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101, 5339-5346 (2004).
- Davidson, A. J., Castanon-Cervantes, O., Leise, T. L., Molyneux, P. C., Harrington, M. E. Visualizing jet lag in the mouse suprachiasmatic nucleus and peripheral circadian timing system. European Journal of Neuroscience. 29, 171-180 (2009).
- Savelyev, S. A., Larsson, K. C., Johansson, A. S., Lundkvist, G. B. Slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Yamaguchi, S., et al. Gene expression: View of a mouse clock gene ticking. Nature. 409, 684-684 (2001).
- Ono, D., Honma, K. I., Honma, S. Circadian and ultradian rhythms of clock gene expression in the suprachiasmatic nucleus of freely moving mice. Science Reports. 5, 12310 (2015).
- Ono, D., Honma, S., Honma, K. Circadian PER2::LUC rhythms in the olfactory bulb of freely moving mice depend on the suprachiasmatic nucleus but not on behaviour rhythms. European Journal of Neuroscience. 42, 3128-3137 (2015).
- Ono, D., et al. Dissociation of Per1 and Bmal1 circadian rhythms in the suprachiasmatic nucleus in parallel with behavioral outputs. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 114, E3699-E3708 (2017).
- Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418, 935-941 (2002).
- Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genetics. 4, e1000023 (2008).
- Maywood, E. S., et al. Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, 9547-9552 (2013).
- Ukai-Tadenuma, M., et al. Delay in feedback repression by cryptochrome 1 is required for circadian clock function. Cell. 144, 268-281 (2011).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. Journal of Visualized Experiments. 57, e3348 (2011).
- Yamaguchi, Y., et al. Mice genetically deficient in vasopressin V1a and V1b receptors are resistant to jet lag. Science. 342, 85-90 (2013).
- Nagano, M., et al. An abrupt shift in the day/night cycle causes desynchrony in the mammalian circadian center. Journal of Neuroscience. 23, 6141-6151 (2003).
- Golombek, D. A., Rosenstein, R. E. Physiology of Circadian Entrainment. Physiological Reviews. 90, 1063-1102 (2010).
- Mei, L., et al. Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).
