Summary
Denne nyutviklet fluorescens-basert teknologi gjør langsiktig overvåking av transkripsjon av circadian klokke gener i suprachiasmatic kjernen (SCN) av fritt flytte mus i sanntid og høy timelige oppløsning.
Abstract
Denne teknikken kombinerer optisk fiber mediert fluorescens opptak med presis levering av rekombinant adeno-assosiert virus basert genet journalister. Denne nye og brukervennlig i vivo fluorescens overvåking system ble utviklet for å registrere transcriptional rytmen av klokken genet, Cry1, i suprachiasmatic kjernen (SCN) av fritt flytte mus. Gjør ble Cry1 transkripsjon fluorescens reporter designet og pakket inn i Adeno-assosiert virus. Renset, konsentrert virus var injiseres i mus SCN etterfulgt av innsetting av en optisk fiber, som var så fast på overflaten av hjernen. Dyrene ble returnert til burene sine hjem og tillatt en 1-måned postoperativ restitusjonsperiode å sikre tilstrekkelig reporter uttrykk. Fluorescens ble deretter innspilt i fritt flytte mus via en i vivo overvåkingssystem som ble bygget på våre institusjonen. For de i vivo system, ble en 488 nm laser kombinert med en 1 × 4 bjelke-splitter som delt lyset i fire laser eksitasjon utganger lik strøm. Dette oppsettet aktiveres oss ta opp fra fire dyr samtidig. Hver av slippes ut fluorescens signalene ble samlet inn via et photomultiplier rør og et datakort oppkjøpet. I motsetning til tidligere bioluminescens i vivo circadian klokke opptak teknikk tillatt denne fluorescens i vivo systemet innspillingen av circadian klokke genuttrykk under lyset syklus.
Introduction
I pattedyr styrer suprachiasmatic kjernen (SCN) hele kroppens døgnrytme koordinere en individuell respons til eksogene miljøendringer (f.eks, lys, temperatur, stress, etc.)1. Core klokke komponenter består av Per1-3, Cry1-2, klokkenog Bmal1, og spille en sentral rolle i å regulere circadian klokken av hver celle. Hver celle i SCN inneholder transcriptional aktivatoren, klokke/BMAL1, som fungerer som en heterodimer til induserer uttrykk for PER og GRÅTE. PER / CRY komplekse deretter hemmer funksjonen til klokken/BMAL1 danner en transkripsjon-oversettelse feedback loop som tar ca 24 h komplett2,3.
Tidligere studier på SCN har hovedsakelig ansatt ex vivo SCN skive kultur metode4,5,6 , og mens denne tilnærmingen har gitt verdifull informasjon, begrensninger hemmet vår evne til å hente data om påvirkning av andre hjernen kjerner på SCN, samt effekten av ytre stimuli (f.ekslys) på, som bor i dette viktige området. I 2001 var Hitoshi Okamura gruppe først til å bruke bioluminescens systemet i vivo skjermen circadian klokke genuttrykk i SCN i fritt flytte mus7. Ken-ichi Honmas gruppe har brukt de siste årene videreutvikle bioluminescens i vivo systemet i SCN8,9,10. Sammen har disse studiene gitt forskerne muligheten til å overvåke circadian klokken i konstant mørke eller etter en. Men fordi bioluminescens er også svak å ha kontinuerlig overvåking under lys/mørke syklus, kombinert med det faktum at lys er dominerende signalet kreves for SCN-mediert entrainment circadian klokker11, er det økende behov for utvikling av eksperimentelle metoder som overvinne begrensningene knyttet bioluminescens opptak. Gjeldende rapport beskriver et fluorescens-basert system som ble bygget til å overvåke circadian klokken for SCN i vivo fritt flytte mus. Denne lett-å-bruke metoden tillater kontinuerlig overvåking under lys/mørke syklus og gir langsiktig observasjon av transkripsjon av circadian klokke gener i SCN i sanntid og tidsmessige høyoppløselig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer i denne protokollen ble gjennomført med godkjenning av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av National Institute of Biological Sciences, Beijing, i henhold til statlige Kina.
1. bygging av Cry1 fluorescens reporteren
Merk: Tidligere circadian studier med bioluminescens system2,12,13 sikring en circadian promoter med en ustabil luciferase (dLuc) å indusere rytmisk dLuc uttrykk. For å utvikle fluorescens reporter, ble ustabil luciferase erstattet med ustabil fluorescens protein (dVenus) å indusere rytmisk dVenus uttrykk. Generering av P (Cry1)-dVenus reporter er beskrevet nedenfor, konstruksjon som sendes nå til Addgene og vil bli tilgjengelig snart for akademisk.
- Forsterke funksjonelle musen Cry1 selskapet (+328-1208 bp regionen av Cry1 genet, transkripsjon startwebstedet utpekt som '' -1 ''). Bruker PCR enzymet (kode pluss Neo), primere F1 og R1 (se tabell 2), mus genomet som en mal og produsentens PCR protokollen til å forsterke Cry1 promoter DNA fragmentet.
- Forsterke intron 336 av Cry1 genet, som er viktig for circadian klokkefunksjonen Cry114. Bruk PCR enzymet, primere F2 og R2, musen genomet som en mal og produsentens PCR-protokollen for å forsterke intron 336 DNA fragmentet.
- Forsterke Venus. Bruk PCR enzymet, primere F3 og R3, pVENUS-N1 plasmider som en mal og produsentens PCR-protokollen for å forsterke Venus DNA fragmentet.
- Forsterke NLS-D2 DNA fragmentet. Bruk PCR enzymet, primere F4 og R4, pcDNA3.3-d2eGFP plasmider som en mal og produsentens PCR-protokollen for å forsterke NLS-D2 DNA fragmentet.
- Syntetisere DNA fragment 1 som ekson 1.
- Syntetisere DNA fragment 2 som linker mellom intron 336 og Venus DNA fragmentet.
- Kutte pAAV-EF1a-dobbel floxed-hChR2 (H134R) - mCherry - WPRE-HGHpA vektor plasmider med MluI og EcoRI enzymer. Bruke Gel utvinning Kit for å rense større DNA fragmentet. Bruke produsentens protokollen.
- Bruke en Gibson montering blanding og dens standardprotokoll, samle alle DNA fragmenter sammen for å produsere pAAV-P (Cry1)-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA reporter. Bruke produsentens protokollen.
2. produksjon av Adeno-assosiert Virus15
- Forberede den følgende plasmider DNA aksjer: 31.25 µg av pRV1, 31.25 µg av pH21, 125 µg av pFdelta6 og 62.5 µg av pAAV-P (Cry1) - intron336 - Venus-NLS - D2-WPRE-HGHpA.
- Forberede fem 15 cm retter av 293T celler og vent til cellene blir 90% confluent.
- Transfect plasmider inn i 297T cellene følger transfection reagens protokollen. For hver rett, bruke 6,25 µg av pRV1, 6,25 µg 12.5 µg av pAAV-P (Cry1), pH21, 25 µg av pFdelta6-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA, og 120 µL av transfection reagensen.
- 72 h etter transfection, koble cellene fra hver plate med en pipette pistol; høste celler i to 50 mL rør.
- Pellets cellene på 800 x g i 10 min og kast nedbryting. Vask cellene ved å plassere 20 mL fosfat-bufret saltoppløsning (PBS) i hver retning; pellets cellene på 800 x g i 10 min, og forkaste nedbryting.
- Resuspend pellets 150 mM NaCl og 20 mM Tris løsning, pH 8.0; bruke 25 mL løsning/rør. Legge til 1,25 mL av nylagde 10% natrium deoxycholate (i dH2O) hver rør. Legge til benzonase nuclease en siste konsentrasjon av 50 enheter per mL, og bland godt. Inkuber ved 37 ° C i 1 time.
- Fjerne mobilnettet rusk ved sentrifugering 3000 x g i 15 min. Sikre at alle rester er fjernet ved å skyve blandingen gjennom et 0,45 μm sprøyte filter; Dette trinnet bidrar til å hindre blokkering av heparin kolonner.
- Definere heparin kolonner ved hjelp av en peristaltiske pumpe; Angi flyt til 1 mL/min, sikrer at ingen luftbobler innføres i kolonnene.
- Equilibrate kolonnene med 10 mL av en 150 mM NaCl, 20 mM Tris løsning, pH 8.0. Legge til løsningen som inneholder viruset, til hver kolonne. Vask kolonnene med 20 mL av en 100 mM NaCl, 20 mM Tris løsning, pH 8.0. Deretter bruker en 5 mL sprøyte, vask kolonnene med 1 mL av en 200 mM NaCl og 20 mM Tris løsningen pH 8.0, etterfulgt av 1 mL av en 300 mM NaCl og 20 mM Tris løsning, pH 8.0.
- Bruk en 5 mL sprøyte for å elute det viruset med 3 mL en 400 mM NaCl, 20 mM Tris løsning, pH 8.0, etterfulgt av 4 mL av en 450 mM NaCl, 20 mM Tris løsning, pH 8.0, og til slutt av en 3 mL en 500 mM NaCl , 20 mM Tris løsning, pH 8.0. Samle utdraget materialer.
- Rekombinant adeno-assosiert virus (rAAV) konsentrasjon, kan du legge utdraget materialer, 4 mL om gangen, i sentrifugalpumper filter enheter med en 100.000 molekylvekt cutoff. Sentrifuge hver 4-mL prøve 2000 x g i 5 min i romtemperatur, forkaster gjennomflytsenhet.
- Når alle utpakkede materialer har kjørt gjennom sentrifugal filter enheter, legge til 4 mL PBS og sentrifuge blandingen i ca 250 μL. Fjern rAAVs (viral titer skal være ca 2-8 x 1012 virus partikler per mL) fra sentrifugal filter enheter, aliquot og butikken på-80 ° C før bruk. På dette stadiet, kan viruset lagres i flere måneder.
3. rAAV injeksjon og optisk Fiber innsetting voksen mus SCN
- Injeksjon av circadian fluorescens reporter-bærer rAAVs i SCN
- Laste 5 µL av rAAV (virus titer handler om 2-8 x 1012 viruspartikler per mL) i en mikro-sprøyte.
- Bedøve en voksen mus (2-5 måneden-gamle, C57BL/6 bakgrunn) med Nembutal (80 mg/kg) via intraperitoneal injeksjon. Se etter tilstrekkelig dybde av anestesi ved mangel på tå-klype svar.
- Bruk saks å fjerne pels fra hodet av musen og deretter montere musen i en stereotaxic apparater. Gi en varmekilde bedøvet dyr via en sirkulerende varmtvann teppe eller en annen oppvarming enhet.
Merk: Alternativt bruke depilatory hårklippere for krem eller elektrisk fjerne pelsen. - Rengjør kirurgiske området med de aktuelle desinfeksjonsmidler. Dette kan for eksempel inkludere sterilt vann eller alkohol og jod, betadine eller fortynne chlorhexidine i annenhver scrubs. Gjenta 3 ganger. Drapere kirurgiske området.
- Bruk saksen et snitt i hodebunnen og utsette skallen.
- Justere stereotaxic apparatet slik at bregma og lambda er i samme horisontalplanet; gjøre to symmetriske rundt bregma i samme horisontalplanet.
- Bruk en steril bomull swab dynket i 4% H2O2h2O å korrodere hjernen periosteum. Deretter Bruk en ren, sterile bomullspinne å fjerne og tørke overflaten av skallen.
- Bruke en mikro drill, lage hull ca 1 mm i diameter 0,46 mm bakre og 0,25 mm lateral til bregma.
- Fi Bruk en ren sterilt bomullspinne med fysiologisk saltløsning fjerne beinfragmenter fra utsatte overflaten av hjernen.
- Sett inn en mikro-sprøyte i hjernen, slik at spissen av mikro-sprøyten er 0,46 mm bakre og 0,25 mm lateral bregma og 5.7 mm dyp fra overflaten av skallen.
- Injisere 500 nL av rAAV (50 nL min-1) i SCN, forlater mikro-sprøyten i stedet for 10 min etter injeksjon å sikre fullstendig spredningen av rAAV.
- Sakte trekke mikro-sprøyten.
- Den optiske fiberen inn SCN området.
- Bruker en optisk fiber kniv, kuttet en fiber 17 mm i lengde, at hver side av optisk fiber er glatt.
- Optisk fiber inn den keramiske ferrule og fikse optisk fiber til en keramisk ferrule med metyl etyl keton peroxide (AB lim), sikre at overflater av optisk fiber og keramiske ferrule flush.
- Rengjør fiber med en kald sterilisering løsning eller ethylene oksid.
- Etter rAAV injeksjon (trinn 3.1.11), setter du inn keramiske ferrule inneholder optisk fiber i SCN.
- Keramiske ferrule og optisk fiber på skallen bruke dental harpiks og la det tørke.
- Smøre overflaten av dental harpiks med tilbake neglelakk. Gjenta prosedyrene som står på 3.1.2 til 3.2.5, der faktiske injeksjon av rAAV for kontrollen.
- Post-kirurgisk behandling
- Gi mus postoperativ smertestillende, som buprenorfin 2 mg/kg kroppsvekt, subcutaneously, to ganger om dagen.
- Plasser mus i utvinning bur mens de kommer ut av anestesi.
- Huset mus individuelt under en 12t lys/mørke tilstand (lysintensiteten ~ 100 lux nederst i buret) med mat/vann tilgjengelig annonsen libitum. Åtte dager skal tildeles før videre eksperimentering å tillate tilstrekkelig utvinning tid og for å sikre optimal fluorescens reporter uttrykk.
4. i vivo fluorescens Signal overvåkning og datainnsamling
- Åtte dager etter operasjonen, koble fiber på mus hodet med fluorescens signalet skjermen (f.eks., Gene Observer). Sjekk fluorescens signalet i SCN kontroll mus å etablere bakgrunn signalet. Gjennomføre observasjon og måling av signalet bruke fluorescens signalet skjermen.
- Vurdere fluorescens signalet eksperimentelle mus på samme måte av kontroll musen. Ekskludere mus som har mottatt viral vektoren men som bare viser bakgrunnen signalet fra analyse, som betyr dette sannsynligvis at spissen av optisk fiber har savnet SCN. Etter disse første tiltakene, tilbake mus til merdene hjem for en annen 3 uker å tillate fluorescens signalet å stabilisere.
- Etter 3 uker, kan du koble musene fluorescens signalet skjermen. Måle fluorescens for 15 s hvert 10 min, med en frekvens på 100 Hz. Under disse målingene er mus fritt bevegelige inne deres burene med mat/vann tilgjengelig annonsen libitum. Bruk lav intensitet nederst i buret av ~ 100 lux, og en laser makt på spissen av optisk fiber mellom 15-20 µW.
- Etter ferdigstillelse av alle opptak, perfuse mus med 4% paraformaldehyde, og fjerne og skjær hjernen for å kontrollere plasseringen av optisk fiber. Ekskluder mus fra analyse om optisk fiber spissen ikke er riktig implantert i SCN.
5. analyse og presentasjon
- Mål fluorescens signal hvert 10 min 15 s, med en frekvens på 100 Hz, til 1500 datapunkt. Gjennomsnittet av disse 1500 poeng oversettes til fluorescens signalet til enhver tid. Planlegger flere gjennomsnitt over tid gir et signal til annen kurve som tilsvarer transcriptional rytmen av Cry1 under en kontroll lys tilstand i SCN fritt flytte mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fluorescens reporter utformingen av Cry1 var show i figur 1A. Ved hjelp av fremgangsmåten beskrevet ovenfor, 500 nL av rAAV-P (Cry1) - intron336 - Venus-NLS-D2 var vellykket injiseres SCN en voksen mus og utstilt robust Venus uttrykk (figur 1B, 1 C). Fluorescens signaler registrert under 12h / 12h lys/mørke (LD) og mørk/mørke (DD) forhold (figur 2) gitt robust døgnrytmen i begge betingelsene. Endelig ble fluorescens signalet innspilt i lange og korte fotoperiode betingelser (Figur 3).
Figur 1. Fluorescens reporter design og det uttrykket i SCN
(A) fluorescens reporter utformingen av Cry1. (B) Photomicrograph av musen hjernen viser reporter uttrykk 8 dager etter virus injeksjon. (C) forstørrelsen av området innrammet i rødt på photomicrograph vises i (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Fluorescens i vivo i SCN under LD og DD
(A) bakgrunn fluorescens i SCN viser ingen synlig rytme under både LD og DD forhold. Hvit og grå områder angir lys på og lys-off-perioder, henholdsvis. (B) P (Cry1) - intron336 - Venus-NLS-D2 uttrykk i løpet av 7 dager i en 12-12 LD tilstand og 7 dager i en DD-tilstand. (C) analyse av døgnrytmen LD tilstanden (~24.4 h); den røde linjen angir den konvergerte passer i sinus kurven (resultatet av passer vises i venstre panel). (D) analyse av døgnrytmen DD tilstanden (~23.25 h); den røde linjen angir den konvergerte passer i sinus kurven (resultatet av passer vises i venstre panel). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. I vivo fluorescens opptakene i SCN under 20-4 lang og 4-20 kort fotoperiode betingelser
Eksempel på et fluorescens opptak av P (Cry1) - intron336 - Venus-NLS-D2 uttrykk i SCN i 7 dager under 12-12 LD betingelse, etterfulgt av 7 dager under 20-4 lang fotoperiode betingelse, 3 dager under DD betingelse, 3 dager under en 12-12 LD tilstand, og deretter 7 dager under en 4-20 kort fotoperiode tilstand. Hvit og grå områder angir lys på og lys av periodene, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1. Bestemt reagenser kreves for protokollen (se Tabell for materiale)
| primer navn | sekvens | ||
| primer F1 | cactaggggttcctgcggccgcACGCGTGTAAAGATGCACATGTG | ||
| primer R1 | TTGTAACCTTGATACTTACCTACTTAGATCGCAGATCTCGTCCGG | ||
| primer F2 | GTTATGACACAGTGTAGAAACTATGGCATAGGACAGATGACTGTG | ||
| primer R2 | CATGGTCTTTGTAGTCCATGGTGGGTACCtCTTGACAGCTCTACC | ||
| primer F3 | ctgtattttcagggcCCTGCAGGtGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG | ||
| primer R3 | TACCTTTCTCTTCTTTTTTGGAGGCTTGTACAGCTCGTCCATGCC | ||
| primer F4 | GCATGGACGAGCTGTACAAGCCTCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAG | ||
| primer R4 | tgatatcgaattcGGATCCCTACACATTGATCCTAGCAGAAGCAC | ||
Tabell 2. Primer brukes i protokollen
Tabell 3. DNA sekvens benyttet i protokollen Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I motsetning til ex vivo metoder, for eksempel skive kultur4,5, RT PCR16og i situ hybridisering17, som krever at dyr bli drept, lar de i vivo metoden etterforskerne å studere circadian genuttrykk i et levende dyr. Som sådan, gjør denne teknologien mulighet å evaluere effekten av ulike fysiske forstyrrelser (f.eks, søvnmangel, stress, matinntaket, etc.) på neural circadian klokken. I motsetning til i vivo bioluminescens7,8,10 metoden bare operere i konstant mørke forhold, kan i fluorescens i vivo metoden brukes under lys forhold-en reell fordel av teknologien som lys signaler re entrainment SCN circadian klokken18. Selv om relativt konstant, robust døgnrytme kan oppdages med denne metoden, det bør nevnes at reporter teknologien gir ikke kvantitativ informasjon og kan derfor ikke brukes til å måle nivåene av genet transkripsjon og oversettelse.
Det er mange viktige skritt i denne protokollen. Konsentrert rAAV titer bør være så høyt som 2-8 x 1012 virus partikler per mL; lavere viral titers ville gi av svak eller selv uoppdagbar fluorescens signaler. Når bestemmer leder av musen til stereotaxic apparatet, kontroller at skallen er vannrett for å sikre nøyaktig posisjonering for virus injeksjon og optisk fiber implantasjon. Injeksjon av viruset bør gjøres sakte (≤50 nL min-1) å sikre at viruset forblir i SCN. De keramiske ferrule og optisk fiber skal festes sikkert på skallen og dental harpiks bør ikke kontakte huden. Hvis den keramiske ferrule og optisk fiber ikke er tilstrekkelig fast, vil de gradvis koble fra musen hodet.
Denne teknikken kan bli utvidet til å omfatte andre gene journalister (f.eks Per2, Bmal1, c-Fos, Pomc, etc.) ved å endre arrangøren og tilsvarende intron19. Reversere flagg-inton336-Venus-NLS-D2 kassetten med to motsatt lox sekvenser og kombinere reporteren med en grobunn musen linje, kan denne teknologien brukes til å registrere aktiviteten i bestemte neurons. For eksempel ville kombinere dette med en Vip-grobunn musen linje tillate for opptak av Cry1 transcriptional rytmer i vasoactive intestinal polypeptid-uttrykke nerveceller i SCN. Denne metoden kan også bruke GCaMP6 som en Ca2 + indikator registrere døgnrytmen for Ca2 + i hjernen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter av interesse å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker medlemmer i Zhang lab for å stimulere diskusjoner og medlemmer i Zhan lab for å gi teknisk assistanse. Denne forskningen ble støttet av tilskudd 31500860 (til C.Z.) av NSFC, 2012CB837700 (til E.E.Z. og C.Z.) av programmet 973 fra M.O.S.T. i Kina, og finansiering fra Beijing bystaten. E.E.Z. ble støttet av kinesiske "Rekruttering Program av Global Youth eksperter".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD Plus Neo | TOYOBO | KOD-401 | Reagent |
| pVENUS-N1 | addgene | #61854 | Plasmid |
| pcDNA3.3_d2eGFP | addgene | #26821 | Plasmid |
| pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA | addgene | #20297 | Plasmid |
| MluI | Thermo Scientific | FD0564 | Reagent |
| EcoRI | Thermo Scientific | FD0274 | Reagent |
| Gibson Assembly Mix | NEB | E2611s | Reagent |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Scientific | 12566014 | Reagent |
| Syringe Filter | EMD Millipore | SLHV033RS | 0.45 µm |
| HiTrap heparin columns | gelifesciences | 17-0406-01 | 1 mL |
| Amicon ultra-4 centrifugal filter | EMD Millipore | UFC810024 | 100,000 MWCO |
| Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Reagent |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D5670 | Make fresh solution for each batch |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| pentobarbital | SigmaAldrich | #1507002 | Reagent |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| Hydrogen peroxide solution | SigmaAldrich | #216763 | Reagent |
| Optical Fiber | Thorlabs | FT200EMT | 0.39 NA, Ø200 µm |
| microsyringe pump | Nanoliter 2000 Injector, WPI | Equipment | |
| ceramic ferrule | Shanghai Fiblaser | 230 μm I.D., 2.5 mm O.D. | |
| Gene Observer | BiolinkOptics | Equipment |
References
- Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties. Annual Review of Physiology. 72, 551-577 (2010).
- Zhang, E. E., Kay, S. A. Clocks not winding down: unravelling circadian networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 764-776 (2010).
- Takahashi, J. S. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nature Reviews Genetics. 18, 164-179 (2017).
- Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101, 5339-5346 (2004).
- Davidson, A. J., Castanon-Cervantes, O., Leise, T. L., Molyneux, P. C., Harrington, M. E. Visualizing jet lag in the mouse suprachiasmatic nucleus and peripheral circadian timing system. European Journal of Neuroscience. 29, 171-180 (2009).
- Savelyev, S. A., Larsson, K. C., Johansson, A. S., Lundkvist, G. B. Slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Yamaguchi, S., et al. Gene expression: View of a mouse clock gene ticking. Nature. 409, 684-684 (2001).
- Ono, D., Honma, K. I., Honma, S. Circadian and ultradian rhythms of clock gene expression in the suprachiasmatic nucleus of freely moving mice. Science Reports. 5, 12310 (2015).
- Ono, D., Honma, S., Honma, K. Circadian PER2::LUC rhythms in the olfactory bulb of freely moving mice depend on the suprachiasmatic nucleus but not on behaviour rhythms. European Journal of Neuroscience. 42, 3128-3137 (2015).
- Ono, D., et al. Dissociation of Per1 and Bmal1 circadian rhythms in the suprachiasmatic nucleus in parallel with behavioral outputs. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 114, E3699-E3708 (2017).
- Reppert, S. M., Weaver, D. R.
- Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genetics. 4, e1000023 (2008).
- Maywood, E. S., et al. Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, 9547-9552 (2013).
- Ukai-Tadenuma, M., et al. Delay in feedback repression by cryptochrome 1 is required for circadian clock function. Cell. 144, 268-281 (2011).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. Journal of Visualized Experiments. 57, e3348 (2011).
- Yamaguchi, Y., et al. Mice genetically deficient in vasopressin V1a and V1b receptors are resistant to jet lag. Science. 342, 85-90 (2013).
- Nagano, M., et al. An abrupt shift in the day/night cycle causes desynchrony in the mammalian circadian center. Journal of Neuroscience. 23, 6141-6151 (2003).
- Golombek, D. A., Rosenstein, R. E.
- Mei, L., et al. Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).
