Summary

В естественных условиях Мониторинг суточного часов экспрессии генов в мыши Супрахиазмальное ядро с помощью флуоресценции Репортеры

Published: July 04, 2018
doi:

Summary

Этот недавно разработанный на основе флуоресценции технология позволяет долгосрочный мониторинг транскрипцию генов суточного часов в Супрахиазмальное ядро (SCN) свободно перемещения мыши в режиме реального времени и с высоким временным разрешением.

Abstract

Этот метод сочетает в себе опосредованного волоконно-оптических флуоресценции записей с точной доставки рекомбинантных аденоассоциированный вирус на основе гена репортеров. Этот новый и простой в использовании в vivo флюоресценция системы мониторинга была разработана для записи transcriptional ритм часы гена, Cry1, в Супрахиазмальное ядро (SCN), свободно движущихся мышей. Чтобы сделать это, репортер флуоресценции транскрипции Cry1 был разработан и упакованы в аденоассоциированный вирус. Очищенных, концентрированных вирус был введен в ППП, следуют вставки оптического волокна, который затем был установлен на поверхности мозга мыши. Животные были возвращены их дома клетки и позволило послеоперационное восстановление 1-месячный период для обеспечения достаточной репортер выражение. Флуоресценции затем был записан в свободно перемещающихся мышей через в vivo система мониторинга, которая была построена в нашем заведении. В естественных условиях система записи 488 нм лазер был увязан с 1 × 4-splitter луча, разделить четыре лазерного возбуждения выходы равной силы света. Эта установка позволила нам запись из четырех животных одновременно. Каждый из сигналов испускаемого флуоресценции была собрана через трубу фотоэлектронный умножитель и сбор данных карты. В отличие от предыдущих биолюминесценции в естественных условиях технике суточного часов записи, этот флуоресценции в vivo система записи допускается запись выражения гена суточного часов во время свет цикла.

Introduction

В млекопитающих Супрахиазмальное ядро (SCN) регулирует суточный ритм всего тела для координации реагирования индивида на экзогенных экологических изменений (например, свет, температура, напряжение и т.д.)1. Основные компоненты часы состоят из Per1-3, Cry1-2, будильники Bmal1и играть центральную роль в регулировании суточного часов каждой ячейки. Каждая ячейка в ППП содержит transcriptional активатор, часы/BMAL1, который действует как гетеродимера побудить выражение % и ПЛАКАТЬ. PER / CRY комплекс затем угнетает функции часы/BMAL1 для формирования обратной транскрипции перевод, что занимает около 24 ч до полного2,3.

Предыдущие исследования на СКС главным образом использовали ex vivo SCN ломтик культуры метод4,5,6 , и, хотя этот подход предоставляет ценную информацию, ее ограничения препятствуют нашей способности получение данных относительно влияния других ядер головного мозга на СКС, а также воздействия внешних раздражителей (например, свет) на клетки, проживающих в этой критической области. В 2001 году Хитоси Окамура группы был первым для использования системы биолюминесценции в vivo экспрессии генов монитор суточного часов в ППП в свободно перемещающихся мышей7. Кен ити Хонма группы провел за последние несколько лет, развивая биолюминесценции в vivo система записи в SCN8,9,10. Вместе эти исследования предоставили исследователям возможность контролировать суточного часов в постоянной темноты или после светового импульса. Однако потому что биолюминесценция слишком тусклыми, чтобы обеспечить непрерывный мониторинг во время цикла свет/темно, в сочетании с тем фактом, что свет является преобладающим сигнал, необходимые для СКС опосредованной уноса суточного часы11, есть растущий спрос на разработки экспериментальных методов, которые преодолеть ограничения, связанные с записью биолюминесценции. Текущий отчет описывает флуоресценции балльной системе, которая была построена для мониторинга суточного часов ППП в естественных условиях в свободно перемещающихся мышей. Этот простой в использовании метод позволяет непрерывный мониторинг во время цикла свет/темно и позволяет для долгосрочного наблюдения транскрипцию генов суточного часов в ППП в режиме реального времени и с высоким временным разрешением.

Protocol

Все процедуры в этом протоколе были проведены с одобрения институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) Национальный институт биологических наук, Пекин, в соответствии с положениями правительства Китая. 1. Строительство Cry1 флуоресценции репортер <p …

Representative Results

Флуоресценции репортер дизайн Cry1 был Показать на рисунке 1A. Используя подход подробно говорилось выше, 500 nL rAAV-P (Cry1) – intron336 – Венера-NLS-D2 был успешно введен в SCN взрослой мыши и выставлены надежные Венера выражение (рис. 1B, 1 C</str…

Discussion

В отличие от ex vivo методы, такие, как кусок культуры4,5, RT-PCR16и в situ гибридизация17, которые требуют убитых животных, в естественных условиях записи метод позволяет следователей для изучения экспрессии генов суточного …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим членов в Чжан лаборатории для обеспечения стимулирования обсуждений и членов в Чжань лаборатории для оказания технической помощи. Это исследование было поддержано грантов 31500860 (чтобы циркон) NSFC, 2012CB837700 (для E.E.Z. и циркон) 973 программы от M.O.S.T. Китая и финансирование от Пекина муниципального правительства. E.E.Z. было поддержано китайской «Программа набора глобальных молодежных экспертов».

Materials

KOD Plus Neo TOYOBO KOD-401 Reagent
pVENUS-N1 addgene #61854 Plasmid
pcDNA3.3_d2eGFP addgene #26821 Plasmid
pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA addgene #20297 Plasmid
MluI Thermo Scientific FD0564 Reagent
EcoRI Thermo Scientific FD0274 Reagent
Gibson Assembly Mix NEB E2611s Reagent
Lipofectamine 2000 Thermo Scientific 12566014 Reagent
Syringe Filter EMD Millipore SLHV033RS 0.45 µm 
HiTrap heparin columns gelifesciences 17-0406-01 1 mL 
Amicon ultra-4 centrifugal filter EMD Millipore  UFC810024 100,000 MWCO
Benzonase nuclease Sigma-Aldrich E1014 Reagent
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D5670 Make fresh solution for each batch
mouse stereotaxic apparatus B&E TEKSYSTEMS LTD #SR-5M/6M Equipment
pentobarbital SigmaAldrich #1507002 Reagent
mouse stereotaxic apparatus B&E TEKSYSTEMS LTD #SR-5M/6M Equipment
Hydrogen peroxide solution SigmaAldrich #216763 Reagent
Optical Fiber Thorlabs FT200EMT 0.39 NA, Ø200 µm
microsyringe pump Nanoliter 2000 Injector, WPI Equipment
ceramic ferrule Shanghai Fiblaser 230 μm I.D., 2.5 mm O.D.
Gene Observer BiolinkOptics Equipment

References

  1. Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties. Annual Review of Physiology. 72, 551-577 (2010).
  2. Zhang, E. E., Kay, S. A. Clocks not winding down: unravelling circadian networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 764-776 (2010).
  3. Takahashi, J. S. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nature Reviews Genetics. 18, 164-179 (2017).
  4. Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101, 5339-5346 (2004).
  5. Davidson, A. J., Castanon-Cervantes, O., Leise, T. L., Molyneux, P. C., Harrington, M. E. Visualizing jet lag in the mouse suprachiasmatic nucleus and peripheral circadian timing system. European Journal of Neuroscience. 29, 171-180 (2009).
  6. Savelyev, S. A., Larsson, K. C., Johansson, A. S., Lundkvist, G. B. Slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
  7. Yamaguchi, S., et al. Gene expression: View of a mouse clock gene ticking. Nature. 409, 684-684 (2001).
  8. Ono, D., Honma, K. I., Honma, S. Circadian and ultradian rhythms of clock gene expression in the suprachiasmatic nucleus of freely moving mice. Science Reports. 5, 12310 (2015).
  9. Ono, D., Honma, S., Honma, K. Circadian PER2::LUC rhythms in the olfactory bulb of freely moving mice depend on the suprachiasmatic nucleus but not on behaviour rhythms. European Journal of Neuroscience. 42, 3128-3137 (2015).
  10. Ono, D., et al. Dissociation of Per1 and Bmal1 circadian rhythms in the suprachiasmatic nucleus in parallel with behavioral outputs. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 114, E3699-E3708 (2017).
  11. Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418, 935-941 (2002).
  12. Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genetics. 4, e1000023 (2008).
  13. Maywood, E. S., et al. Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, 9547-9552 (2013).
  14. Ukai-Tadenuma, M., et al. Delay in feedback repression by cryptochrome 1 is required for circadian clock function. Cell. 144, 268-281 (2011).
  15. McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. Journal of Visualized Experiments. 57, e3348 (2011).
  16. Yamaguchi, Y., et al. Mice genetically deficient in vasopressin V1a and V1b receptors are resistant to jet lag. Science. 342, 85-90 (2013).
  17. Nagano, M., et al. An abrupt shift in the day/night cycle causes desynchrony in the mammalian circadian center. Journal of Neuroscience. 23, 6141-6151 (2003).
  18. Golombek, D. A., Rosenstein, R. E. Physiology of Circadian Entrainment. Physiological Reviews. 90, 1063-1102 (2010).
  19. Mei, L., et al. Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).

Play Video

Cite This Article
Mei, L., Zhan, C., Zhang, E. E. In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters. J. Vis. Exp. (137), e56765, doi:10.3791/56765 (2018).

View Video