In Vivo Övervakning av dygnsrytm klocka genuttryck i mus suprachiasmatiska kärnan med hjälp av fluorescens reportrar
Summary
Denna nyutvecklade fluorescens-baserad teknik möjliggör långsiktig övervakning av transkriptionen av dygnsrytm klocka gener i suprachiasmatiska kärnan (SCN) av fritt rörliga möss i realtid och med hög temporal upplösning.
Abstract
Denna teknik kombinerar optisk fiber medierad fluorescens inspelningar med exakt leverans av rekombinant adeno-associerade virus baserat gen reportrar. Detta nya och lätt att använda i vivo fluorescens övervakning system har utvecklats för att registrera transkriptionell rytmen av genen klocka, Cry1, i suprachiasmatiska kärnan (SCN) i fritt rörliga möss. Att göra så, Cry1 transkription fluorescens reporter var konstruerade och förpackade i Adeno-associerade virus. Renat, koncentrerad virus injicerades i musen SCN följt av införandet av en optisk fiber, som var då fast på ytan av hjärnan. Djuren var återvände till sina hem burar och får en 1 månad postoperativ återhämtningsperiod att säkerställa tillräcklig reporter uttryck. Fluorescens spelades sedan in fritt rörliga möss via en in-vivo övervakningssystem som konstruerades på vår institution. För in-vivo inspelning system, var en 488 nm laser förenat med en 1 × 4-stråldelare som uppdelat ljuset i fyra laser excitation utgångar lika makt. Denna inställning kunde vi spela in från fyra djur samtidigt. Var och en av utsläppta fluorescens signaler samlades in via ett fotomultiplikatorn röret och ett datakort för förvärvet. I kontrast till den tidigare Mareld i vivo dygnsrytm klocka inspelningsteknik tillåtna denna fluorescens i vivo inspelning system inspelningen av dygnsrytm klocka genuttryck under lätta cykeln.
Introduction
Hos däggdjur reglerar suprachiasmatiska kärnan (SCN) hela kroppens dygnsrytm för att samordna individens svar på exogena miljöförändringar (t.ex., ljus, temperatur, stress, etc.)1. Klockan kärnkomponenter består av Per1-3, Cry1-2, klockaoch Bmal1, och spelar en central roll i regleringen av dygnsrytm klocka i varje cell. Varje cell i SCN innehåller transkriptionell aktivator, klocka/BMAL1, som fungerar som en heterodimer inducera uttrycket av PER och gråta. PER / CRY komplex sedan hämmar funktionen av klocka/BMAL1 att bilda en transkription-översättning feedbackloop som tar ca 24 h till komplett2,3.
Tidigare studier på SCN har huvudsakligen sysselsatt ex vivo SCN slice kultur metod4,5,6 och, medan detta synsätt har gett värdefull information, dess begränsningar har hämmade vår förmåga att Hämta data om påverkan av andra hjärnan kärnor på SCN, liksom effekten av yttre stimuli (t.ex., ljus) på celler som är bosatta i denna viktiga region. 2001 var Hitoshi Okamuras grupp först med att använda systemets Mareld att i vivo genuttryck monitor dygnsrytm klockan i SCN i fritt rörliga möss7. Ken-ichi Honmas grupp har tillbringat de senaste åren ytterligare utveckla den Mareld i vivo inspelning system i SCN8,9,10. Tillsammans har dessa studier försett forskare med förmåga att övervaka dygnsrytm klockan i konstant mörker eller efter en ljuspuls. Men eftersom Mareld är för svagt för att möjliggöra kontinuerlig övervakning under cykel ljus/mörk tillsammans med det faktum att ljus är den dominerande signal som krävs för den SCN-medierad övningsprovet dygnsrytm klockor11, finns ökande efterfrågan på utveckling av experimentella metoder som övervinna de begränsningar som är associerade med Mareld inspelning. Den aktuella rapporten beskriver ett fluorescens-baserat system som konstruerades för att övervaka dygnsrytm klockan i SCN i vivo i fritt rörliga möss. Den här lätt-till-använda metoden tillåter kontinuerlig övervakning under ljus/mörk cykeln och möjliggör långsiktiga observationen av transkriptionen av dygnsrytm klocka gener i SCN i realtid och med hög temporal upplösning.
Protocol
Representative Results
Discussion
I motsats till ex vivo metoder, såsom slice kultur4,5, RT-PCR-16och i situ hybridisering17, som kräver att djur dödas, tillåter de i vivo inspelning metod utredarna att studera dygnsrytm genuttryck i ett levande djur. Som sådan, ger denna teknik möjlighet att utvärdera effekten av olika fysiska störningar (t.ex., sömnbrist, stress, födointag, etc.) på neurala d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar medlemmar i Zhang labbet för att ge stimulerande diskussioner och medlemmar i Zhan labbet för att tillhandahålla tekniskt bistånd. Denna forskning stöddes av bidrag 31500860 (till C.Z.) av NSFC, 2012CB837700 (till E.E.Z. och C.Z.) av 973 programmet från M.O.S.T. av Kina, och finansiering från Beijing kommunstyrelsen. E.E.Z. stöddes av kinesiska ”rekrytering Program av Global Youth experter”.
Materials
| KOD Plus Neo | TOYOBO | KOD-401 | Reagent |
| pVENUS-N1 | addgene | #61854 | Plasmid |
| pcDNA3.3_d2eGFP | addgene | #26821 | Plasmid |
| pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA | addgene | #20297 | Plasmid |
| MluI | Thermo Scientific | FD0564 | Reagent |
| EcoRI | Thermo Scientific | FD0274 | Reagent |
| Gibson Assembly Mix | NEB | E2611s | Reagent |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Scientific | 12566014 | Reagent |
| Syringe Filter | EMD Millipore | SLHV033RS | 0.45 µm |
| HiTrap heparin columns | gelifesciences | 17-0406-01 | 1 mL |
| Amicon ultra-4 centrifugal filter | EMD Millipore | UFC810024 | 100,000 MWCO |
| Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Reagent |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D5670 | Make fresh solution for each batch |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| pentobarbital | SigmaAldrich | #1507002 | Reagent |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| Hydrogen peroxide solution | SigmaAldrich | #216763 | Reagent |
| Optical Fiber | Thorlabs | FT200EMT | 0.39 NA, Ø200 µm |
| microsyringe pump | Nanoliter 2000 Injector, WPI | Equipment | |
| ceramic ferrule | Shanghai Fiblaser | 230 μm I.D., 2.5 mm O.D. | |
| Gene Observer | BiolinkOptics | Equipment |
References
- Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties. Annual Review of Physiology. 72, 551-577 (2010).
- Zhang, E. E., Kay, S. A. Clocks not winding down: unravelling circadian networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 764-776 (2010).
- Takahashi, J. S. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nature Reviews Genetics. 18, 164-179 (2017).
- Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101, 5339-5346 (2004).
- Davidson, A. J., Castanon-Cervantes, O., Leise, T. L., Molyneux, P. C., Harrington, M. E. Visualizing jet lag in the mouse suprachiasmatic nucleus and peripheral circadian timing system. European Journal of Neuroscience. 29, 171-180 (2009).
- Savelyev, S. A., Larsson, K. C., Johansson, A. S., Lundkvist, G. B. Slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Yamaguchi, S., et al. Gene expression: View of a mouse clock gene ticking. Nature. 409, 684-684 (2001).
- Ono, D., Honma, K. I., Honma, S. Circadian and ultradian rhythms of clock gene expression in the suprachiasmatic nucleus of freely moving mice. Science Reports. 5, 12310 (2015).
- Ono, D., Honma, S., Honma, K. Circadian PER2::LUC rhythms in the olfactory bulb of freely moving mice depend on the suprachiasmatic nucleus but not on behaviour rhythms. European Journal of Neuroscience. 42, 3128-3137 (2015).
- Ono, D., et al. Dissociation of Per1 and Bmal1 circadian rhythms in the suprachiasmatic nucleus in parallel with behavioral outputs. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 114, E3699-E3708 (2017).
- Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418, 935-941 (2002).
- Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genetics. 4, e1000023 (2008).
- Maywood, E. S., et al. Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, 9547-9552 (2013).
- Ukai-Tadenuma, M., et al. Delay in feedback repression by cryptochrome 1 is required for circadian clock function. Cell. 144, 268-281 (2011).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. Journal of Visualized Experiments. 57, e3348 (2011).
- Yamaguchi, Y., et al. Mice genetically deficient in vasopressin V1a and V1b receptors are resistant to jet lag. Science. 342, 85-90 (2013).
- Nagano, M., et al. An abrupt shift in the day/night cycle causes desynchrony in the mammalian circadian center. Journal of Neuroscience. 23, 6141-6151 (2003).
- Golombek, D. A., Rosenstein, R. E. Physiology of Circadian Entrainment. Physiological Reviews. 90, 1063-1102 (2010).
- Mei, L., et al. Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).
