Summary
Vi har framgångsrikt genererade två substrat-specifika γ-sekretas analyser. Både cellbaserade analyser som presenteras här är utformade för att kvantifiera γ-sekretas enzymatiska aktiviteter via produktionen av firefly luciferas reportrar.
Abstract
Vi har utvecklat ett par cellbaserade reporter gen analyser att kvantitativt mäta γ-sekretas klyvning av olika substrat. Detta manuskript beskriver procedurer som kan användas för att övervaka γ-sekretas-medierad klyvning av antingen APP-C99 eller Notch, använder en Gal4 arrangören-driven firefly luciferas reporter systemet. Dessa analyser fastställdes genom stabilt samarbete transfecting HEK293 celler med Gal4-driven luciferas reporter gen och antingen Gal4/VP16-märkta C-terminal fragmentet av APP (APP-C99; CG celler), eller den Gal4/VP16-taggade Notch-ΔE (NΔE; NG celler). Använda dessa reporter analyser parallellt, vi har visat att en ErbB2-hämmare, CL-387,785, företrädesvis kan undertrycka γ-sekretas klyvning av APP-C99 i CG celler, men inte NΔE i NG celler. Differentiell Svaren utställda av CG och NG-cellerna, när de behandlas med CL-387,785, föreställer en rekommenderad kännetecken för γ-sekretas modulatorer, och dessa svar är i skarp kontrast till pan-hämning av γ-sekretas induceras av du. Våra studier ger direkta bevis att γ-sekretas aktiviteter mot olika substrat kan göras åtskillnad mellan i cellulära sammanhang. Dessa nya testmetoder kan därför vara användbara verktyg i läkemedelsutveckling för förbättrad AD terapier.
Introduction
Oligomera former av β-amyloid (Aβ) tros vara den primära orsaken till nervcellsdöd i hjärnan hos patienter som lider av Alzheimers sjukdom (AD)1. Aβ peptider produceras av stegvis klyvning av amyloid prekursor protein (APP), först av β-sekretas och sedan av γ-sekretas2. Under det senaste decenniet, har behandlingsmetoder mot behandling av AD fokuserat på förebyggande av Aβ produktion3. Majoriteten av studierna har fokuserat på antingen augmentation av α-sekretas aktivitet, som kan hindra γ-sekretas klyvning av APP och därmed minska produktionen av Aβ eller hämning av β-och/eller γ-sekretas verksamhet4. Tyvärr, icke-selektiv hämning av β - eller γ-secretases leder till oundvikliga biverkningar som är på grund av störning av andra fysiologiska substrat av β - och γ-sekretas5,6. Med avseende på γ-sekretas-hämmare, har senare studier rapporterade upptäckten av ett antal kemiska och genetiska modulatorer som kan reglera Aβ produktionen under lätt försumbara effekter på den väsentliga γ-sekretas-medierad bearbetningen av Notch7 ,8,9,10,11,12, dock framgångsrika therapeutics har ännu inte utvecklats. Alltså är ytterligare systematiska skärmar motiverade för att upptäcka nya genetiska och kemiska modifierare som selektivt kan modulera γ-sekretas-medierad APP bearbetning.
Γ-sekretas är känt för att klyva mer än 90 olika membran-förankrade proteiner. Bland dessa substrat är Notch, vars verksamhet är kritisk för cell öde beslutsamhet och differentiering under utveckling13. Selektivt modulera γ-sekretas-katalyseras APP bearbetning i avsaknad påverka Notch bearbetning kommer att vara avgörande för minimera Notch-relaterade biverkningar av γ-sekretas-hämmare, och denna selektivitet är tänkt att vara en primär faktor som kommer att diktera biologiska effekten av potentiella γ-sekretas modulatorer för kronisk behandling av AD. Det har varit ett antal arylsulfonamide derivat, såsom GSI-953 (begacestat) och BMS-708163 (avagacestat), som har befunnits uppvisa potent och selektiv hämning av γ-sekretas14,15. En tidigare studie visat att differential hämning av γ-sekretas klyvning av appen och Notch kan observeras med en kvantitativ ELISA-baserad analys i kombination med i vivo validering med zebrafiskar16. Cell-baserad analys paradigm har dessutom fastställts att ta itu med potentiella substrat selektivitet γ-sekretas mot APP och Notch17,18. Med protokoll liknar de som beskrivs häri, vi har nyligen upptäckt en ny klass av (D)-leucinamides som potent modulera γ-sekretas klyvning av APP med Notch-sparing selektivitet19. Denna samling av studier ger tillsammans ett proof-of-concept stödja uppfattningen att substrat selektivitet/tillgängligheten av γ-sekretas kan vara föremål för kemiska modulering och experimentell verifiering. Dock åberopa dessa assay plattformar ofta relativt låg genomströmning utläsningar och arbetsintensiva metoder som inte kanske uppfyller industristandarder för drug discovery program.
Vi har nyligen genererade cellbaserade luciferas reporter gen analyser som kvantitativt kan avgöra den katalytiska aktiviteten av γ-sekretas mot två distinkta substrat, 99-amino acid C-terminal fragmentet av APP (APP-C99) och den extracellulära domän-raderade Notch peptid (NΔE). Både APP-C99 och NΔE har använts som direkt substrat för γ-sekretas i olika analyser. För att skapa homogena och konsekvent luciferas reporter gen analyser för γ-sekretas klyvning av antingen APP-C99 eller NΔE, genererade vi en HEK-derived stabil cellinje (CG) som konstitutivt uttrycker en Gal4 arrangören-driven firefly luciferas reporter ( Gal4-Luc) och Gal4/VP16-taggade APP-C99 fusionsprotein (C99-GV). Dessutom genererade vi en annan HEK-derived stabil cellinje (NG) som konstitutivt uttrycker Gal4-Luc och Gal4/VP16-taggade NΔE (NΔE-GV). Använda dessa nya substrat-specifika γ-sekretas testmetoder, tillhandahålla vi nu en metod för att kvantifiera och skilja den katalytiska aktiviteten av γ-sekretas mot olika substrat (APP-C99 i CG celler), eller NΔE i NG celler. Dessutom utformades substrat-specifika γ-sekretas analyser bidra till hög-innehåll screening plattformar. Dessa nyligen genererade γ-sekretas testmetoder kunde bana väg för upptäckten av romanen γ-sekretas modulatorer som skulle kunna förbättra kognitiv funktion genom att undertrycka Aβ produktion utan framkalla oönskade Notch hämning för nästa generations behandling av AD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. mätning av luciferas Reporter signaler, som motsvarar till γ-sekretas klyvning av APP-C99 eller NΔE
Obs: Hänvisas till de tidigare publikationerna för detaljerade beskrivningar av generation av CG och NG celler20,21.
-
Utsäde NG eller CG celler (20, 000 celler per brunn) på 96 brunnar mikroplattor på en slutlig volym av 200 μL/brunn i odlingsmedium som består av Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) plus 10% fetalt bovint serum (FBS), 5 μg/mL blasticidin, 250 μg/mL antibiotikum (t.ex. zeocin), och 200 μg/mL hygromycin B.
- Räkna celler med en hemocytometer.
- Överför mikroplattor till en befuktade CO2 inkubator och inkubera vid 37 ° C över natten.
- Ta bort odlingsmedium 100 μL från varje brunn.
- Tillsätt 100 μL/brunn tillväxt medium innehållande 2 μg/mL tetracyklin med antingen 0,2% dimetyl sulfoxid (DMSO), 2 μM CL-387,785, 2 μM N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butylester (du), eller andra relaterade ErbB1/ErbB2-hämmare.
- Inkubera behandlade CG eller NG cellerna i mikroplattor vid 37 ° C under 24 h.
- Ta bort 150 μL/brunn odlingsmedium från mikroplattor.
- Tillsätt 50 μL/brunn luciferas assay reagens (se Tabell för material).
-
Överföra mikroplattor till en luminiscens microplate reader.
- Upprätthålla mikroplattor i rumstemperatur i 5 min med försiktig skakning.
-
Avgöra den Firefly luciferas (FL)-avges luminiscens använder ett fördefinierat program lagras i luminiscens microplate reader.
- Öppna programvaran instrument kontroll (se Tabell av material för instrumentet Detaljer).
- Välj 'Luminometry' på menyn 'Verktyg'.
- Under 'Parametrar' Inställningar, välja 'Inget filter' för utsläpp Filter, tick 'Normal' för utsläpp bländare, ange '1' för räkna tid och klicka på 'OK' för att ställa in luminiscens läsningen.
- Under fliken 'Instrument control', bläddrar du igenom listan över aktiva protokoll och välj förlagrade protokollet för läsning luminiscens.
- Under fliken 'Live visning' definiera skalan från den nedrullningsbara listan och välj 'Logaritmen' eller 'Linjär' för typen.
- Under fliken 'Temperatur', Välj 'Av' för plattan uppvärmning.
- Klicka på 'Start'-knappen för att utföra den luminiscens läsning.
- Som behövs, exportera resultat i kalkylbladsformat med 'Explorer' inbäddade i styrprogram.
2. kvantifiering av γ-sekretas aktivitet
-
Definiera en luminiscens signal som avges av CG eller NG celler behandlas med 0,1% DMSO i odlingsmedium som innehåller 1 μg/mL tetracyklin ensam som 100% relativ γ-sekretas aktivitet.
- Uppskatta bakgrund luminiscens från CG eller NG celler genom att behandla celler med odlingsmedium som inte innehåller tetracyklin.
- Normalisera luciferas signaler från CG eller NG celler som odlas med odlingsmedium som innehåller 1 μg/mL tetracyklin och antingen 1 μM CL-387,785 eller 1 μM av du med luciferas signal som avges av DMSO-behandlade CG eller NG celler (100% relativ γ-sekretas aktivitet, som (definitionen i 2.1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hämning av ErbB2 av CL-387,785 kan differentially främja behandlingen av APP-C99 av Γ -sekretas utan att påverka Notch klyvning
För att upprätta en cell-baserad analys som kan kvantitativt mäta proteolytisk klyvning av en viss γ-sekretas substrat, genererade vi HEK293-derived CG cell raden av stabil CO transfection av en tetracyklin-inducerbara C-obotligt Gal4/VP16-märkta APP-C99 och en Gal4 arrangören-driven firefly luciferas reporter gen. En parallell NG cell linje fastställdes också till assay för γ-sekretas klyvning av NΔE. I NG celler var en tetracyklin-inducerbara C-terminal Gal4/VP16-märkta NΔE och en Gal4 arrangören-driven luciferas reporter gen stabilt samarbete transfekterade i HEK293 celler. Γ-sekretas klyvning av APP-C99 i CG celler och γ-sekretas klyvning av NΔE i NG celler bekräftades först genom att behandla CG och NG celler med olika koncentrationer av du, en hämmare av pan-γ-sekretas som blockerar klyvning av alla γ-sekretas substrat ( (Se figur 1). Data visade också att γ-sekretas i CG andNG celler uppvisade jämförbara nivåer av katalys.
För att validera de substrat-specifika cellbaserade analyserna för γ-sekretas Klyvningar effektivitet, granskat vi luminiscens signalerna i CG och NG cellstreated med dubbla hämmare ErbB1/2 CL-387,785, som har visat att differentially modulera Γ-sekretas klyvning av APP-C99 och NΔE21. Vi har tidigare identifierat CL-387,785 som en selektiv γ-sekretas modulator på grund av dess störningar med protein-protein samspelet mellan presenilin-1 (PS1) och C99 och brist stör samspelet mellan PS1 och NΔE21. Här, data visar att behandling med CL-387,785 effektivt blockerat bearbetning av APP-C99 i CG celler, medan proteolys av NΔE i NG celler inte var påverkas (figur 2). Dessa resultat visar effektiviteten av CG och NG celler skilja mellan C99 och NΔE klyvning, i ett format som bidrar till hög genomströmning screening plattformar.
Figur 1: APP-C99-specifika cellulära γ-sekretas analysen (CG celler). CG celler var seedad på 96 brunnar mikroplattor (20 000 celler per brunn) över natten och behandlade med 1 μM av CL-387,785 eller du i närvaro av 1 μg/mL tetracyklin vid 37 ° C under 24 h. Den luminiscens härrör från γ-sekretas-medierad proteolys av C99-GV kvantifierades efter tillsats av 100 μL/brunn luciferas assay reagens. Luciferas signal som avges av celler behandlas med fordonet ensam (0,1% DMSO) angavs som 100% relativ luminiscens. Data visas som den medelvärde ± SD från tre oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Notch-specifika cellulära γ-sekretas analysen (NG celler). NG celler var seedad på 96 brunnar mikroplattor (20 000 celler per brunn) över natten och behandlade med 1 μM av CL-387,785 eller du i närvaro av 1 μg/mL tetracyklin vid 37 ° C under 24 h. Den luminiscens härrör från γ-sekretas-medierad proteolys av NΔE-GV kvantifierades efter tillsats av 100 μL/brunn luciferas assay reagens. Luciferas signal som avges av celler behandlas med fordonet ensam (0,1% DMSO) angavs som 100% relativ luminiscens. Data visas som den medelvärde ± SD från tre oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De lovande resultaten från en fas 1b-studie av aducanumab immunterapi för AD har etablerat Aβ kritiska roll i patogenesen av AD22 och tyder på att anti-Aβ metoder är fortfarande en livskraftig strategi för utveckling av anti-annonsen droger. Här beskriver vi cellbaserade analyser för att kvantifiera γ-sekretas-katalyseras proteolys av APP-C99 och NΔE använder firefly luciferas reporter system. APP-C99 och NΔE är de två mest väl studerat γ-sekretassubstrat och representerar tillsammans både de patogena och fysiologiska verksamhet av γ-sekretas13. Våra resultat att nedreglering av ErbB2 av CL-387,785 kan företrädesvis minska steady-state nivåerna av APP-C99 och utsöndrade Aβ är ytterligare underbyggda av de substrat-specifika cellulära analyserna av γ-sekretas beskrivs i föreliggande studie. Det nuvarande protokollet ger således en effektiv metod för upptäckten av romanen γ-sekretas modulatorer.
Fördelarna med detta γ-sekretas substrat-specifika assay paradigm är mångfacetterad. Exempelvis kunde dessa substrat-specifika γ-sekretas testmetoder utnyttjas i en preliminär skärm att utesluta potentiella icke-selektiva γ-sekretas inhibitorer från vidareutveckling och ge en kvantitativ bedömning som är relevant för att minimera potentiella biverkningar. Biologiska effekten av aktiva föreningar identifierats från denna metod kan sedan valideras ytterligare i neuronala celler och djurmodeller av AD, som visas i nyligen21. Homogenitet av CG och NG stabil cellinjer är dessutom kritiska till reproducerbarheten av våra experimentella resultat. Ännu viktigare, förhindrar tetracyklin-inducerbara uttrycket C99-GV eller NΔE-GV effektivt luciferas reporter uttryck som ses i andra system där C99 eller NΔE är konstitutivt uttryckta mättnad. Detta tetracyklin-inducerbara uttryck resulterar i en mycket tillförlitlig och konsekvent luciferas-signal som direkt korrelerar med γ-sekretas aktivitet, så att jämförelsen av γ-sekretas klyvning verksamheter mellan två olika substrat (APP-C99 kontra NΔE), eller från experiment till experiment på ett mycket effektivt sätt. För att få bästa resultat, aktiviteten av tetracyklin lösning bör kontrolleras regelbundet (helst en gång per månad) att säkerställa optimal induktion effektivitet. Som en extra fördel eliminerar enhetligheten av dessa plattformar behovet för att normalisera firefly luciferas med konstituerande Renilla luciferas uttryck. Slutligen, att behandla CG och NG celler med 1 µM avagacestat, en känd Notch-sparing γ-sekretas hämmare, kan fungera som en positiv kontroll för analysen.
En möjligt varning för att använda den nuvarande assay-plattformen är att överuttryck av γ-sekretassubstrat och efterföljande mättnad av transkriptionell reporter i våra analyser har viss potential att maskera hämmande aktivitet och bidra till avvikande hämmande potens bland de olika analyser23. Denna potentiella komplikation understryker behovet av sekundära assay plattformar för att validera effekten av Notch-sparande-hämmare γ-sekretas, som nyligen visas21. En annan potentiell begränsning med denna metod är att med tanke på mer än 90 olika membranet proteiner har identifierats som γ-sekretassubstrat, nuvarande assay plattformar inte ger en komplett profil av γ-sekretas substrat selektivitet. Längs dessa linjer kanske skona hämning av Notch klyvning inte den bästa avläsning att utvärdera γ-sekretas hämmare. Försiktighet bör iakttas på grund av faktumen att avagacestat, en Notch-sparing γ-sekretas hämmare, misslyckas att förbättra kognition24, och det är troligt att Notch hämning inte kanske är den enda grunden för toxicitet associerad med pan γ-sekretas hämmare 25. verktyget sanna träffar identifieras genom denna nya strategi skulle gångjärn vid om de nyligen identifierade Notch-sparing γ-sekretas hämmare äger romanen kemiska entiteter som inte finns i avagacestat, och om effekten av dessa hämmare kan vara valideras i vivo modeller av AD.
Sammanfattningsvis anser vi att den presenterade metoden kraftigt kan påskynda utvecklingen av APP-C99-specifika γ-sekretas hämmare/modulatorer för klinisk användning. Det finns ingen förnekelse att γ-sekretas hämmare, oavsett om de är Notch-sparande eller inte, potentiellt kunde inleda toxicitet hos AD-patienter, vilket skulle leda till oönskade tolerabilitet och resultat som tidigare föreslog26. Men med införandet av nya kemiska verktyg och förbättrad validering system21, γ-sekretas bör fortsätta att vara ett tilltalande drog mål på grund av dess biokemiska komplexitet, som kräver mer prekliniska och kliniska studier att utforska dess terapeutisk relevans i AD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka den Core Facility av institutet av cellulär och organismnivå biologi, Academia Sinica, för teknisk support. Denna studie stöddes av ministeriet för vetenskap och teknik, Taiwan (mest 103-2320-B-001-016-MY3 till Y.-F. L.), programmet för translationell Innovation av biofarmaceutiska utveckling – teknik stödja plattformen Axis system (NP7 till Y.-F.L.), och Academia Sinica (till Y.-F.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VictorLight luminescence plate reader | PerkinElmer | 2030-0010 | |
| Class II, Type 2 Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| CL-387,785 | EMD Calbiochem | 233100-1MG | |
| DAPT | Merck | 565770 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 12100046 | main compnent of growth medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher | 16000044 | |
| Blasticidin | Thermo Fisher | A1113903 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25005 | |
| Hygromycin B | Gibco | 10687010 | |
| Hemocytomer | Sigma-Aldrich | BR717805 Aldrich | |
| 96-well microplate | Nunc | 156545 | |
| Tetracycline | Sigma | T7660 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Steady-Glo luciferase assay reagent | Promega | E2510 | |
| Humidified CO2 incubator | Revco | Ultima II | |
| T-REx293 cell line | Invitrogen | R71007 | |
| Wallac 1420 software version 3.0 | PerkinElmer | instrument control software of the luminescence microplate reader |
References
- Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Mol Med. 8 (6), 595-608 (2016).
- Wolfe, M. S., Guenette, S. Y. APP at a glance. J Cell Sci. 120 (Pt 18), 3157-3161 (2007).
- Karran, E., Mercken, M., De Strooper, B. The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's disease: an appraisal for the development of therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 10 (9), 698-712 (2011).
- Citron, M. Alzheimer's disease: strategies for disease modification. Nat Rev Drug Discov. 9 (5), 387-398 (2010).
- Vassar, R., Kovacs, D. M., Yan, R., Wong, P. C. The beta-secretase enzyme BACE in health and Alzheimer's disease: regulation, cell biology, function, and therapeutic potential. J Neurosci. 29 (41), 12787-12794 (2009).
- Parks, A. L., Curtis, D.
- Kukar, T. L., et al. Substrate-targeting gamma-secretase modulators. Nature. 453 (7197), 925-929 (2008).
- Kounnas, M. Z., et al. Modulation of gamma-secretase reduces beta-amyloid deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Neuron. 67 (5), 769-780 (2010).
- Thathiah, A., et al. The orphan G protein-coupled receptor 3 modulates amyloid-beta peptide generation in neurons. Science. 323 (5916), 946-951 (2009).
- Flajolet, M., et al. Regulation of Alzheimer's disease amyloid-beta formation by casein kinase I. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (10), 4159-4164 (2007).
- Eisele, Y. S., et al. Gleevec increases levels of the amyloid precursor protein intracellular domain and of the amyloid-beta degrading enzyme neprilysin. Mol Biol Cell. 18 (9), 3591-3600 (2007).
- He, G., et al. Gamma-secretase activating protein is a therapeutic target for Alzheimer's disease. Nature. 467 (7311), 95-98 (2010).
- Haapasalo, A., Kovacs, D. M.
- Gillman, K. W., et al. Discovery and Evaluation of BMS-708163, a Potent, Selective and Orally Bioavailable gamma-Secretase Inhibitor. ACS Med Chem Lett. 1 (3), 120-124 (2010).
- Hopkins, C. R. ACS chemical neuroscience molecule spotlight on Begacestat (GSI-953). ACS Chem Neurosci. 3 (1), 3-4 (2012).
- Yang, T., Arslanova, D., Gu, Y., Augelli-Szafran, C., Xia, W. Quantification of gamma-secretase modulation differentiates inhibitor compound selectivity between two substrates Notch and amyloid precursor protein. Mol Brain. 1, 15 (2008).
- McKee, T. D., Loureiro, R. M., Dumin, J. A., Zarayskiy, V., Tate, B. An improved cell-based method for determining the gamma-secretase enzyme activity against both Notch and APP substrates. J Neurosci Methods. 213 (1), 14-21 (2013).
- Basi, G. S., et al. Amyloid precursor protein selective gamma-secretase inhibitors for treatment of Alzheimer's disease. Alzheimers Res Ther. 2 (6), 36 (2010).
- Liao, Y. F., Tang, Y. C., Chang, M. Y., Wang, B. J., Hu, M. K. Discovery of small molecular (D)-leucinamides as potent, Notch-sparing gamma-secretase modulators. Eur J Med Chem. 79, 143-151 (2014).
- Liao, Y. F., Wang, B. J., Cheng, H. T., Kuo, L. H., Wolfe, M. S. Tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1beta, and interferon-gamma stimulate gamma-secretase-mediated cleavage of amyloid precursor protein through a JNK-dependent MAPK pathway. J Biol Chem. 279 (47), 49523-49532 (2004).
- Wang, B. J., et al. ErbB2 regulates autophagic flux to modulate the proteostasis of APP-CTFs in Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (15), E3129-E3138 (2017).
- Sevigny, J., et al. The antibody aducanumab reduces Abeta plaques in Alzheimer's disease. Nature. 537 (7618), 50-56 (2016).
- Golde, T. E., Koo, E. H., Felsenstein, K. M., Osborne, B. A., Miele, L.
- Coric, V., et al. Targeting Prodromal Alzheimer Disease With Avagacestat: A Randomized Clinical Trial. JAMA Neurol. 72 (11), 1324-1333 (2015).
- Mitani, Y., et al. Differential effects between gamma-secretase inhibitors and modulators on cognitive function in amyloid precursor protein-transgenic and nontransgenic mice. J Neurosci. 32 (6), 2037-2050 (2012).
- Penninkilampi, R., Brothers, H. M., Eslick, G. D. Pharmacological Agents Targeting gamma-Secretase Increase Risk of Cancer and Cognitive Decline in Alzheimer's Disease Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis. J Alzheimers Dis. 53 (4), 1395-1404 (2016).
