Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لتقييم تأثير الببتيدات على هجرة الخلايا الظهارية الشعب الهوائية. يسمح هذا الأسلوب للحصول على بيانات كمية عن سرعة الإغلاق الهجرة والجرح خلية السريع واستنساخه بدرجة عالية.
Abstract
والهدف من هذا العمل لإظهار طريقة جديدة لتقييم قدرة بعض الجزيئات إيمونومودولاتوري، مثل الببتيدات المضادة للميكروبات (الامبير)، حفز الهجرة الخلية. الأهم من ذلك الهجرة الخلية حدث الحد من معدل أثناء عملية التئام إعادة تأسيس سلامة ووظيفة طبيعية من طبقات الأنسجة بعد الإصابة. ميزة هذا الأسلوب على التحليل الكلاسيكي، الذي يستند إلى الصفر يدوياً صنع في أحادي الطبقة خلية، إدراج استخدام الثقافة السيليكون الخاصة توفير حجرات اثنين لإنشاء حقل تجرح شبه خالية من خلية مع عرض المعالم (500 ميكرومتر ). وبالإضافة إلى ذلك، من الممكن سبب منصة تحليل صورة الآلي، سرعة الحصول على البيانات الكمية على سرعة الهجرة خلية وإغلاق الجرح. أكثر دقة، سيظهر أثر اثنين جلد الضفدع الامبير على هجرة الخلايا الظهارية الشعب الهوائية. وعلاوة على ذلك، ستوفر المعالجة المسبقة لهذه الخلايا مع مثبطات محددة معلومات عن الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه الأحداث.
Introduction
ومن المعروف أنه إلى حد كبير أن التئام الجروح في الحيوانات عملية أساسية إعادة تأسيس سلامة ووظيفة طبيعية من طبقات الأنسجة بعد الإصابة1. وبالرغم من الأسطح الظهارية المعرضة للبيئة الخارجية (مثل الجلد، والجهاز التنفسي، والجهاز الهضمي المسالك) تشكل حاجزاً واقيا من الشتائم الفيزيائية والكيميائية، وتشكيل الجروح يمكن أن تحدث بسهولة، لا سيما بعد الجراحة أو العدوى الميكروبية2. على سبيل مثال، استعمار أنسجة الرئة بمسببات المرض البكتيري الانتهازية الزّنجاريّة Pseudomonas، خاصة في مرضى التليف الكيسي (CF)، يؤدي إلى الأضرار من ظهارة الخطوط الجوية مع ما يترتب عليه من فشل الجهاز التنفسي3، 4. التئام الجروح إليه إصلاح مضيف معقدة لاستعادة الهيكل العادي النسيج المصاب5. ويتميز بالتهاب الأولى، تليها فترة تجديد يشمل ابيثيلياليزيشن والأوعية والأنسجة يعيد البناء مع إنتاج الكولاجين والخلية التمايز6،7،8 . لضمان سلامة الظهارية والتحكم في انتشار الميكروبات، جميع الكائنات الحية تنتج جزيئات الدفاع، بما في ذلك مضادات الميكروبات الببتيدات (الامبير)9،10. الجرح الشفاء عملية من الصعب جداً لمحاكاة في المختبر بسبب الافتقار إلى الحطام الخلية والتفاعلات المعقدة بين أنواع مختلفة من الخلايا. ومع ذلك، في المختبر قدرة الببتيد لتسريع إغلاق الجرح الزائفة عن طريق حفز هجرة خلايا الظهارية يدل على قدرته على الشفاء من ظهارة الشبهة. وفي الواقع، الهجرة الخلية حدث الحد من معدل في التئام الجروح، ودراسة العوامل التي يمكن أن تؤثر الهجرة الخلية سيساعد على العلاجات المستهدفة لتحسين التئام الجروح.
هنا، يتم توفيرها تحليل تجريبي استنساخه بدرجة عالية استناداً إلى إدراج الثقافة السيليكون الخاص لتقييم الهجرة الخلايا في المختبر. ويستند على خلق فجوة ميكرومترات 500 (الجرح الزائفة) على أحادي الطبقة خلية المتلاقية. سوف تبدأ الخلايا عند حافة الحقل "الجرحى" الاصطناعي هاجروا إلى منطقة خالية من الخلية، وتشكيل خلية خلية اتصالات جديدة. ويمثل إدراج الثقافة أداة جديدة للجرح بسرعة شفاء التجارب. يتم توفير خزانان مفصولة بواسطة جدار 500 ميكرومتر، ويمكن وضعها بشكل صحيح في لوحة طبق 3 سم أو في بئر صفيحة 12-جيدا. ملء كل حجرة من الإدراج مع تعليق خلية يسمح للخلايا تنمو في كل مجال من المجالات المعينة حتى التقاء، بينما إزالة الإدراج سوف تولد فجوة نظيفة خالية من خلية من حوالي 500 ميكرومتر (بنفس عرض الجدار الفاصل). متوسطة ثقافة خلية الصحيحة وتستكمل مع مجمع لاختبار يمكن إضافتها فيما بعد إلى الطبق لوحة/جيدا. وبعد ذلك يمكن تصور إغلاق الفجوة في فترات زمنية مختلفة تحت مجهر مقلوب، يفضل واحدة مزودة بكاميرا فيديو للحصول على الصور. وأخيراً، سيسمح قياس التغيرات في المنطقة المغطاة بالخلية ببرنامج تحليل الصورة التلقائية المستندة إلى ويب التحديد الكمي لسرعة الهجرة خلية وإغلاق الجرح. وعموما، هذا الأسلوب خطوة إلى الأمام فيما يتعلق بالتحليل الكلاسيكية، حيث الصفر يدوياً بواسطة إينسيسينج مونولاييرس خلية المتلاقية مع إبرة معقمة أو ماصة نصيحة11. وفي الواقع، يمكن أن تدمر الإجراء الأخير أسفل الطبق البلاستيك لوحة/جيدا وطلاء السطح، خلق التجاعيد. وبالإضافة إلى ذلك، منطقة "الجرحى" لا يكون عرض المعالم على طول الفجوة، كهذا يعتمد إلى حد كبير على الضغوط التي مورست من الباحثين بالإبرة/التلميح. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تشكل الخلايا المزاحة كتل من الخلايا الحية والميتة في حواف الصفر؛ وعلاوة على ذلك، انتشار الخلايا الحية في منطقة "الجرحى" يمكن أن تتداخل مع سرعة الهجرة الخلية، وتوليد نتائج غير قابل لإعادة الإنتاج12.
وبالإضافة إلى ذلك، وبفضل منصة تحليل صورة الصفر، يمكن للمستخدمين سرعة استلام (خلال دقائق) البيانات الكمية بشأن سلوك المهاجرة من الخلايا المحددة دون الحاجة إلى الحصول على برامج إضافية. هذا البرنامج قادر على تحليل التباين مرحلة الفحص المجهري الصور منخفض (~ 5 س)، والمتوسطة (~ 10 X)، والتكبير عالية (~ 20 X). بعد تحميل ملف مضغوط للصور (في *.jpg، *.jpeg، *.jp2، *.png، *.gif، تنسيق *.tiff) يجري التحليل تلقائياً لإنشاء ملف ملخص يبين النسبة المئوية للمناطق المغطاة بالخلية ومناطق الاحتكاك، وكذلك سرعة الخلية الهجرة، في فترات زمنية مختلفة.
في هذا العمل، باستخدام جلد الضفدع أمبير-مشتق، أي Esc(1-21) وفي دياستيريومير Esc(1-21)-1 ج13، وخط خلية الشعب الهوائية معربا عن وظيفية التليف الكيسي transmembrane الموصلية منظم (CFTR)14،15، ويرد مثال للهجرة الخلية الببتيد المستحثة بالمقارنة مع عينات غير المعالجة (التحكم). ملاحظة أن ظهارة مجرى الهواء و CFTR تلعب دوراً حاسما في الحفاظ على وظائف الرئة والجرح إصلاح16. وعلاوة على ذلك، عن طريق مثبطات انتقائية (مثلاً، AG1478)17 من مستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR)، دليل على أن هجرة خلايا الشعب الهوائية الناجمة عن الببتيدات المشار إليها أعلاه ينطوي على تفعيل EGFR12، ويقال 18 .
وخلاصة القول، أن الهدف من هذا الإجراء لإظهار كيفية الاستخدام من هذا القبيل إدراج الثقافة سيليكون يمثل مقايسة سريعة ويمكن الوصول إليها بسهولة لدقة تحديد الهجرة ملتصقة الخلايا (مثل الخلايا الظهارية الشعب الهوائية) والجزيئية آليات التحكم في مثل هذه الأحداث.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد الخلية
- البذور 2.5x106 خلايا في 10 مل من المتوسطة الأساسية الدنيا (MEM) تستكمل مع الجلوتامين 2 مم (ميمج)، بالإضافة إلى 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والمضادات الحيوية (0.1 مغ/مل من البنسلين وستربتوميسين) بوروميسين (0.5 ميكروغرام/ملليلتر لاختيار وصيانة الخلية خط) في قارورة T75. احتضان قارورة على 37 درجة مئوية و 5% CO2 لمدة يومين. قبل البدء التجربة، تحقق التقاء الخلايا تحت مجهر مقلوب.
ملاحظة: الخلايا المستخدمة للتجربة هي مخلدة الخلايا الظهارية الشعب الهوائية الإنسان عشر ترانسدوسيد مع ناقل لينتيفيرال منح المقاومة إلى بوروميسين. ستابلي يعربون عن14،CFTR فنية15. - بمجرد التقاء الخلايا وصلت إلى 90-100%، نضح المتوسطة من قارورة وتخلص منه في زجاجة نفايات تحت فئة سلامة بيولوجية مجلس الوزراء ثانيا. تغسل الخلايا مع 6 مل فوسفات مخزنة المالحة دون الكالسيوم والمغنيسيوم (مركز المرأة والأسرة-برنامج تلفزيوني). بلطف روك قارورة يدوياً وتجاهل الأسرة-برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: كن حذراً لا للمس المونولاير الخلية مع الماصة. - أضف 10 مل من مركز المرأة والأسرة-برنامج تلفزيوني واحتضان قارورة على 37 درجة مئوية و 5% CO2 لمدة 10 دقائق.
- نضح الأسرة-برنامج تلفزيوني وتجاهل ذلك. ثم أضف 2 مل من التربسين/أدتا إلى قارورة.
- روك بلطف قارورة، مما يتيح حل تماما معطف الخلايا، واحتضان قارورة على 37 درجة مئوية و 5% CO2 لمدة 10 دقائق حتى يتم فصل الخلايا مرئية تحت مجهر.
ملاحظة: في نهاية فترة الحضانة، وينبغي أن تظهر الخلايا مدورة ولا تعلق على سطح البلاستيك. إذا كانت الخلايا غير منفصلة تماما، قد يلزم الانفعالات اليدوي. - أضف 10 مل من ميمج بالإضافة إلى 10% FBS لإلغاء تنشيط التربسين وجمع الخلايا بغسل الجزء السفلي قارورة. تحويل وحدة التخزين إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
- الطرد المركزي في أنبوب لمدة 5 دقائق في 80 x ز.
- نضح المادة طافية وتعليق إعادة الخلايا في 6 مل ميمج بالإضافة إلى 10% FBS. ماصة مرارا وتكرارا تفريق أي كتل.
- تأخذ 10 ميليلتر من تعليق خلية مع ميكروبيبيتي وحقن الحجم إطار الزجاج غطاء وضع سابقا أكثر من دائرة باركر أو نويباور.
- حساب عدد الخلايا.
2-خلية البذر في الثقافة بإدراج
- في كل من لوحة 12-جيدا جيدا، نقل إدراج الثقافة مع ملاقط معقمة (الشكل 1). استخدام الملقط للضغط على طول حواف إدراج بغية إصلاحها على سطح اللوحة.
ملاحظة: قد يدرج الجانب السفلي لزجة تسمح الالتصاق.
الشكل 1 : التمثيل التخطيطي من إدراج ثقافة السيليكون، وضعت بشكل صحيح في آبار صفيحة 12-جيدا- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
- يضعف بشكل صحيح تعليق خلية في ميمج بالإضافة إلى 10% FBS. ملء كل حجرة من الإدراج مع 70 ميليلتر من تعليق خلية (حوالي 3.5x104 خلايا/الدائرة).
ملاحظة: كثافة الخلايا التي تطبق في كل حجرة يعتمد على نوع الخلايا. من المستحسن استخدام كثافة خلايا يؤدي إلى إكمال التقاء خلال 24 ساعة. - تحت المجهر، تحقق من عدم حدوث أي تسرب من المقصورات إدراج الخلايا واحتضان لوحة 12-جيدا عن 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5% أول أكسيد الكربون2.
3-شبه تجرح المقايسة الشفاء
- وبعد الحضانة، تصور الخلايا تحت المجهر المقلوب للتحقق من أنه تم تشكيل خلية المتلاقية مونولاييرس.
- تعليق إعادة المركبات الاختبار (مثلاً الامبير) في 1 مل ميمج.
ملاحظة: يعد تخفيف الامبير جديدة بدءاً من حل الأسهم المخزنة في-20 درجة مئوية. - إزالة بلطف إدراج بملاقط معقمة. أن يكون حريصا على عدم كسر مونولاييرس الخلية. نقل إدراج على ورقة ماصة.
ملاحظة: لإعادة استخدام إدراج نفس، وبهدف لهم في الإيثانول 70% على الأقل من 3 ح. من المستحسن للتخلص منها بعد ذلك. - لإزالة الخلايا غير ملتصقة، أضف 1 مل ميمج الواحدة وكذلك استخدام ميكروبيبيتي. إغلاق اللوحة والصخرة بلطف.
ملاحظة: لا تقم بإضافة المتوسطة مباشرة على رأس الخلية مونولاييرس تفادي تعطل بهم. - نضح على المديين المتوسط واستبدله مع 1 مل ميمج في البئر. إغلاق اللوحة وتصور الفجوات الخلية الحرة (الذي أنشأته إدراج) تحت المجهر المقلوب في 4 X التكبير، مجهزة بكاميرا فيديو. الحصول على الصور في وقت صفر (T0) وحفظها في تنسيق.jpg.
- إزالة المتوسطة من الآبار وغسلها مع 1 مل من برنامج تلفزيوني، وتجاهل ذلك.
- إضافة اختبار المركبات (أعدت في النقطة 3، 2) للآبار. لعينات مراقبة غير المعالجة، وإضافة 1 مل ميمج. احتضان اللوحة في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
- بعد 15، 20، ومعاملة ح 24، مراقبة الهجرة الخلية تحت المجهر في 4 X التكبير والحصول على الصور.
ملاحظة: خلال هذه الخطوة، في محاولة لالتقاط الصور في نفس المناطق وبالنسبة T0. اختيار الفترات الزمنية التي يتم التقاط الصور يعتمد على سرعة الهجرة الخلية. - لدراسة تأثير بعض مثبطات انتقائية، أي AG1478، على الهجرة الخلية، نضح المتوسطة من كل حجرة إدراج قبل إزالة إدراجات.
- تغسل كل حجرة مع ميمج جديدة وملء مع 70 ميليلتر من ميمج وتستكمل مع AG1478.
- وبعد 30 دقيقة من الحضانة في 37 درجة مئوية و 5% CO2، المضي قدما كما هو موضح من 3.3 نقطة.
ملاحظة: أثناء خطوة الغسيل والمعالجة المسبقة للخلية مونولاييرس مع مثبطات محددة، يكون حريصا على عدم إزالة تدرج.
4. تحليل الصورة
- عند الانتهاء من هذه التجربة، حدد صور العينات الأكثر تمثيلاً لمختلف المجموعات التجريبية، وإنشاء ملف مضغوط يحتوي على صور واحدة في ح T0، T15، T20، و T24.
ملاحظة: تؤخذ صور واحدة في الفترات الزمنية المحددة لجميع العينات. قم بتشغيل تريبليكاتيس لكل تجربة، والذي يتكرر ثلاث مرات على الأقل. في النهاية، للمجموعات التجريبية كل شيء، الحد ني صور 3 ("أ"، "ب"، "ج"، إلخ، المستمدة من كل تجربة مستقلة) عند كل نقطة الوقت يتم تحليلها. - تحميل ملف مضغوط إلى برمجيات تحليل الصورة التي تقدم عن طريق البريد الإلكتروني تلقائياً ملف ملخص جدول بيانات التي تحتوي على البيانات التجريبية للمناطق المغطاة بالخلية والصفر (كنسبة مئوية) عند نقطة زمنية محددة.
ملاحظة: يستند الاعتراف بالحافة الأمامية ومنطقة الفجوة إلى حد كبير على طريقة الكشف عن حافة (الرامية إلى تحديد النقاط التي يتغير سطوع الصورة حادا). - حفظ البيانات وجمعها. تطبيع جميع البيانات فيما يتعلق بقيمة متوسط الوقت صفر. حساب قيمة المتوسط للبيانات الموحدة لجميع replicates عند كل نقطة الوقت والخطأ القياسي النسبي (SEM). باستخدام تحليل التباين ثنائي الاتجاه (ANOVA)، إجراء تحليل إحصائي مع برامج الإحصائية مناسبة. تعتبر الاختلافات بين مجموعات معاملة الببتيد ومجموعات التحكم في فترات زمنية مختلفة لتكون إحصائيا significant ف< 0.05.
- رسم البيانات التي تم الحصول عليها في رسم بياني كالرسم بياني، الذي يبين النسبة المئوية للمنطقة المغطاة بخلية لكل عينة المجموعات مقابل الفواصل الزمنية المحددة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هذا البروتوكول المستخدم لتحديد الجرح الشفاء أثر Esc(1-21) و Esc(1-21)-1 ج من حيث نشاط الهجرة الخلية التي يسببها في الخلايا الظهارية الشعب الهوائية معربا عن CFTR الوظيفية. ووضعت في هذا التحليل، إدراج الثقافة في آبار صفيحة 12-جيدا، وكل حجرة وكان المصنف مع خلايا 35,000 في ميمج وتستكمل مع 10% FBS. الخلايا التوصل إلى التقاء كاملة داخل 24 h. بعد ذلك، ولدت فجوة 500 ميكرومتر، وبعضها أيضا كانت مليئة ميمج التي تحتوي على الببتيد بتركيزات مختلفة. وتكررت هذه التجربة أربع مرات. وكما هو مبين في الشكل 2، حملت الإغلاق الكامل تقريبا للحقل الزائفة تجرح المنتجة في أحادي الطبقة الخلية الببتيدات اثنين داخل ح ~ 20، في تركيزات الأمثل من 1 ميكرومتر و 10 ميكرو Esc(1-21)-1 ج و Esc(1-21)، على التوالي. وهذا يشير إلى أن Esc(1-21)-1 ج أكثر فعالية في تعزيز إعادة epithelialization جرح الزائفة في خلايا الشعب الهوائية.
الشكل 2 : تأثير اسكولينتين-1a المستمدة الامبير في إغلاق الجرح الزائفة التي تم إنشاؤها في أحادي الطبقة خلايا الظهارية الشعب الهوائية. كانت تبذر خلايا في كل حجرة من إدراج ثقافة السيليكون، وبعد إزالتها، تم تصوير الخلايا بالأدلة للهجرة الخلية 15 و 20 و 24 ساعة بعد إضافة الببتيدات. النسبة المئوية للمساحة المغطاة بخلية في كل مرة تم فيها احتساب نقطة مقارنة مع الخلايا غير المعالجة التحكم (Ctrl) ويقال على المحور ص. بيانات جميع الوسائل من أربع تجارب مستقلة ± ووزارة شؤون المرأة، ومأخوذة من دراسة سابقة14. مستويات الدلالة الإحصائية للاختبارات بين المراقبة والعينات المعالجة: *ف< 0.05، * *ف< 0.01، * * *ف< 0.001، و * * *ف< 0.0001. ميكروجرافس عرض نتائج الممثل قبل (T0) و 20 ح بعد العلاج للخلايا مع كل الببتيد في تركيز 1 ميكرومتر، بالمقارنة مع عنصر التحكم، كما يقال. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
للتحقق من ما إذا كان تفعيل EGFR لعبت دوراً في إغلاق الجرح الناجم عن Esc، كانت بريينكوباتيد خلايا الشعب الهوائية لمدة 30 دقيقة مع 5 ميكرومترات من AG1478، مثبط انتقائي ل EGFR، قبل إزالة إدراج. إذ انخفضت النسبة المئوية للمساحة المغطاة بالخلية انخفاضا كبيرا في جميع الفترات الزمنية مقارنة بنتائج تبين عندما الخلايا قد لا pretreated مع الإدارة السابقة الببتيد المانع (الشكل 3)، وهذا يشير إلى أن فعل الببتيد الهجرة الخلية ينطوي على تفعيل EGFR. ومع ذلك، مواصلة الدراسات سوف يلزم لتوضيح الأحداث الجزيئية التي فجرتها Esc-الببتيدات (مثلاً مباشرة EGFR التنشيط أو التنشيط عبر وساطة من ميتالوبروتيسيس، التي أظهرت أن تنشق ترتكز على غشاء EGFR يغاندس 19).
الشكل 3 : تأثير مثبط AG1478 على هجرة الخلايا الظهارية الشعب الهوائية التي يسببها الببتيد. قبل إزالة إدراج، كانت الخلايا المحتضنة مسبقاً مع 5 ميكرومترات AG1478 لمدة 30 دقيقة، وبعد ذلك تعامل مع الببتيد وحدها في تركيز نفسه. كافة البيانات هي الوسيلة من أربع تجارب مستقلة ± ووزارة شؤون المرأة ومأخوذة من لدينا العمل السابق14. مستويات الدلالة الإحصائية للاختبارات بين العينات المجموعة المشار إليها: *ف< 0.05؛ ف< 0.0001. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الهجرة الخلية عملية أساسية في العديد من الأحداث الفسيولوجية والمرضية بما في ذلك التئام الجروح، التطور الجنيني، وسرطان خبيث. ويشمل الإجراء الأساسي لدراسة الخلية الهجرة في المختبر : (ط) إنشاء خلية أحادي الطبقة، (ثانيا) إنتاج الجرح الزائفة في الطبقة المتلاقية للخلايا، يتم التوصل إلى الإغلاق (الثالث) التقاط الصور في فترات زمنية مختلفة حتى الجرح ، و (رابعا) تحليل تسلسل الصور من أجل قياس سرعة الهجرة من الخلايا المختارة.
النتائج التي توصلنا إليها أظهرت أن تطبيق إدراج ثقافة موضوعية وموثوق بها تقنية تجريبية للتقييم الكمي لخصائص الهجرة الخلية. هذا التحليل يمكن أن يؤديها أي فريق البحث مع المعدات المختبرية الأساسية. ومع ذلك، ينبغي النظر بعض الخطوات الحاسمة للبروتوكول تحقيق إمكانية تكرار نتائج. على سبيل المثال، من المهم أن تعرف بالتجارب الرائدة، والعدد الدقيق للخلايا للبذور في كل حجرة من أجل الحصول على القدر نفسه من التقاء في جميع العينات الفردية. لتحقيق هذا الهدف، وجود خلايا مع مرحلة دورة متزامنة وتجنب كتل الخلايا قبل البذر أمر بالغ الأهمية. طريقة ممكنة لتقليل التثاقل ممر لطيف من تعليق خلية عن طريق إبرة محقن. ومع ذلك، زيادة حجم العينات سوف إسهاما كبيرا في تقليل التباين بين الخلايا.
وباﻹضافة إلى ذلك، خلق فجوة بعرض المعالم في جميع العينات أمر حاسم. لهذا الغرض، إدراج سيليكون ينبغي عدم إعادة استخدام أكثر من مرتين. وعلاوة على ذلك، ينبغي تجنب نمو الخلايا تحت الجدار العازل سيليكون. لمنع حدوث هذه المشكلة، وضع الضغط الناعمة على رأس الإدراج، مرة في الطبق لوحة/حسنا، يمكن تطبيقها يدوياً عن طريق ملاقط معقمة لزيادة التصاق الإدراج للبلاستيك. إزالة الحذر من الإدراج ستعوق أيضا توسيع سطح الخلية خالية مع اضطراب أحادي الطبقة الخلية.
حالما يتم فكها الإدراج بشكل صحيح وينتج جرح زائفة تماما، ومع ذلك، يمكن فصل بعض خطوط الخلايا خاصة إذا كانت هي المحتضنة في وسائل الإعلام دون المصل أو المكملات الغذائية مثل الفيتامينات والأحماض الأمينية، وعوامل النمو من سطح البلاستيك،. نظراً لغياب هذه العوامل في متوسط ثقافة خلية يمكن أن تمليها حقيقة أنها يمكن أن تتداخل مع نشاط تعزيز التئام اختبار المركبات. للتحايل على هذه المشكلة، ينصح بشدة اختياراً معقولاً لتكوين الثقافة المتوسطة.
آخر خطوة حاسمة للنظر قبل إعداد هذا الجرح الشفاء الداخلي هو سرعة الهجرة المختلفة التي توجد بين أنواع مختلفة من الخلايا. أيضا تجارب أولية في هذه الحالة، تحتاج إلى جدولة غرض تحديد الفواصل الزمنية الصحيحة التي يكون الصور ليتم القبض على. من الضروري أيضا أن تنظر في أن واحد الحد المقترنة مع هذا الأسلوب هو أن إدراج مثل هذه الثقافة لا يمكن توظيف لدراسة هجرة الخلايا التي تنمو في تعليق (مثلاً، جاء الكريات البيضاء).
على الرغم من فحوصات التئام الجروح التي يؤديها مع ثقافة سيليكون إدراج أكثر تكلفة من مقايسة الصفر الكلاسيكية، ويسمحون باستنساخ بيانات سريعة ودقيقة في نشاط الهجرة الخلية. الأهم من ذلك، بمجرد إنشاء النظام، أنه يمكن استخدام لتوسيع المعرفة بشأن الآلية الجزيئية الكامنة وراء الجرح الشفاء النشاط تحفزها عوامل داخلية أو خارجية. وتحقيقا لهذه الغاية، يمكن تتم المعالجة المسبقة للخلية مونولاييرس مع جزيئات محددة (مثل مثبطات) قبل إنشاء الجرح الزائفة. يرد مثال بالمعالجة المسبقة للخلايا مع (ط) خلية انتشار مانع ميتوميسين ج استكشاف ما إذا كان إغلاق ميدان "الجرحى" الناجمة عن المكاتب الإقليمية للمرأة يتأثر بمعدل انقسام الخلايا20 أو (الثاني) ميتالوبروتيسي مثبطات للتحقق من مساهمة ميتالوبروتيسيس في تنشيط مسار إرسال الإشارات بوساطة EGFR12.
الأهم من ذلك، خلال عملية إغلاق الجرح، عينات قد تكون ثابتة وتعامل مع البقع المناسبة للكشف عن سيتوسكيليتون ونوى (فالويدين و DAPI، على التوالي) لتصور التغييرات في الجانب المورفولوجي للخلايا (مثلاً، تكوين لاميليبوديا في الحافة الأمامية) مجهر فلوري/[كنفوكل]. وعلاوة على ذلك، يمكن معاملة الخلايا مع أمبير المسمى الفلورسنت تصور توزيعها الخلوية (سطح الغشاء أو التعريب داخل الخلايا/إينترانوكلير) في أوقات مختلفة، ومنذ بداية نشاط الخلايا المهاجرة. وعلاوة على ذلك، إدراج هذه يمكن استغلالها لتحليل النشاط شفاء الجرح في الخلايا الظهارية الاستقطاب ومتباينة(مثلاً خلايا الشعب الهوائية الرئيسية الحفاظ على الواجهة الهواء السائل)،بعد وضعها في ترانسويل مناسبة يدعم نفاذية.
وفي الختام، وصف الأسلوب يحتوي على إمكانيات كبيرة لتحسين فهم على الميزات الكثيرة الارتحال لأنواع مختلفة من الأنسجة ملتصقة الحيوان خلايا/الظهارية، فضلا عن التحديد التئام الجرح الأكثر تبشيرا بالنجاح إلى حد كبير دعاة و/أو مثبطات، خلال فترة زمنية قصيرة، ومع درجة عالية من الدقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن
Acknowledgments
هذا العمل كانت مدعومة بتمويل من مؤسسة البحوث التليف الكيسي الإيطالية (مشروع تقصي الحقائق والتوفيق #11/2014 اعتمدته "الوفود تقصي الحقائق والتوفيق" من سيينا، فالتشيافينا سوندريو، سيارا إيل Sorriso دي جيني وبافيا) وجامعة سابينزا في روما. كما أيد جزءا من هذا العمل قبل فيلاس منحة سلطته فيلاس-رو-2014-1020.
ونحن ممتنون للدكتور لوريتا فيريرا (تم U.O.C. Medica، معهد جيانينا جاسليني، جنوا، إيطاليا) لتوفير الخلايا الظهارية الشعب الهوائية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum essential medium (MEM) | Euroclone | ECB2071L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Glutamine | Euroclone | ECB3000D | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0180DH | |
| Penicillin and Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Trypsin/EDTA 1X in PBS | Euroclone | ECB3052D | Warm at room temperature before use |
| DPBS without calcium and magnesium (CMF-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| DPBS with calcium and magnesium (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Ibidi Culture-Insert 2 well | Ibidi | 80209 | |
| Wimasis Image Analysis | Ibidi | 30002 | |
| PRISM software | GraphPad | version 6.0 |
References
- Enyedi, B., Niethammer, P. Mechanisms of epithelial wound detection. Trends Cell Biol. 25, 398-407 (2015).
- Kujath, P., Kujath, C. Complicated skin, skin structure and soft tissue infections - are we threatened by multi-resistant pathogens? Eur J Med Res. 15, 544-553 (2010).
- Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulm Pharmacol Ther. 21, 595-599 (2008).
- Chiappini, E., Taccetti, G., de Martino, M. Bacterial lung infections in cystic fibrosis patients: an update. Pediatr Infect Dis J. 33, 653-654 (2014).
- Mangoni, M. L., McDermott, A. M., Zasloff, M. Antimicrobial peptides and wound healing: biological and therapeutic considerations. Exp Dermatol. 25, 167-173 (2016).
- Lau, K., Paus, R., Tiede, S., Day, P., Bayat, A. Exploring the role of stem cells in cutaneous wound healing. Exp Dermatol. 18, 921-933 (2009).
- Hu, M. S., et al. Tissue engineering and regenerative repair in wound healing. Ann Biomed Eng. 42, 1494-1507 (2014).
- Ramot, Y., et al. The role of PPARgamma-mediated signalling in skin biology and pathology: new targets and opportunities for clinical dermatology. Exp Dermatol. 24, 245-251 (2015).
- Lai, Y., Gallo, R. L. AMPed up immunity: how antimicrobial peptides have multiple roles in immune defense. Trends Immunol. 30, 131-141 (2009).
- Zasloff, M.
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3, 107-124 (2011).
- Di Grazia, A., et al. The frog skin-derived antimicrobial peptide esculentin-1a(1-21)NH2 promotes the migration of human HaCaT keratinocytes in an EGF receptor-dependent manner: a novel promoter of human skin wound healing? PLoS One. 10, e0128663 (2015).
- Di Grazia, A., et al. D-Amino acids incorporation in the frog skin-derived peptide esculentin-1a(1-21)NH2 is beneficial for its multiple functions. Amino Acids. 47, 2505-2519 (2015).
- Cappiello, F., et al. Esculentin-1a-derived peptides promote clearance of Pseudomonas aeruginosa internalized in bronchial cells of cystic fibrosis patients and lung cell migration: biochemical properties and a plausible mode of action. Antimicrob Agents Chemother. 60, 7252-7262 (2016).
- Bebok, Z., et al. Failure of cAMP agonists to activate rescued deltaF508 CFTR in CFBE41o- airway epithelial monolayers. J Physiol. 569, 601-615 (2005).
- Trinh, N. T., et al. Improvement of defective cystic fibrosis airway epithelial wound repair after CFTR rescue. Eur Respir J. 40, 1390-1400 (2012).
- Gan, H. K., et al. The epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitor AG1478 increases the formation of inactive untethered EGFR dimers. Implications for combination therapy with monoclonal antibody 806. J Biol Chem. 282, 2840-2850 (2007).
- Tokumaru, S., et al. Induction of keratinocyte migration via transactivation of the epidermal growth factor receptor by the antimicrobial peptide LL-37. J Immunol. 175, 4662-4668 (2005).
- Tjabringa, G. S., et al. The antimicrobial peptide LL-37 activates innate immunity at the airway epithelial surface by transactivation of the epidermal growth factor receptor. J Immunol. 171, 6690-6696 (2003).
- Di Grazia, A., Luca, V., Segev-Zarko, L. A., Shai, Y., Mangoni, M. L. Temporins A and B stimulate migration of HaCaT keratinocytes and kill intracellular Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 58, 2520-2527 (2014).
