Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar o efeito dos peptídeos na migração das células epiteliais brônquicas. Este método permite a obtenção rápida e altamente reprodutível de dados quantitativos sobre a velocidade de fechamento de migração e ferida de célula.
Abstract
O objetivo deste trabalho é apresentar um novo método para avaliar a capacidade de algumas moléculas de imunomoduladores, como peptídeos antimicrobianos (AMPs), para estimular a migração celular. Importante, migração celular é um evento limitante durante o processo de cicatrização de feridas para re-estabelecer a integridade e a função normal das camadas de tecido após a lesão. A vantagem deste método sobre o ensaio clássico, que é baseado em um arranhão feito manualmente em uma monocamada de células, é que o uso da cultura de silicone especial insere fornecendo dois compartimentos para criar um campo de pseudo ferido sem célula com uma largura bem definida (500 μm ). Além disso, devido a uma plataforma de análise automatizada de imagem, é possível obter rapidamente dados quantitativos sobre a velocidade da migração de encerramento e célula de ferida. Mais precisamente, será mostrado o efeito de duas ampolas de pele de sapo sobre a migração de células epiteliais brônquicas. Além disso, tratamento prévio destas células com inibidores específicos irá fornecer informações sobre os mecanismos moleculares subjacentes a tais eventos.
Introduction
Isso é amplamente conhecido que a cicatrização de feridas em animais é um processo fundamental para restabelecer a integridade e a função normal das camadas de tecido após lesão1. Apesar de superfícies epithelial expostas ao ambiente externo (por exemplo, a pele, respiratória e trato gastrointestinal) formam uma barreira protetora de insultos físicos e químicos, a formação de feridas pode ocorrer facilmente, especialmente depois cirurgia ou infecções microbianas2. Como exemplo, a colonização do tecido pulmonar pelo patógeno oportunista bacteriano Pseudomonas aeruginosa, especialmente em pessoas com fibrose cística (CF), leva a dano do epitélio de vias aéreas, com consequente insuficiência respiratória3, 4. Cicatrização de feridas é um mecanismo de reparação do complexo hospedeiro para restaurar a arquitetura normal de um tecido lesado5. É caracterizada por inflamação inicial, seguida de um período de regeneração, englobando epitelização, angiogênese e remodela o tecido com a produção de colágeno e células diferenciação6,7,8 . Para garantir a integridade epitelial e para controlar a proliferação microbiana, todos os organismos vivos produzem moléculas de defesa, incluindo peptídeos antimicrobianos (AMPs)9,10. A processo de cicatrização de feridas é muito difícil simular em vitro devido à falta de restos celulares e interações complexas entre diferentes tipos de células. No entanto, a em vitro capacidade de um peptídeo para acelerar o encerramento de uma pseudo ferida, estimulando a migração de células epiteliais é indicativa de sua capacidade de curar um epitélio comprometido. Com efeito, migração celular é um evento limitante na cicatrização de feridas, e estudar os fatores que podem afetar a migração celular ajudará a terapias de alvo para melhor cicatrização.
Aqui, um ensaio experimental altamente reprodutível é fornecido com base em inserções de cultura do silicone especiais para avaliar a migração de células in vitro. É baseado na criação de um 500 μm gap (pseudo ferida) em uma monocamada confluente célula. As células na borda do campo "ferido" artificial começará migrando para a área livre de células, formando novos contatos do celular. A inserção da cultura representa uma nova ferramenta para rápida ferida experiências de cura. São fornecidos dois reservatórios separados por uma parede de 500 μm, e podem ser devidamente colocados em um prato prato 3 cm ou no bem de uma placa de 12. Cada compartimento da inserção de enchimento com uma suspensão de células permite que as células a crescer em cada área designada até confluência, enquanto a remoção da inserção criará uma abertura limpa livre de célula de aproximadamente 500 μm (a mesma largura que o muro de separação). Um meio de cultura celular adequada complementado com um composto de teste pode ser adicionado no prato prato/bem. Depois, o fechamento de espaço pode ser visualizado em intervalos de tempo diferentes sob um microscópio invertido, de preferência um equipado com uma câmera de vídeo para aquisição de imagens. Finalmente, medição de mudanças na área celular coberto pelo programa de análise de imagem automatizado baseado na web irá permitir a quantificação da velocidade da migração de encerramento e célula de ferida. Em geral, esse método é um passo em frente no que diz respeito o ensaio clássico, onde um arranhão é feito manualmente por incisão duas monocamadas de células confluente com uma agulha estéril ou uma pipeta dica11. Com efeito, o último procedimento pode destruir o fundo plástico do prato prato/poço e o revestimento de superfície, criando rugas. Além disso, a área de "ferida" não tem uma largura bem definida ao longo de todo o comprimento do gap, como altamente depende da pressão aplicada por pesquisadores a ponta da agulha. Além disso, as células soltas podem formar aglomerados de células vivas e mortas nas bordas da risque; Além disso, a disseminação de células vivas para a área de "ferida" pode interferir com a velocidade de migração celular, gerando resultados não reproduzíveis12.
Além disso, graças a uma plataforma de análise de risco de imagem, os usuários podem rapidamente receber (em minutos) dados quantitativos sobre o comportamento migratório das células selecionadas sem a necessidade de aquisição de software adicional. Esta plataforma é capaz de analisar imagens de microscopia de contraste de fase de baixa (~ 5. X), médio (~ 10 X) e ampliação de alta (~ 20 X). Após o upload de um arquivo zip de imagens (em *. jpg, *. jpeg, *.jp2, *. png, *. gif, formato *.tiff) a análise é automaticamente realizada para gerar um arquivo de resumo que mostra a porcentagem de áreas cobertas de célula e de áreas de risco, bem como a velocidade da célula migração, em intervalos de tempo distintos.
Neste trabalho, por meio de um AMP-derivado de pele de sapo, ou seja, Esc(1-21) e seu Diastereoisômero Esc(1-21) - 1 c13e uma linhagem de células brônquicas expressando o funcional CF condutância transmembrana regulador (CFTR)14,15, é fornecido um exemplo de migração celular induzida por peptídeo em comparação com amostras não tratadas (controle). Observe que o epitélio das vias respiratórias e CFTR desempenham um papel crucial na manutenção da função pulmonar e ferida reparo16. Além disso, por meio de inibidores seletivos (por exemplo, AG1478)17 do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), provas de que a migração de células brônquicas induzidas pelos peptídeos acima mencionados envolve ativação do EGFR12, 18 é relatado.
Em resumo, o objetivo deste procedimento é mostrar como o uso de tais inserções de cultura do silicone representa um ensaio rápido e facilmente acessível para determinar com precisão a migração de células aderentes (por exemplo, células epiteliais brônquicas) e o molecular mecanismos de controle de tais eventos.
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Protocol
1. preparação da pilha
- Sementes 2.5x106 células em 10 mL de mínimo essencial médio (MEM) suplementada com glutamina 2mm (MEMg), e mais 10% de soro fetal bovino (FBS), antibióticos (0,1 mg/mL de penicilina e estreptomicina) e puromicina (0,5 µ g/mL para a seleção e manutenção da linha de células) em um balão de T75. Incube o frasco a 37 ° C e 5% de CO2 por 2 dias. Antes de iniciar o experimento, verificar a confluência das células sob um microscópio invertido.
Nota: As células utilizadas para o experimento são imortalizadas brônquicas epiteliais células humanas transfectadas com um vetor de Lentivirus confere resistência à puromicina. Eles expressam estàvel CFTR funcional14,15. - Uma vez que alcançou a confluência das células 90-100%, Aspire o meio do recipiente e descartá-lo em um frasco de resíduos sob uma classe do gabinete de segurança biológica II. Lavam-se as células com 6 mL de tampão fosfato salina sem cálcio e magnésio (CMF-PBS). Suavemente agitar o frasco manualmente e descartar CMF-PBS.
Nota: Tenha cuidado para não tocar a monocamada de células com a pipeta. - Adicionar 10 mL de PBS-CMF e incubar o frasco a 37 ° C e 5% CO2 por 10 min.
- Aspire CMF-PBS e descartá-lo. Em seguida, adicione 2 mL de tripsina/EDTA para o balão.
- Suavemente agitar o frasco, permitindo que a solução completamente revestir as células, e incubar o frasco a 37 ° C e 5% CO2 por 10 min até que as células são visivelmente destacadas sob um microscópio.
Nota: No final do tempo de incubação, as células devem aparecer arredondados e não anexado à superfície plástica. Se as células não são bem destacadas, agitação manual pode ser necessária. - Adicionar 10 mL de MEMg acrescido de 10% FBS para inactivar a tripsina e coletar as células lavando o fundo do frasco. Transferi o volume para um tubo cónico de 50 mL.
- Centrifugar o tubo por 5 min a 80 x g.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 6 mL de MEMg acrescido de 10% FBS. Pipeta repetidamente para quebrar qualquer touceiras.
- Pegue 10 µ l de suspensão de células com uma micropipeta e injetar o volume sob o vidro de cobertura anteriormente colocar uma câmara Burker ou Neubauer.
- Conte o número de celular.
2. célula semeando a cultura insere
- Em cada poço de uma placa de 12, transferi a inserção de cultura com pinça estéril (Figura 1). Use uma pinça para pressionar ao longo das bordas de inserções para corrigi-los para a superfície da placa.
Nota: As inserções tem um pegajoso inferior que permite a adesão.
Figura 1 : Representação esquemática das pastilhas cultura do silicone, colocar corretamente em poços de uma placa de 12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Corretamente, diluir a suspensão de eritrócitos em MEMg acrescido de 10% FBS. Encha cada compartimento da inserção com 70 µ l de suspensão de células (sobre 3.5x104 células/câmara).
Nota: A densidade de células aplicado em cada compartimento depende do tipo de células. Recomenda-se usar uma densidade de células que leva à completa confluência dentro de 24 h. - Sob o microscópio, verificar que as células não estão vazando dos compartimentos de inserção e incubam a placa de 12 para 24 h a 37 ° C e 5% de CO2.
3. pseudo-ferido cura ensaio
- Após a incubação, visualize as células ao microscópio invertido para verificar que monocamadas confluente célula tem sido formadas.
- Re-suspenda os compostos de teste (por exemplo, ampères) em 1 mL de MEMg.
Nota: Preparar diluições de amplificadores frescas a partir da solução estoque armazenada a-20 ° C. - Retire com cuidado as inserções por uma pinça estéril. Tenha cuidado para não quebrar as monocamadas de células. Transferi as inserções em papel absorvente.
Nota: Para re-usar as mesmas inserções, esterilizá-los em etanol a 70% pelo menos 3 h. Recomenda-se jogá-los fora depois. - Para remover as células não-aderentes, adicione 1 mL de MEMg por bem utilizando uma micropipeta. Feche a placa e balance-a cuidadosamente.
Nota: Não adicione médio diretamente em cima de monocamadas de células para evitar a sua ruptura. - Aspire o meio e substituí-lo com 1 mL de MEMg por bem. Feche a placa e visualizar as lacunas sem célula (criadas pelas inserções) sob o microscópio invertido na ampliação de 4x, equipado com uma câmera de vídeo. Adquirir imagens no tempo zero (T0) e salvá-los em um formato. jpg.
- Remover o meio de poços, lave-os com 1 mL de PBS e descartá-lo.
- Adicione os compostos de teste (preparados no ponto 3.2) nos poços. Para amostras de controle não tratados, adicione 1 mL de MEMg. Incube a placa a 37 ° C e 5% de CO2.
- Depois de 15, 20 e 24 h de tratamento, observar a migração de células sob o microscópio com ampliação de 4x e adquirir imagens.
Nota: Durante esta etapa, tente capturar imagens nas mesmas áreas quanto a T0. A escolha dos intervalos de tempo em que as imagens são capturadas depende da velocidade de migração celular. - Para estudar o efeito de alguns inibidores seletivos, ou seja, AG1478, na migração celular, Aspire o meio de cada compartimento de inserção antes de remover as pastilhas.
- Lavar cada compartimento com MEMg fresco e preenchê-lo com 70 µ l de MEMg suplementado com AG1478.
- Após 30 min. de incubação a 37 ° C e 5% de CO2, proceda como descrito do ponto 3.3.
Nota: Durante a etapa de lavagem e tratamento prévio de monocamadas de células com os inibidores específicos, tenha cuidado para não remover as inserções.
4. análise de imagens
- Após a conclusão do experimento, selecionar imagens das amostras mais representativas dos diversos grupos experimentais e criar um arquivo zip contendo imagens isoladas a h T0, T15, T20 e T24.
Nota: Imagens isoladas são tomadas a intervalos de tempo selecionado para todas as amostras. Execute triplica para cada experimento, o que é repetido pelo menos três vezes. No final, para grupos todos experimentais, um mínimo de 3 imagens ("a", "b", "c", etc, derivando de cada experimento independente) em cada ponto de tempo são analisados. - Fazer o upload do arquivo zip para o software de análise de imagem que fornece automaticamente, por e-mail, um arquivo de planilha Resumo contendo os dados experimentais das áreas cobertas de célula e zero (em percentagem) nos pontos de tempo selecionado.
Nota: O reconhecimento da borda principal e a área de abertura é amplamente baseado no método de deteção de borda (visto identificar pontos em que o brilho da imagem muda bruscamente). - Salvar os dados e coletá-los. Normalize todos os dados em relação ao valor médio no tempo zero. Calcule o valor médio dos dados normalizados de todas as repetições em cada ponto do tempo e o desvio-padrão relativo (SEM). Por meio de duas vias de análise de variância (ANOVA), realiza análise estatística com um software de estatística adequada. Diferenças entre grupos tratados com peptídeo e grupos de controle em intervalos de tempo diferentes são consideradas estatisticamente significativa para um p< 0,05.
- Plotar os dados obtidos em um gráfico como um histograma, que mostra a porcentagem de área coberta por célula de toda amostra grupos contra os intervalos de tempo selecionado.
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Representative Results
Este protocolo foi utilizado para determinar a efeito de Esc(1-21) e Esc(1-21) - 1 c em termos de actividade de migração celular induzida em células epiteliais brônquicas expressando a CFTR funcional de cicatrização de feridas. Neste ensaio, inserções de cultura foram colocadas em poços de uma placa de 12, e cada compartimento foi inoculado com 35.000 células em MEMg suplementado com 10% FBS. As células atingiu completa confluência dentro de 24 h. depois, uma lacuna de 500 μm foi gerada, e cada um poço foi enchido com MEMg contendo o peptídeo em diferentes concentrações. O experimento foi repetido quatro vezes. Conforme indicado na Figura 2, o fechamento quase completo do campo pseudo ferido produzido em monocamada a célula foi induzido pelos dois peptídeos dentro de ~ 20 h, em concentrações ideais de 1 μM e 10 μM para c Esc(1-21) - 1 e Esc(1-21), respectivamente. Isso indica que o Esc(1-21) - 1 c é mais eficiente em promover a re-epitelização de uma pseudo ferida em células brônquicas.
Figura 2 : Efeito de esculentin-1a derivada AMPs sobre o encerramento de uma ferida de pseudo criado em uma monocamada de células epiteliais brônquicas. As células foram semeadas em cada compartimento da inserção da cultura do silicone e, após sua remoção, as células foram fotografadas para a evidência da migração celular, 15, 20 e 24 h após a adição de peptídeos. A porcentagem de área coberta por célula em cada ponto foi calculado em comparação com as células não tratadas controle (Ctrl) e é relatada no eixo y. Todos os dados são os meios de quatro experimentos independentes ± SEM e são tomados a partir de um anterior estudo14. Os níveis de significância estatística para testes entre controle e amostras tratadas são: *p< 0.05, * *p< 0,01, * * *p< 0,001, e * * *p< 0,0001. Micrografias mostrando resultados representativos antes (T0) e 20 h após o tratamento das células com cada peptídeo na concentração de 1 μM, em comparação com o controle, também são relatadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Para verificar se a ativação do EGFR desempenhou um papel no fechamento induzida por Esc ferida, células brônquicas foram pré-incubada por 30 min com 5 μM de AG1478, um inibidor seletivo de EGFR, antes da remoção de inserção. Desde que a percentagem de área coberta por célula foi significativamente reduzida em todos os intervalos de tempo em comparação com os resultados encontrados quando as células não foram pré-tratados com administração prévia de peptídeo inibidor (Figura 3), isto aponta que induzida por peptídeo migração celular envolve a ativação do EGFR. No entanto, mais estudos serão necessários para esclarecer os eventos moleculares acionados pelos Esc-peptídeos (por exemplo, direto da ativação do EGFR ou trans-ativação mediada por metaloproteases, que foram mostrados para clivar ligantes EGFR ancorado a membrana 19).
Figura 3 : Efeito do inibidor de AG1478 de migração de células epiteliais brônquicas induzida por peptídeo. Antes da inserção, remoção, as células foram pré-incubado com 5 μM AG1478 por 30 min e, posteriormente, tratados com o peptídeo sozinho na mesma concentração. Todos os dados são os meios de quatro experimentos independentes ± SEM e são tirados do nosso anterior trabalho14. Os níveis de significância estatística para testes entre as amostras do grupo indicado são: *p< 0,05; p< 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Migração celular é um processo essencial em muitos eventos fisiológicos e patológicos, incluindo a cicatrização de feridas, desenvolvimento embrionário e metástases. O procedimento básico para estudar célula migração em vitro envolve: (i) a criação de uma monocamada de células, (ii) a produção de uma pseudo ferida na camada confluente das células, (iii) a captura de imagens em intervalos de tempo diferentes até ferida encerramento é alcançado. e (iv) a análise da sequência de imagem de forma a quantificar a velocidade de migração das células escolhidas.
Nossos resultados mostraram que a aplicação de pastilhas de cultura é objectiva e fiável técnica experimental para avaliação quantitativa das características de migração celular. Este ensaio pode ser realizado por qualquer grupo de pesquisa com equipamentos básicos de laboratório. No entanto, alguns passos críticos do protocolo devem ser considerados para alcançar a reprodutibilidade. Por exemplo, é importante definir, por experiências piloto, o número exato de células a semente em cada compartimento a fim de obter a mesma extensão de confluência em todas as amostras individuais. Para este objectivo, tendo as células com uma fase de ciclo sincronizado e evitando aglomerações de células antes da semeadura é fundamental. Uma forma possível para minimizar a aglutinação é uma passagem suave da suspensão de células através de uma agulha de seringa. No entanto, aumentar o tamanho de amostras significativamente contribuirá para diminuir a variabilidade entre as células.
Além disso, a criação de um fosso com largura bem definida em todas as amostras é crucial. Para este efeito, as inserções do silicone não devem ser re-usadas mais de duas vezes. Além disso, o crescimento das células sob a parede de separação do silicone deve ser evitado. Para prevenir este problema, pressão suave sobre a inserção, uma vez colocado no prato prato/bem, pode ser aplicado manualmente por meio de uma pinça estéril para aumentar a aderência da inserção no plástico. Remoção cuidadosa da inserção da também irá dificultar o alargamento da superfície livre de células com interrupção de monocamada a célula.
No entanto, uma vez que a inserção corretamente é desalojada e uma pseudo ferida é perfeitamente produzida, algumas linhas de célula podem desanexar da superfície de plástico, especialmente se eles são incubados em meios sem soro ou suplementos como vitaminas, aminoácidos e fatores de crescimento. A ausência desses fatores em um meio de cultura celular pode ser ditada pelo fato de que eles podem interferir com a atividade de promoção-cicatrização de compostos de teste. Para contornar este problema, a escolha racional da composição do meio de cultura é altamente recomendada.
Outro passo crítico a considerar antes de configurar este processo de cicatrização de feridas é a velocidade de migração diferente que existe entre diferentes tipos de células. Também neste caso, experimentos preliminares precisam ser agendada com o objetivo de determinar os intervalos de tempo correto em que imagens têm de ser capturado. Também é necessário considerar que uma limitação associada com este método é que tais inserções de cultura não podem ser empregadas para estudar a migração de células que crescem em suspensão (por exemplo, os leucócitos polimorfonucleares).
Apesar da cicatrização da ferida ensaios realizados com a cultura do silicone inserções são mais caras que o clássico ensaio de zero, eles permitem uma reprodução rápida e precisa dos dados sobre a atividade de migração celular. Importante, uma vez que o sistema de afinação, ele pode ser usado para expandir o conhecimento sobre o mecanismo molecular subjacente a atividade estimulada por fatores endógenos ou exógenos de cicatrização de feridas. Para este fim, pré-tratamento de monocamadas de células com moléculas específicas (por exemplo, inibidores) pode efectuar antes de criar a pseudo ferida. Um exemplo é dado pelo pré-tratamento de células com (i) a mitomicina bloqueador proliferação celular C para investigar se o encerramento do campo "ferido" induzido por amplificadores é influenciado pela divisão celular taxa20 ou (ii) metalloprotease inibidores para verificar a contribuição de metaloproteases na ativação do EGFR mediada por sinalização via12.
Importante, durante o processo de fechamento da ferida, amostras e podem ser tratadas com manchas apropriadas para a deteção de citoesqueleto e núcleos (faloidina e DAPI, respectivamente) para visualizar as alterações no aspecto morfológico das células (por exemplo, o formação de lamellipodia na borda frontal) pela microscopia confocal/fluorescente. Além disso, tratamento das células com um AMP fluorescente-etiquetadas pode permitir a visualização da sua distribuição de celular (superfície de membrana ou localização intracelular/intranuclear) em momentos diferentes, desde o início da atividade celular migratórias. Além disso, estas pastilhas podem ser exploradas para analisar a atividade de cura ferida nas células epiteliais polarizadas e diferenciadas (por exemplo, células brônquicas primárias mantidas na interface ar-líquido), depois de ter colocado eles na transwell apropriado suporta permeável.
Em conclusão, o método descrito tem potencial substancial para melhorar significativamente a compreensão sobre as características migratórias de diferentes tipos de tecidos aderentes animal células/epiteliais, bem como sobre a seleção do mais promissor-cicatrização de feridas promotores e/ou inibidores, dentro de pouco tempo e com alta precisão.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por fundos da Universidade Sapienza de Roma e da Fundação de pesquisa de fibrose cística italiano (projeto FFC #11/2014 adoptada pelo FFC delegações de Pavia, Sondrio Valchiavenna, Cerea Il Sorriso di Jenny e Siena). Parte deste trabalho também foi apoiado por FILAS Grant Prot. FILAS-RU-2014-1020.
Nós estamos gratos ao Dr. Loretta Ferrera (U.O.C. Genetica Medica, Istituto Giannina Gaslini, Genova, Itália) para fornecer as células epiteliais brônquicas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum essential medium (MEM) | Euroclone | ECB2071L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Glutamine | Euroclone | ECB3000D | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0180DH | |
| Penicillin and Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Trypsin/EDTA 1X in PBS | Euroclone | ECB3052D | Warm at room temperature before use |
| DPBS without calcium and magnesium (CMF-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| DPBS with calcium and magnesium (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Ibidi Culture-Insert 2 well | Ibidi | 80209 | |
| Wimasis Image Analysis | Ibidi | 30002 | |
| PRISM software | GraphPad | version 6.0 |
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