Summary
여기, 선물이 기관지 상피 세포의 마이그레이션에 펩 티 드의 효과 평가 하는 프로토콜. 이 메서드는 셀 마이그레이션 및 상처 폐쇄의 속도에 양적 데이터의 신속 하 고 재현성 높은 획득에 대 한 수 있습니다.
Abstract
이 작품의 목표는 일부 immunomodulatory 분자, 항균 성 펩 티 드 (암페어) 셀 마이그레이션 자극 등의 능력을 평가 하는 새로운 방법을 보여줍니다. 중요 한 것은, 셀 마이그레이션은 속도 제한 이벤트를 조직 계층의 일반 기능과 무결성 손상 후 상처 치유 과정. 셀 단층에서 수동으로 만든된 스크래치에 기반은, 고전적인 분석 결과,이 방법의 장점은 특별 한 실리콘 문화의 사용 삽입 필드를 만드는 한 셀-무료 의사 상처 잘 정의 된 폭 (500 μ m 2 개의 구획을 제공 하는 ). 또한, 자동된 이미지 분석 플랫폼으로 그것은 빠르게 상처 폐쇄 및 세포 이동의 속도에 양적 데이터를 얻을 수 있습니다. 더 정확 하 게, 기관지 상피 세포의 마이그레이션에 두 개구리 피부 앰프의 효과가 표시 됩니다. 또한, 특정 억제제와 이러한 셀의 전처리 등 기본 분자 메커니즘에 정보를 제공 합니다.
Introduction
동물에서 상처 치유 하는 것이 부상1무결성 및 조직 층의 정상 기능을 다시 설정 하는 기본 프로세스는 크게 알려져 있습니다. 물리적, 화학적 모욕에서 보호 장벽을 형성 상피 표면 외부 환경 (예를 들어, 호흡기, 피부 및 위장 책자)에 노출에 불구 하 고, 상처의 형성 수 있습니다 쉽게 발생 하는, 특히 후 수술 또는 미생물 감염2. 예를 들어, 기회 주의 세균성 병원 체 녹 농 균, 특히 낭 성 섬유 증 (CF) 환자에에서 의해 폐 조직의 식민 이끌어 낸다 필연적인 호흡3, 기도 상피 세포의 손상 4. 상처 치유 부상된 조직5의 정상적인 구조를 복원 하는 복잡 한 호스트 복구 메커니즘입니다. 그것은 초기 염증, 포괄 epithelialization, 신생, 콜라겐 생산 및 세포 분화6,7,8 개장 하는 조직 재생 기간 다음에 의해 특징 . 상피의 무결성을 보장 하 고 미생물 증식 제어 모든 살아있는 유기 체 방어 분자, 항균 성 펩 티 드 (암페어)9,10를 포함 하 여 생산. 상처 치유 과정은 체 외에서 세포 파편 및 다른 세포 유형 사이 복잡 한 상호 작용의 부족으로 인해 시뮬레이션 하기 매우 어렵습니다. 그러나, 생체 외에서 의 능력 펩 티 드를 자극 하 여 의사는 상처의 폐쇄를 가속 상피 세포의 손상 된 상피 세포를 치유 하는 능력의 지표입니다. 실제로, 셀 마이그레이션 상처 치유, 속도 제한 이벤트 이며 향상 된 상처 치유에 대 한 대상 치료에 도움이 될 것입니다 공부 셀 마이그레이션에 영향을 미칠 수 있는 요인.
여기, 높은 재현성 실험 분석 결과 셀 마이그레이션 시험관을 평가 하기 위해 특수 실리콘 문화 삽입에 따라 제공 됩니다. 그것은 500 μ m 간격 (의사 상처)에 confluent 셀 단층의 생성을 기반으로 합니다. 인공 "상처" 필드의 가장자리에 셀 셀 없는 지역으로 이주, 새로운 셀 연락처 형성 시작 됩니다. 문화 삽입 빠른 상처 치유 실험을 위한 새로운 도구를 나타냅니다. 500 μ m 벽으로 구분 된 두 개의 저수지 제공 됩니다, 그리고 그들이 배치 될 수 있습니다 제대로 3 cm 접시 접시 또는 12-잘 접시의 우물에서. 세포 현 탁 액으로 삽입의 각 구획을 작성 하면서 삽입의 제거 (분리 벽으로 동일한 폭) 약 500 μ m의 깨끗 한 셀 프리 갭 생기게 됩니다 합류까지 각 지정 된 지역에서 성장 하는 셀 수 있습니다. 보충 시험 화합물과 적절 한 세포 배양 접시에 다음 추가할 수 접시/잘. 나중에, 간격 폐쇄는 거꾸로 한 현미경, 이미지 수집에 대 한 비디오 카메라를 갖춘 선호 하나에서 다른 시간 간격 구상 될 수 있다. 마지막으로, 웹 기반 자동화 이미지 분석 프로그램에 의해 셀 적용 지역에 있는 변화의 측정 상처 폐쇄 및 세포 이동의 속도의 정량화를 허용할 것 이다. 전반적으로,이 방법은 고아 한 분석 결과, 스크래치를 무 균 바늘 confluent 셀 monolayers incising에 의해 수동으로 이루어집니다 또는 한 피 펫 팁11에 관하여 앞으로 단계입니다. 실제로, 마지막 절차 접시의 플라스틱 바닥을 파괴할 수 있는 플레이트/잘 하 고 주름을 만드는 표면 코팅. 또한, "상처" 지역은 없습니다, 간격의 전체 길이 따라 잘 정의 된 폭이 매우 바늘/팁에 연구원에 의해 적용 된 압력에 따라 달라 집니다. 또한, 빠질된 셀 스크래치;의 가장자리에서 생존 및 죽은 세포의 덩어리를 형성할 수 있다 또한, "상처" 영역으로 살아있는 세포의 확산 방해할 수 있습니다 세포 이동, 재현할 수 없는 결과12생성의 속도.
또한, 스크래치 이미지 분석 플랫폼 덕분에 사용자 빠르게 받을 수 (분) 이내 추가 소프트웨어를 습득의 필요성 없이 선택한 셀의 철새 행동에 양적 데이터. 이 플랫폼은 낮은 (~ 5 배)의 위상 대비 현미경 이미지, 중간 (~ 10 배), 및 높은 (~ 20 X) 확대 분석 가능 하다. Zip 파일 (*.jpg, *.jpeg, *.jp2, *.png, *.gif, *.tiff 형식)에서 이미지의 업로드 후 분석 자동으로 실시 셀 적용 지역 및 스크래치 영역 비율 뿐만 아니라 셀의 속도 보여 주는 요약 파일을 생성 하려면 마이그레이션, 고유 시간 간격입니다.
개구리 피부 앰프-파생, 즉 Esc(1-21) 및 그것의 diastereomer Esc(1-21)-1 c13및 표현 기능 CF 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 (CFTR)14,15, 기관지 세포 라인을 사용 하 여이 작품에 치료 (제어) 샘플에 비해 펩타이드-유도 된 세포 이동의 예로 제공 됩니다. 기도 상피 세포 및 CFTR 폐 기능을 유지 하는 중요 한 역할을 재생 및 수리16상처. 또한, 표 피 성장 인자 수용 체 (EGFR), 상기 펩 티 드에 의해 유도 된 기관지 세포의 마이그레이션 EGFR12의 활성화를 포함 하는 증거의 선택적 억제제 (예, AG1478)17 에 의하여 18 보고 됩니다.
요약 하자면,이 절차의 목표는 어떻게 이러한 실리콘 문화 삽입 사용 정확 하 게 부착 세포 (예를 들어, 기관지 상피 세포)와 분자의 결정을 신속 하 고 쉽게 접근할 수 있는 분석 결과 나타냅니다 표시 이러한 이벤트를 제어 하는 메커니즘.
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Protocol
1. 세포 준비
- 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 항생제 (0.1 mg/mL 페니실린과 스의), 그리고 puromycin 플러스 2.5x106 셀 10 mL의 최소 필수 매체 (MEM) 2mm 글루타민 (MEMg), 보충에 씨앗 (0.5 µ g/l로 선택 및 유지 보수는 셀 라인) T75 플라스 크에. 2 일 동안 37 ° C, 5% CO2 플라스 크를 품 어. 시작 하기 전에 실험, 거꾸로 현미경 세포의 합류를 확인 하십시오.
참고: 실험을 위해 사용 하는 셀 불멸 하 게 인간의 기관지 상피 세포 lentiviral 벡터 puromycin 저항을 부여로 불리고 있습니다. 그들은 안정적으로 기능적인 CFTR14,15를 표현 한다. - 세포의 합류에는 90-100%에 도달 했습니다, 일단 플라스 크에서 매체를 발음 하 고 생물 안전 캐비닛 클래스 II에서 폐 병으로 그것을 폐기. 6 mL의 인산 염 버퍼와 셀 씻어 염 분 칼슘 및 마그네슘 (CMF-PBS) 없이. 부드럽게 플라스 크를 수동으로 바위와 CMF PBS를 삭제.
참고:을 피펫으로와 셀 단층을 건드리지 않도록 주의 해야 합니다. - CMF PBS의 10 mL을 추가 하 고 10 분 동안 37 ° C, 5% CO2 플라스 크를 품 어.
- CMF PBS를 발음 하 고 그것을 폐기. 플라스 크에 트립 신/EDTA의 2 개 mL를 추가 합니다.
- 부드럽게 바위 플라스 크, 셀, 코트 고 셀은 가시 현미경으로 분리 될 때까지 10 분 동안 37 ° C, 5% CO2 플라스 크를 품 어 완전히 솔루션을 허용.
참고: 보육 시간의 끝에, 셀 둥근 및 플라스틱 표면에 얽매이지 않는 표시 됩니다. 셀 잘 분리 된 경우, 수동 동요 필요할 수 있습니다. - MEMg 플러스 10%의 10 mL을 추가 FBS 트립 신을 비활성화 하 고 플라스 크의 하단을 세척 하 여 세포를 수집. 원뿔 50 mL 튜브에 볼륨을 전송.
- 80 x g에 5 분 동안 튜브 원심
- 상쾌한 발음 하 고 다시 6 ml MEMg 플러스 10%의 세포를 중단 FBS. 반복적으로 어떤 덩어리 헤어 플라스틱.
- 10 µ L는 micropipette와 셀 서 스 펜 션의 밖으로가 고 이전 Burker 또는 Neubauer 챔버에 넣어 커버 유리 아래 볼륨을 주입.
- 휴대폰 번호를 계산 합니다.
2. 세포는 문화에서 시드 삽입
- 에 12-잘 접시의 각 잘 멸 균 핀셋 (그림 1)으로 문화 삽입 전송. 핀셋을 사용 하 여 격판덮개의 표면에 그들을 해결 하기 위해 삽입 가장자리를 따라 누릅니다.
참고: 삽입 스티커 밑면 접착 수 있다.
그림 1 : 12-잘 접시의 우물에 넣어 제대로 실리콘 문화 삽입의 도식 대표. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
- 제대로 MEMg 플러스 10%에 세포 현 탁 액을 희석 FBS. (약 실/3.5x104 셀) 셀 서 스 펜 션의 70 µ L로 삽입의 각 구획을 채우십시오.
참고: 각 구획에 적용 하는 셀의 밀도 세포의 종류에 따라 다릅니다. 합류 24 시간 이내 완료 리드 셀 밀도 사용 하는 것이 좋습니다. - 현미경, 셀 삽입 구획에서 유출 되지 하 고 37 ° C, 5% CO2에서 24 h에 대 한 12-잘 접시를 품 어 확인 합니다.
3. 가짜 상처 치유 분석 결과
- 부 화, 후 confluent 셀 monolayers 형성 되었습니다 확인 하는 거꾸로 한 현미경 아래 셀을 시각화.
- 다시 MEMg의 1 mL에 테스트 화합물 (예를 들어, 앰프)를 일시 중단 합니다.
참고:-20 ° c.에 저장 된 재고 솔루션에서 시작 하는 신선한 앰프 희석 준비 - 부드럽게 멸 균 핀셋으로 삽입을 제거 합니다. 수 셀 monolayers 휴식 하지 않도록 주의 하십시오. 흡수 성 종이에 삽입 전송.
참고: 다시 사용 하려면 동일한 삽입, 소독 그들 적어도 3 h 70% 에탄올에. 이후에 멀리 그들을 던져 하는 것이 좋습니다. - 비 부착 한 세포를 제거 하는 micropipette를 사용 하 여 잘 당 MEMg의 1 mL를 추가 합니다. 접시를 닫고 부드럽게 바위.
참고: 팬 들은 그들의 혼란을 피하기 위해 셀 monolayers 위에 직접 매체의 정보를 추가 하지 마십시오. - 매체를 발음 하 고 잘 당 MEMg의 1 mL와 함께 그것을 대체. 접시를 닫고 비디오 카메라를 갖춘 4 배 확대에 거꾸로 현미경 (삽입 하 여 만든) 셀 무료 간격을 시각화 합니다. 이미지에서 시간 0 (T0)을.jpg 형식으로 그들을 저장 합니다.
- 우물에서 매체를 제거 하 고 1 mL의 PBS와 함께 그들을 씻어 버리십시오.
- 우물에 테스트 화합물 (포인트 3.2에서 준비)를 추가 합니다. 치료 컨트롤 샘플에 대 한 MEMg의 1 mL를 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO2접시를 품 어.
- 15, 20, 24 h 치료 후 셀 마이그레이션에 4 배 확대 현미경을 관찰 하 고 이미지.
참고:이 단계 동안 T0에 관해서는 동일한 지역에서 이미지를 캡처 하려고 합니다. 셀 이동 속도에 따라 이미지 캡처됩니다 시간 간격 선택 합니다. - 공부 하 고 몇 가지 선택적 저 해제의 효과, 즉 AG1478, 셀 마이그레이션에 삽입을 제거 하기 전에 각 삽입 구획에서 중간 발음.
- 신선한 MEMg과 각 구획을 세척 하 고 MEMg AG1478와 보충의 70 µ L로 그것을 채우십시오.
- 37 ° C, 5% CO2에서 외피의 30 분 후 포인트 3.3에서에서 설명 된 대로 진행 합니다.
참고: 세척 단계 및 특정 억제제와 셀 monolayers의 전처리 하는 동안 수 삽입을 제거 하지 않도록 주의 하십시오.
4. 이미지 분석
- 완료 되 면 실험, 다양 한 실험적인 그룹의 가장 대표적인 샘플의 이미지를 선택 하 고 T0, T15, T20, 및 T24 h에 단일 이미지를 포함 하는 zip 파일을 만듭니다.
참고: 단일 이미지 모든 샘플에 대 한 선택한 시간 간격에서가지고 간다. 세 번 이상 반복 되는 각 실험에 대 한 triplicates를 실행 합니다. 끝에서 모든 실험 그룹, 최소 3 이미지 ("a", "b", "c", 등등, 각각 독립적인 실험에서 파생)에 대 한 각 시간 지점에서 분석 된다. - 자동으로 선택한 시간 지점에서 (백분율로) 셀 적용 및 스크래치 영역의 실험 데이터를 포함 하는 스프레드시트 요약 파일 이메일로 제공 하는 이미지 분석 소프트웨어에 zip 파일을 업로드 합니다.
참고: 앞 가장자리와 격차 인식 크게 기반 edge 검출 방식 (포인트는 이미지 밝기 급격히 변경 식별 목적). - 데이터를 저장 하 고 그들을 수집 합니다. 시간 0에 평균 값에 따라 모든 데이터를 정상화. 상대 표준 오차 (SEM) 각 시간 지점에서 모든 복제의 정규화 된 데이터의 평균 값을 계산 합니다. 양방향 분산 분석 (ANOVA)을 사용 하 여 적절 한 통계 소프트웨어와 통계 분석을 수행 합니다. 펩 티 드 처리 그룹 및 다른 시간 간격 제어 그룹 사이 다름 간주 됩니다 통계적으로 p에 대 한 significant < 0.05.
- 선택한 시간 간격 모든 샘플 그룹 대 의 셀 적용 영역의 비율을 표시 한 히스토그램으로 얻은 데이터 그래프에 플롯 합니다.
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Representative Results
이 프로토콜은 상처 치유 기능 CFTR 표현 하는 기관지 상피 세포에서 유도 된 세포 마이그레이션 활동 측면에서 Esc(1-21)와 Esc(1-21)-1 c의 효과 결정 하기 위해 사용 되었다. 이 분석 결과에서 문화 삽입 12-잘 접시의 우물에 배치 하 고 각 구획은 MEMg 10% 보충에 35000 셀 시드 FBS. 셀 24 h. 이내 완벽 한 합류를 나중에 도달, 500 μ m 간격 생성 된 고 각 잘 다른 농도에서 펩 티 드를 포함 하는 MEMg와 함께 가득 차 있었다. 실험 4 번 반복 되었다. 그림 2에 표시 된 대로 셀 단층에서 생산 하는 가짜 상처 필드의 거의 완전 한 폐쇄 각각 ~ 20 h, Esc(1-21), Esc(1-21)-1 c를 1 μ M, 10 μ M의 최적 농도에서 내 두 개의 펩 티 드에 의해 유도 했다. 이 Esc(1-21)-1 c 기관지 세포에는 의사의 다시 epithelialization를 홍보에 더 효율적 임을 나타냅니다.
그림 2 : Esculentin-1a의 효과 기관지 상피 세포의 단층에서 만든 가짜 상처의 폐쇄에 앰프를 파생. 셀 실리콘 문화 삽입의 각 구획에 시드 했다 하 고, 제거, 후 셀 펩 티 드의 추가 후에 15, 20, 24 h 세포 이동의 증거에 대 한 촬영 했다. 포인트 계산 된 각 시간에 셀 적용 영역의 백분율 치료 제어 셀 (Ctrl)에 비교 하 고 y 축에 보고 됩니다. 모든 데이터에서 4 개의 독립적인 실험 ± SEM, 의미 있으며 이전 연구14에서 가져옵니다. 제어 및 치료 샘플 사이의 테스트에 대 한 통계적 의미의 레벨은: *p< 0.05, * *p< 0.01, * * *p< 0.001, 그리고 * * *p< 0.0001. 셀 컨트롤에 비해 1 μ M의 농도에서 각 펩 티 드의 치료 후 (T0) 전에 대표 결과 20 h를 보여주는 현미경도 보고 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
EGFR 활성화 Esc 유도 상처 폐쇄에 역할을 했다 여부를 확인 하려면 기관지 세포는 AG1478, 삽입 제거 하기 전에, EGFR의 선택적 억제제의 5 μ M로 30 분 동안 preincubated 했다. 이후 셀 적용 영역의 비율 크게 때 셀 했다 하지 청소용 억제제 이전 펩 티 드 관리 (그림 3),이 지적 발견 펩타이드-유도 하는 결과에 비해 모든 시간 간격 감소 되었다 셀 마이그레이션 EGFR의 활성화를 포함 한다. 그러나, 더 연구 필요 합니다는 Esc-펩 티 드 (예를 들어, 직접 EGFR 활성화 또는 트랜스-활성화 metalloproteases, 다니엘 막 정박 EGFR ligands 표시 되었습니다에 의해 중재에 의해 트리거되는 분자 이벤트를 명확 하 게 19).
그림 3 : 기관지 상피 세포의 펩타이드-유도 된 마이그레이션에 AG1478 억제제의 효과. 셀 삽입 제거 하기 전에 미리 5 incubated 했다 μ M AG1478 30 분 및 그 후 동일한 농도에서 혼자 펩 티 드로 치료. 모든 데이터는 4 개의 독립적인 실험 ± SEM에서에서 의미 하 고 우리의 이전 작품14에서 가져옵니다. 사이 표시 된 그룹 샘플 테스트에 대 한 통계적 의미의 레벨은: *p< 0.05; p< 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
셀 마이그레이션 상처 치유, 배아 개발 및 암 전이 포함 하 여 많은 생리 적 및 병 적인 행사에 필수 과정입니다. 셀 마이그레이션에서 생체 외에서 기본적인 절차는 포함 한다: (i) 세포 단층, (ii) 셀, confluent 계층에는 의사의 생산의 창조 (iii) 캡처 이미지 상처까지 여러 시간 간격의 폐쇄에 도달 그리고 (iv) 선택한 셀의 마이그레이션 속도 측정 하기 위해 이미지 시퀀스의 분석.
우리의 결과 문화 삽입의 응용 프로그램은 객관적이 고 셀 마이그레이션 특성의 정량적 평가 대 한 신뢰할 수 있는 실험 방법으로 나타났습니다. 이 분석 결과 기본적인 실험실 장비 연구 그룹에 의해 수행할 수 있습니다. 그러나, 몇 가지 중요 한 단계는 프로토콜의 재현성을 달성 하기 위해 고려 되어야 한다. 예를 들어 파일럿 실험, 모든 개별 샘플에 합류의 동일한 정도 얻기 위하여 각 구획에 씨앗을 세포의 정확한 수에 의해 정의 하는 것이 중요입니다. 이 목표를 동기화 주기 단계와 세포와 세포 덩어리 뿌리기 전에 피하이 중요 합니다. 응집을 최소화 하기 위해 가능한 방법은 주사기 바늘을 통해 세포 현 탁 액의 부드러운 통로 이다. 그러나, 샘플 크기를 늘리면 크게 셀 사이 가변성을 감소에 기여할 것입니다.
또한, 모든 샘플에서 잘 정의 된 너비와 간격의 창조는 중요 한. 이 위해 실리콘 삽입 해야 사용할 수 없습니다 다시 두 번 이상. 또한, 실리콘 분리 벽 아래 셀의 성장 피해 야 한다. 이 문제를 방지 하려면 한 번 삽입, 위에 부드러운 압력 접시에 배치 플레이트/음, 플라스틱을 삽입의 접착 력 증가를 멸 균 핀셋을 사용 하 여 수동으로 적용할 수 있습니다. 삽입의 신중한 제거 또한 셀 단층의 파괴와 셀 자유의 확대를 방해 합니다.
그러나, 일단 삽입 올바르게 제거 하 고 의사 상처 완벽 하 게 생산, 일부 셀 라인 분리할 수 있습니다 플라스틱 표면에서 그들은 혈 청 이나 비타민, 아미노산, 및 성장 요인 등 보충제 없이 미디어에는 알을 품는 경우에 특히. 세포 배양 매체에서 이러한 요소의 부재 그들은 시험 화합물의 상처 치유 촉진 활동을 방해할 수 있습니다는 사실에 의해 지시 될 수 있습니다. 이 문제를 우회, 문화 매체 구성의 합리적인 선택이 좋습니다.
이 상처를 치유 하는 절차를 설정 하기 전에 고려해 야 할 또 다른 중요 한 단계는 다른 세포 유형 사이에서 존재 하는 다른 마이그레이션 속도입니다. 또한이 경우에, 예비 실험에서 이미지 캡처는 올바른 시간 간격을 결정의 목적으로 예약 해야 합니다. 그것은 또한 같은 문화 삽입 공부에 (예를 들어, polymorphonuclear 백혈구) 증가 하는 세포의 마이그레이션에 대 한 사용할 수 없습니다이 방법으로 관련 된 한 가지 한계는 고려 하는 데 필요한.
상처 치유 분석 실험 수행에 불구 하 고 실리콘 문화 삽입 보다는 더 비싼 클래식 스크래치 분석 결과, 그들은 셀 마이그레이션 작업에 데이터의 신속 하 고 정확한 재생산을 허용. 중요 한 것은, 일단 시스템 설정, 그것은 상처 치유 활동 외 인 또는 내 인 성 요인에 의해 자극된을 기본 분자 메커니즘에 대 한 지식을 확장 하 사용할 수 있습니다. 이 위해, 특정 분자 (예를 들어, 억제제)와 셀 monolayers의 전처리 의사 상처를 만들기 전에 실시 수 있습니다. 예를 들어 셀 (i) 세포 확산 차단 미토마이신 C 앰프에 의해 유도 된 "상처" 필드의 폐쇄 확인 세포 분열 속도20 또는 (ii) metalloprotease 억제제에 의해 영향을 여부를 탐험의 전처리에 의해 주어진 다는 metalloproteases 중재 하는 EGFR 신호 통로12의 활성화에의 기여 금.
중요 한 것은, 상처 폐쇄 과정 샘플 고정 되 고 골격 및 핵 탐지에 대 한 적절 한 얼룩으로 처리 (phalloidin와 DAPI, 각각) 세포의 형태학 적 측면에서 변화를 시각화 하기 위해 (예를 들어, 는 앞 가장자리에 lamellipodia의 형성) 형광/confocal 현미경 검사 법에 의해. 또한, 형광 표시 된 앰프와 셀의 치료 수 있습니다 가능의 셀룰러 분배 (멤브레인 표면 또는 세포내/intranuclear 지역화) 서로 다른 시간에 셀 철새 활동의 시작부터의 시각화 또한, 이러한 삽입 적당 한 transwell에 그들을 배치 하는 데 후 편광 및 차별화 된 상피 세포 (예를들면, 공기-액체 인터페이스에서 유지 하는 기본 기관지 세포), 상처 치유 활동을 분석 하는 데 악용 될 수 있습니다. 침투성을 지원.
결론적으로, 설명된 방법에는 크게 부착 동물 세포/상피 조직, 여러 종류의 철새 기능 뿐만 아니라 가장 유망한 상처 치유의 선택에 이해를 개선 하기 위해 상당한 잠재력 발기인 및 억제제, 높은 정확도 짧은 시간 내.
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Disclosures
저자 공개할 게 없다
Acknowledgments
이 작품에서 역사적인 대학 로마와 이탈리아 낭 성 섬유 증 연구 재단 (프로젝트 보기 #11/2014 FFC 대표단 시에 나, 손 드리 오 Valchiavenna, Cerea Il 소리 디 제니와 파 비아에서 채택) 자금에 의해 지원 되었다. 이 작품의 일부 FILAS 그랜트 보호 FILAS RU 2014 1020에 의해 지원 되었다.
우리는 제공 하는 기관지 상피 세포에 대 한 박사로 레 타 포 레 라 (U.O.C. Genetica 메 디카, Istituto Giannina Gaslini, 제노바, 이탈리아)에 감사.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum essential medium (MEM) | Euroclone | ECB2071L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Glutamine | Euroclone | ECB3000D | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0180DH | |
| Penicillin and Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Trypsin/EDTA 1X in PBS | Euroclone | ECB3052D | Warm at room temperature before use |
| DPBS without calcium and magnesium (CMF-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| DPBS with calcium and magnesium (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Ibidi Culture-Insert 2 well | Ibidi | 80209 | |
| Wimasis Image Analysis | Ibidi | 30002 | |
| PRISM software | GraphPad | version 6.0 |
References
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