Her presenterer vi en enkel metode for å quantitate blodkreft stilk og stamfar celler (HSPCs) i embryonale sebrafisk. HSPCs fra avstand sebrafisk er belagt i methylcellulose med støttende faktorer, skille i eldre blod. Dette gjør påvisning av blod defekter og lar narkotikarelaterte screening for å utføres enkelt.
Hematopoiesis er en viktig mobilnettet prosess der blodkreft stilk og stamfar celler (HSPCs) skille ut en rekke ulike celle linjene som utgjør modne blod. Isolasjon og identifikasjon av disse HSPCs er vanskelig fordi de definerte ex post facto; de kan bare defineres etter deres differensiering inn bestemt celle overleveringslinjer. De siste tiårene, har sebrafisk (Danio rerio) blitt en modell organisme til å studere hematopoiesis. Sebrafisk embryo utvikle ex uteroog av 48 timer etter befruktning (hpf) har generert definitive HSPCs. analyser for å vurdere HSPC differensiering og spredning evner er utviklet, utnytte transplantasjon og påfølgende rekonstituering blodkreft systemet i tillegg til visualisere spesialiserte transgene linjer med AC confocal mikroskopi. Men er disse analyser kostnader uoverkommelige, teknisk vanskelig og tidkrevende for mange laboratorier. Utvikling av en i vitro modell å vurdere HSPCs ville være kostnadseffektive, raskere, og presentere færre problemer sammenlignet med tidligere beskrevet metoder, gir laboratorier for å vurdere mutagenese og narkotika skjermer som påvirker HSPC biologi. Denne romanen i vitro analysen å vurdere HSPCs utføres av plating dissosiert hele sebrafisk embryoer og legge ytre faktorer som fremmer bare HSPC differensiering og spredning. Embryo er atskilt i enkeltceller og belagt med HSPC-støttende koloni stimulerende faktorer som forårsaker dem til å generere kolonien danner enheter (CFUs) som oppstår fra en enkelt stamfar celle. Disse analyser bør tillate mer nøye undersøkelse av molekylære veier HSPC spredning, differensiering og regulering, som tillater forskere å forstå grunnlaget for virveldyrenes hematopoiesis og dens feilregulering under sykdom.
Hematopoiesis er prosessen med å lage mange eldre blod celler kreves for en organismes overlevelse. Det er en nøkkel utviklingsprosess som involverer differensiering av blodkreft stamceller (HSCs) til en rekke developmentally begrenset celletyper som utgjør modne blod. Disse HSCs må selv fornye slik at systemet aldri er oppbrukt og de må beholdes fra embryonale utviklingen til død. I virveldyr, konstant differensiering og spredning av blodkreft stilk og stamfar celler (HSPCs) er nødvendig for å tilstrekkelig fylle fleste blod celler som post mitotisk og blir resirkulert hver dag. HSCs genererer eldre blod celler ved første skille i undergrupper av begrenset stamfar celler. vanlige lymfoide progenitors (CLPs)1, som til slutt produsere T, B og NK celler, og vanlige myelogen progenitors (CMPs)2 som genererer granulocytter, erytrocytter, makrofager og megakaryocytes. Disse progenitors er forpliktet til å generere bestemt celle overleveringslinjer og ytterligere skille ut flere developmentally begrenset stamfar celler som myelogen erythroid progenitors (parlamentet) som genererer erytrocytter og blodplater, eller granulocytt macrophage progenitors (GMPs) som genererer basofile, eosinofile, nøytrofile og makrofager2. Identifisere og isolere disse progenitors lar identifikasjon av viktige molekylær veier involvert i blodkreft differensiering og mange blodkreft sykdommer som leukemi oppstår når disse progenitor celler ikke riktig skille.
De siste tiårene, har sebrafisk (Danio rerio) modell systemet blitt en viktig forskningsverktøy for embryonale og voksen blodkreft studier. Sebrafisk er mottakelig for genetisk analyse og phylogenetically laveste virveldyr modell arter som har en lignende blodkar og blodkreft system for mennesker. Sebrafisk embryo utvikle ex utero, og innen 48 timer post generere befruktning (hpf) HSPCs3,4,5,6,7,8. Sebrafisk er også meget fruktbar, kvinner legge over 100 egg i en enkelt clutch, slik at store og eksperimentelle replikering. Sebrafisk embryoer er optisk gjennomsiktige, slik at mikroskopiske visualisering av blodkreft systemet. Flere fluorescerende transgene linjer med sebrafisk merking HSCs som runx1: EGFP fisk9, cd41: EGFP fisk10, og kdrl:mCherry; cmyb: GFP3 dobbel-positive dyr, tillate live, sanntids visualisering av HSC fremveksten og ekspansjon i vivo3,4,7,8, 9. Den sebrafisk rask generasjon tid og utvikling ex utero har ført til bruk i mutagenese studier11,12,13,14,15 og narkotika screening16,17,18,19,20 for forbindelser som holder terapeutiske løftet for menneskelig blod lidelser. Total, bevaring av blodkreft systemet, tilstedeværelse og enkel utvikling av transgene linjer og rask regenerering tid har gjort sebrafisk en billig, rask, fleksibel og ideelle modell for blodkreft studier.
Mange metoder for å isolere og testing HSCs har blitt utviklet i pattedyr blodkreft systemer. Etterforskerne kan bruke en kombinasjon av celleoverflaten reseptorer å merke HSCs21,22,23,24, i tillegg til å utnytte muligheten for HSCs å middelklasseinnbyggere fargestoff25,26. Etter at de er merket, kan aktiveres av fluorescens celle sortering (FACS) deres fysisk separasjon. Krever bevise at en celle er en HSC irradiating en vert dyr for å ødelegge endogene HSPCs, transplanting antatte HSCs, og observere langsiktige, flere avstamning rekonstituering alle eldre typer blodceller. Disse analyser fungere godt i mus, som det er mange celle-overflate antistoffer mot blodkreft cellene og innavlet musen stammer som letter immun matchende for transplantasjon. Men har noen sebrafisk blodkreft celle-overflate antistoffer vært generert27, hindre identifisering og isolering av HSCs. Den vanligste måten å merke og isolere sebrafisk HSCs er med transgene dyr, der en celle-spesifikke promoter sekvens kjører et fluorescerende protein uttrykk. Studier har visualisert og nummerert HSCs i ventrale veggen av dorsalis med mikroskopi utnytte denne teknikken3,4,8,9. Andre laboratorier har generert klonal stammer sebrafisk28,29 og har utført vellykket transplantasjon i MHC-matchet dyr30. Men disse teknikkene er kostnadseffektivt uoverkommelige for mange laboratorier, teknisk vanskelig, og er tidkrevende. For å løse disse problemene, har laboratorier generert flere i vitro analyser til å teste tilstedeværelsen, prisene spredning og differensiering kapasiteten HSPCs31,32,33, 34,35,36. Disse analyser viser spredning og differensiering av HSPCs i vitro31,32,33,34,35,36, redning av blodkreft defekter36og effektiv metode for å oppdage og testing cytokiner33,34,35. De har også blitt benyttet for å identifisere gener ansvarlig for HSPC biologi31,32. I denne studien ta vi disse analyser et skritt videre, slik at kvantifisering av HSPCs i en utvikling sebrafisk fosteret. Disse analyser kan benyttes for å quantitate antall HSPCs i mutant dyr og dyr behandlet med blodkreft-nedbrytende narkotika. I hovedsak disse analyser er rask, presentere noen tekniske utfordringer, og rimelige måter å quantitate HSPC tall, undersøke deres spredning og undersøke blokker i differensiering.
Sebrafisk modell systemet har blitt en effektiv, effektiv og rimelig modell for å studere primitive og definitive virveldyr hematopoiesis. Generasjon av analyser som er rask, billig, og presentere noen tekniske problemer kan utnyttes for testing små molekyler, analysere mutant embryoer og Klargjørende molekylær trasé viktig for HSPC biologi. In vitro plating av HSPCs fra voksen sebrafisk er en effektiv metode for å studere mutagenese cytokiner og blodkreft defekter. Denne protokollen bygger på disse studi…
The authors have nothing to disclose.
Midler ble gitt av National Institutes of Health (NIH: K01-DK087814-01A1 til D.L.S.), California State University programmet for utdanning og forskning i bioteknologi (CSUPERB: molekylære kontroll av virveldyr blodkreft nisje til D.L.S.) og fra diplomstudium kontoret i California State University Chico (til A.C.B.).
10% Bovine Serum Albumin in Iscove's MDM | StemCell Technologies | 9300 | |
DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
DMEM 500 mL | Corning CellGrow | 10-017-CV | |
Ham's F12 500 mL | Corning CellGrow | 10-080-CV | |
FBS 500 mL | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
HEPES 100 mL (1 M) | Gibco life technologies | 15-630-080 | |
Penicillin/streptomycin (5000 U/mL and 5000 mg/mL) with L-Glutamine (200 mM) |
Corning Mediatech | 30-009-CI | |
Gentamycin Sulfate 10 mL (50 mg/mL) | Corning Mediatech | 30-005-CR | |
1.5 mL MCF tube | FisherBrand | 05-408-129 | |
3 mL 23gx1 injection needle with Luer lock | BD Safety Glide | 305905 | |
5 mL polystyrene round bottom tube with cell strainer cap | Corning Falcon | 352235 | |
Methocel MC | Sigma-Aldrich | 64630 | |
14 mL Polystyrene round bottom tube | Corning Falcon | 352057 | |
10 mm polystyrene easygrip Petri dish | Corning Falcon | 351008 | |
Librease TM | Roche Sigma-Aldrich | 5401119001 | dissociation protease |
Pronase | Roche Sigma-Aldrich | 11459643001 | dechorionation protease |
15 cm Petri dish | Corning Falcon | 351058 | |
AB | Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | ZL1 | zebrafish strain used |
Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 |