Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

Zebra balığı embriyo geliştirilmesinde bir Vitro tahlil hematopoetik kök ve yaratıcı Quantitate gelişimi (HSPCs) hücreleri

doi: 10.3791/56836 Published: November 30, 2017

Summary

Burada, hematopoetik kök ve progenitör hücreler (HSPCs) embriyonik Zebra balığı quantitate için basit bir yöntem mevcut. Disosiye Zebra balığı HSPCs methylcellulose içinde içine olgun kan ayırt destekleyici faktörler ile kaplama. Bu kan algılama kusurları ve kolayca yapılacak eleme uyuşturucu sağlar sağlar.

Abstract

Hematopoiesis, hematopoetik kök ve progenitör hücre (HSPCs) olgun kan oluşturan farklı hücre soy çok sayıda ayırmak önemli bir hücresel işlemidir. Yalıtım ve bu HSPCs tanımlaması zor çünkü onlar tanımlanmış ex post facto; Onlar sadece kendi farklılaşma belirli hücre soy içine sonra tanımlanabilir. Son birkaç on yıl içinde Zebra balığı (Danio rerio) hematopoiesis eğitim için bir model organizma haline gelmiştir. Zebra balığı embriyolar rahimgeliştirmek ve 48 saat sonrası döllenme (hpf) tarafından HSPC farklılaşma değerlendirmek için kesin HSPCs. deneyleri üretilip ve nükleer silahların yayılmasına karşı yetenekleri geliştirilmiştir, nakli kullanan ve sonraki sulandırma hematopoetik sisteminin yanı sıra özel transgenik hatları confocal mikroskobu ile görüntülenmesi. Ancak, bu deneyleri maliyet engelleyici, teknik olarak zor ve zaman alıcı birçok laboratuarlar için vardır. HSPCs değerlendirmek için bir vitro modeli geliştirilmesi olacak maliyet etkin, daha hızlı ve daha önce karşılaştırıldığında daha az mevcut zorluklar HSPC Biyoloji etkileyen mutagenesis ve uyuşturucu ekranlar hızlı bir şekilde değerlendirmek laboratuvarlar sağlayan yöntemlerini açıklanan. HSPCs değerlendirmek için bu roman vitro tahlil ayrışmış kaplama bütün Zebra balığı embriyo ve sadece HSPC farklılaşma ve nükleer silahların yayılmasına karşı teşvik ekleyerek eksojen faktörler tarafından gerçekleştirilir. Embriyolar tek hücrelere ayrışmış ve onları bir tek progenitör hücre ortaya koloni oluşturan birimler (CFUs) oluşturmak neden HSPC destekleyici koloni uyarıcı faktör ile kaplama. Bu deneyleri moleküler yolları daha dikkatli incelenmesi HSPC yayılması, farklılaşma ve araştırmacılar omurgalı hematopoiesis temelleri ve onun bozukluk anlamak sağlayacak yönetmelik sorumlu izin vermelidir hastalık sırasında.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hematopoiesis olgun kan hücreleri bir canlının hayatta kalmak için gerekli sayıda yapma işlemidir. Bu farklılaşma hematopoetik kök hücre (HSCs) içeren bir anahtar gelişimsel olgun kan oluşturan gelişimsel olarak sınırlı hücre tipleri çeşitli içine süreçtir. Bu HSCs böylece sistem asla yorgun ve onlar ölene kadar erken embriyonik gelişme ısrar gerekir kendini yenilemesi gerekir. Omurgalılar, sürekli farklılaşma ve hematopoetik kök ve progenitör hücrelerin (HSPCs) çoğalması yeterince sonrası Mitotik kan hücrelerinin çoğunluğu doldurmak için gerekli olan ve her gün geri dönüşümlü. HSCs ilk kısıtlı progenitör hücre alt kümeleri ayırt tarafından olgun kan hücreleri üretirler; sonunda T, B ve NK hücreleri üretmek, ortak lenfoid ataları (CLPs)1ve granülosit, eritrositler, makrofajlar ve megakaryocytes ortak Miyeloid ataları (CMPs)2 . Bu ataları belirli hücre soy oluşturmak için kararlı olan ve daha fazla daha fazla gelişim kısıtlı progenitör hücreler eritrositler ve trombosit veya granülosit oluşturmak myeloid erythroid ataları (milletvekilleri) gibi içine ayırt etmek bazofil, eozinofil, nötrofiller ve makrofajlar2üreten makrofaj ataları (GMPs). Belirlenmesi ve bu ataları yalıtma önemli moleküler yolları tanımlaması hematopoetik ayrımında yer sağlar ve lösemi gibi birçok hematopoetik hastalığın ortaya bu progenitör hücrelerin düzgün başarısız ayırt etmek.

Son birkaç on yıl içinde Zebra balığı (Danio rerio) modeli sistemi embriyonik ve yetişkin hematopoetik çalışmaları için bir anahtar araştırma aracı haline gelmiştir. Zebra balığı için genetik analiz mükellef bulunmaktadır ve bir benzer damarlara ve insanlara hematopoetik sistem filogenetik en düşük omurgalı modeli türü bulunmaktadır. Zebra balığı embriyolar rahim geliştirmek ve 48 saat sonrası içinde fertilizasyon (hpf) oluşturmak HSPCs3,4,5,6,7,8. Zebra balığı da çok bereketli, tek bir debriyaj 100 yumurta üzerinde döşeme kadın ile büyük ve deneysel çoğaltma için izin. Zebra balığı embriyo optik şeffaf, hematopoetik sistem mikroskobik görselleştirme için izin vardır. Zebra balığı HSCs runx1gibi işaretleme birkaç floresan transgenik satırlık: EGFP balık9, cd41: EGFP10, Balık ve kdrl:mCherry; cmyb: GFP3 çift pozitif hayvanlar, HSC ortaya çıkması ve genişleme vivo içinde3,4,7,8, canlı, gerçek zamanlı görselleştirme için izin 9. Zebra balığı'nın hızlı nesil zaman ve geliştirme rahim mutagenesis çalışmalar11,12,13,14,15 ve uyuşturucu kullanımı yol açmıştır insan kanı bozuklukları için tedavi edici sözü tutun bileşikler için16,17,18,19,20 eleme. Genel olarak, koruma, varlığı ve kolay geliştirebilme imkanı transgenik hatları ve hızlı yenilenme zamanı hematopoetik sistem Zebra balığı hematopoetik çalışmaları için ucuz, hızlı, esnek ve ideal bir model haline getirdi.

İzole ve HSCs test birçok yöntem içinde memeli hematopoetik sistem geliştirdik. Müfettişler bir arada hücre yüzey reseptörlerinin yanı sıra HSCs21,22,23,24işaretlemek sızma boya25,26HSCs yeteneği yararlanmak için kullanabilir. Sonra onlar etiketlenir, Floresans aktif hücre (FACS) sıralama fiziksel ayırma sağlar. Bir hücreyi bir HSC kanıtlayan sözde HSCs dikim ve uzun vadeli, çok lineage sulandırma kan hücre tipleri olgun her şeyden gözlemleyerek endojen HSPCs yok etmek için bir ev sahibi hayvan irradiating gerektirir. Çok sayıda hücre yüzeyine antikorlar hematopoetik hücreler ve bağışıklık ekimi için eşleşen kolaylaştırmak doğuştan fare suşları karşı olduğundan bu deneyleri de farelerde, iş. Ancak, birkaç Zebra balığı hematopoietik hücre yüzeyine antikorlar oluşturulan kimlik ve HSCs yalıtım engelleyen27, olmuştur. Mark ve Zebra balığı HSCs yalıtmak için en yaygın bir hücre özgü organizatörü sıra floresan protein ifade sayede sürüş Transjenik hayvanlar ile yoludur. Çalışmalar görüntülenir ve HSCs dorsal aort ventral duvar bu tekniği3,4,8,9kullanan mikroskobu ile numaralandırılan. Ultraviyole Zebra balığı28,29 klonal suşları üretilip ve MHC eşlemeli hayvanlar30' u başarılı nakli gerçekleştirdik. Ancak, bu teknikler maliyet birçok laboratuvarları engelleyici vardır, teknik olarak zor ve zaman alıcı vardır. Bu sorunlara yönelik olarak laboratuvarları varlığı, nükleer silahların yayılmasına karşı oranları ve HSPCs31,32,33ayırt etme kapasitesi için test etmek için birkaç vitro deneyleri üretilip, 34,35,36. Bu deneyleri yayılması ve HSPCs vitro31,32,33,34,35,36, kurtarma farklılaşma göster hematopoetik kusurları36ve keşfetmek ve sitokinler33,34,35test için verimli bir yöntem. Onlar da HSPC Biyoloji31,32için sorumlu genlerin tanımlamak için kullanılmıştır. Bu çalışmada, bu deneyleri bir adım daha ileri, HSPCs Nefelometri gelişmekte olan bir Zebra balığı embriyo içinde izin alıyoruz. Bu deneyleri de mutant hayvanlar HSPCs sayısında quantitate için kullanılması gereken ve hayvanlar yıkıcı hematopoetik ilaçlar ile tedavi. Aslında, bu deneyleri hızlı, mevcut birkaç teknik sorunlar ve HSPC numaraları quantitate, onların yayılması incelemek ve blok ayrımında araştırmak için ucuz yolu vardır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Chico, California eyalet Üniversitesi'nde Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Danışma Kurulu aşağıda açıklanan tüm yöntemleri onayladı.

1. çamaşır suyu 48 hpf Zebra balığı embriyolar

  1. 15 cm (w) x 15 cm (l) x 7 cm (h) plastik kaplar oluşturmak 3 yıkama istasyonları: 1) ile 1 mL % 5 çamaşır suyu 1000 mL embriyo orta (E3; bkz: Tablo 1), 2) ile steril E3 ve 3) ile steril E3. Her kapsayıcı embriyo daldırın çözeltinin 500 mL olduğundan emin olun.
    Not: en az 10 embriyo test her koşul için gerekli olacaktır. Bu çamaşır yordamı 200 embriyo ağırlayacak.
  2. Transfer pipet ile embriyo bir çay süzgeci yerleştirin ve 5 dk. (ile embriyo içinde) çay süzgeci kaldırmak ve yıkama istasyonu #2 5 min için içine koyun yumurta yıkama istasyonu #1 daldırın; son 5 min için yıkama istasyonu #3 için yineleyin.
  3. Son yıkama sonra durulama embriyo çay süzgeci kısıtlayarak bu baş aşağı bir temiz 10 cm Petri kabına yavaşça embriyo durulama üzerinden kapalı steril E3 ile çay süzgeci ve transfer pipet.

2. Dechorionate embriyo

  1. Bir aktarım pipet ile kaldırın ve Petri kabına üzerinden mümkün olduğu kadar E3 atmak ve dechorionation proteaz (10 mg/mL) 500 μL embriyolar için ekleyin. 5 dk. hafifçe dokunun için tamamen chorions kaldırmak için Petri kabına yan oda sıcaklığında kuluçkaya.
  2. Serolojik pipet ile 20 mL steril E3 proteaz sulandırmak için ekleyin. Embriyo yerleşmek izin ve bir transfer pipet ile E3 kaldırın. Bu yıkama 3 kez dechorionation proteaz bütün izlerini kaldırmak için adımları yineleyin.

3. embriyo örnekleri hazırlama

  1. P1000 pipet kullanarak, 10 embriyo bir tek steril 1.5 mL microcentrifuge tüp içine yerleştirin.
  2. Bir pipet ile E3 kaldırmak ve atın.
    Dikkat: embriyo kolayca yerinden ve yıkama aşağıdakileri sırasında atılır gibi özenle pipet.

4. embriyo ayrılma için hazırlanması

  1. Laminar akış Hood'a örnekleri aktarmak ve yıkama embriyo 1 mL ekleyerek steril E3. Embriyo tüp altına yerleşmek ve süpernatant P1000 pipet ile kaldırmak izin verir. Toplam 3 yıkama için işlemi yineleyin.
  2. Son yıkama sonra E3 kaldırmak ve atın. 10 mM dithiothreitol (DTT) 1 mL mukus kaplama (ve herhangi bir sporlar, mantar veya bakteri içinde sıkışmış) embriyonik Zebra balığı çevreleyen kaldırmak için E3 içinde ekleyin. Microcentrifuge tüp yatay olarak yatıyordu ve laminar akış başlıklı 25 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.

5. embriyo ayrılma

  1. Örnek 3 kez ile 1 mL steril DPBS (Ca2 + ve Mg2 +ile) yıkayın. Sonra son yıkama DPBS 500 μL (ile Ca2 + ve Mg2 +) ekleyin ve 5 mg/mL (26 U/mL) ayrılma proteaz 5 μL ekleyin.
    Dikkat: Bu enzim Ca2 + ve Mg2 +ihtiyacı var, bu yüzden DPBS Bu iyonlar içerdiğinden emin olun.
  2. Örnekleri üzerinde 60 dk. yer örnekleri laminar akış Hood için bir yatay orbital Çalkalayıcı-180 rpm'de 37 ° C'de kuluçkaya ve örnekleri tam ayrışmış kadar embriyo bir P1000 ile triturate.
    Dikkat: embriyo düzenli olarak ne zaman onlar ayrışmış haline belirlemek için denetleyin. Embriyo çözüm bir miktar doku mevcut olmalıdır; tamamen homojen olmaması gerekir. Mümkündür (bkz. ek şekil 1) HSPCs yok edecek aşırı Özet.

6. Disosiye embriyo hazırlanması

  1. Ayrışmış pipet 10 embriyo 5 mL polistiren üst rezervuarı üzerine alt tüp 35 mikron hücre süzgeç kap ile yuvarlak.
  2. Bir pipet ile durulama Petri tüp (Ca2 + veya olmayan Mg2 +) steril PBS ve 5 mL polistren tüp içeren transfer çözüm adım 6.1 hücrelerden filtre. Sıvı 4 mL 5 mL polistren tüp mevcuttur kadar yineleyin.
    Not: Ca2 + veya Mg2 + içerdikleri değil sürece PBS, DPBS veya diğer izotonik tamponlu çözümleri bu aşamada kullanılabilir
  3. 4 ° C ve 300 x g homojenize hücre örnek cips 5 min için tüpler santrifüj kapasitesi. Bir pipet ile kaldırmak ve yuvarlak alt tüp süpernatant atın. Tüp alt kısmında pelleted hücreleri bozmak değil için dikkat ediniz. PBS 100 μL hücrelerde resuspend.

7. Methylcellulose hazırlanması

  1. 1 x tam methylcellulose (Tablo 1) hisse senedi çözüm üretmek ve 2.5 mL steril yuvarlak alt 14 mL tüpler 3 mL şırınga ve 16 G iğne ile ekleyin. Bir tüp test her koşul için kullanın.
  2. Sitokinler, küçük moleküller veya diğer ajanlar her örnek için soruşturma olması için ekleyin.
    1. Myeloid farklılaşma için uyarıcı faktör (Gcsf)34 methylcellulose orta % 1 sazan serum ve 0.3 mg/mL rekombinant Zebra balığı granülosit koloni ekleyin. Bkz: Svoboda vd. 37 sazan serum ve rekombinant sitokinler oluşturmak nasıl tam açıklama için.
    2. Erythroid farklılaşma için % 1 sazan serum ve 0.1 mg/mL rekombinant Zebra balığı Eritropoietin (Epo)38 methylcellulose Orta olarak ekleyin.
    3. Multilineage ataları incelemek için Epo ve Gcsf ekleyin.
      Dikkat: Orta bireysel kolonileri ayırt etmek viskoz olmayacak gibi sitokinler ve katkı maddeleri toplam hacminin % 10 daha fazla toplam değil.

8. Methylcellulose için Disosiye embriyo eklenmesi

  1. Bir pipet kullanarak 100 μL Disosiye 10 embriyoların rekombinant sitokinler ve sazan serum ile hazırlanmış methylcellulose yüzeyine ekleyin. Cap kapak ve yavaşça tam örnek homojenize girdap. Her tüp Şimdi 10 embriyo Disosiye dokusunun içermelidir.
  2. 3 mL şırınga ve 16 G iğneler, aliquot 1 mL örnek içine 2 ayrı 35 mm Petri yemekler kullanarak. Örnek tamamen Petri kabına dağınık olduğunu emin olun. Her örnek için yineleyin.
  3. 35 mm Petri yemekler hücreleri ile methylcellulose içinde bir 15 cm Petri kabına yerleştirin. Her 15 cm yemek için bir 35 mm Petri tabağı ile 5 mL steril su örnekleri nemlendirmek için ekleyin. 32 ° C ve % 5 CO2 ' de 7-10 gün kuluçkaya.

9. görselleştirme birimleri (CFUs) oluşturan Colony HSPC elde edilen

  1. 7 gün sonra kuluçka, 40-100 X görselleştirme ve numaralandırma örnekleri ters bir mikroskop üzerine yerleştirin. Bu noktada, bireysel kolonileri bir pipet ile izole ve boyama ve/veya gen analize tabi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Embriyonik Zebra balığı HSPC sayıları değerlendirmek için 48 hpf embriyo sindirilir, methylcellulose içinde eksojen destekleyici hematopoetik büyüme faktörleri ile kaplama ve 7 gün (şekil 1A) inkübe. 7 gün sonra koloni oluşturan birimler (CFUs) numaralandırılmış (şekil 1B) ve Görüntülü (şekil 1C) olduğunu. Eklenen farklı sitokinler kontrol ederek, bir tane üretilen kolonileri türlerini denetleyebilirsiniz: Epo erythroid farklılaşması için gerekli ve Gcsf myeloid farklılaşması için gerekli. Sazan serum memeli doku kültüründe fetal sığır serum'ın kullanımı için benzerdir; Genel büyüme faktörlerinin bir kaynaktır. Şekil 1' de, Epo, Gcsf ve sazan serum, erythroid, myeloid ve karışık erythromyeloid kolonileri numaralandırılmasına izin eklenmiştir. Bu koloniler nedeniyle onların şekil ve renk ayırt edilebilir; erythroid kolonileri sıkı, küçük ve kompakt ve kırmızı renk nedeniyle hemoglobinization sahip. Myeloid koloniler daha büyüktür ve fırfır yakalı bir görünüm vererek onların kenarlarda daha fazla hareketli hücreler içeriyor.

Başarılı tedavi embriyonik Zebra balığı kaplama ile HSPC destekleyici faktörler CFUs kuluçka 7-10 gün sonra ortaya çıkarır. Önemlisi, CFUs miktarını doğrudan kaplama embriyo (şekil 1B) numarası ile ilişkilendirir. (Olan deney başında 10 ya da 20 embriyo ile başlayan için) mL başına 4 veya 8 embriyo kaplama yaklaşık 1200 veya 2.400 CFUs, sırasıyla verir. Zor ve zaman alıcı 2.400 CFUs büyük bir deneyin gerçekleştirirken saymak için olduğu gibi bizim protokol 10 embriyo kullanarak önerir. Tüm embriyoların sindirerek metodolojisi, nedeniyle çeşitli enkaz içinde methylcellulose var, ancak kolayca mikroskop altında yüksek büyütme ile gerçek kolonilerden ayırt edilebilir. Diğer hücresel enkaz da mevcut olabilir, ama tek CFUs mevcut HSPC kaynaklı HSPC destekleyici sitokinler ek nedeniyle olacak. CFUs küçük ve kolayca görmedim varsa, kültürler kadar artan büyüme teşvik etmek için 10 gün inkübe. Ancak, artan kuluçka daha fazla CFUs vermez; CFUs yoksa, bu embriyolar sindirim üzerinde sitokin etkinlik, bir kaybı gösterir (ve sonraki HSPCs; imha tamamlayıcı şekil 1bakınız), ya da uygunsuz kaplama örnekleri. Her zaman bu deneme tekniği küçük farklılıklar yanlış HSPC numaralandırma farklılıkları verir emin olmak için gerçekleştirilen her zaman uygun denetimleri çalıştırmak önemlidir. Örneğin, bir deney HSPCs morphant embriyo mevcut sayısı analiz için gerçekleştirilirse, yanında bir örnek normal kardeşler ile hazırlanmalıdır. Bir deneme bir uyuşturucu etkisi bir örnek tedavi edilmezse kardeşler ile hazırlanan ve yanında analiz HSPCs gelişimi karşılaştırmak için gerçekleştirilirse.

Figure 1
Şekil 1: Numaralandırma HSPC elde edilen CFUs 48 hpf Zebra balığı embriyo üzerinden. (A) methylcellulose HSPC destekleyici sitokinler ile üzerine embriyo kaplama hematopoetik CFUs nesil şematik bakış. 48 hpf Zebra balığı embriyo ayrışmış ve Eritropoietin (Epo), granülosit koloni uyarıcı faktör (Gcsf) ve erythromyeloid farklılaşma sağlayan sazan serum ile % 1 tam methylcellulose kaplama. (B) numaralandırma birimleri (CFUs) (deneme sırasıyla 10 ya da 20 embriyo ile başlayan) mL başına 4 veya 8 embriyo konsantrasyonlarda kaplama örnekleri oluşturan Colony. Numaralandırma 100 X ters bir mikroskop üzerinde yapıldı. CFUs ortalama sayıda Çubuklarõn ve hata çubukları standart sapma gösterir. (C) koloni morfolojisi üzerine methylcellulose embriyo kaplama temsilcisi. Koloni'nın Morfoloji koloni oluşturan hücreleri türlerini gösterir; temsilcisi erythroid ve myeloid kolonileri görüntülerdir. CFUs 400 X fotoğraflandı. Ölçek çubukları 50 mikron =.  Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Supplemental Figure 1
Tamamlayıcı şekil 1: sindirim ayrılma proteaz ile embriyo. (A) sindirim önce 10 embriyo görüntülerini (yaptı; sindirilmemiş), yeterli sindirim sonra (orta; sindirilir) ve sonra aşırı hazım (şu; sindirmek üzerinde). Görüntüler (7,3 X) sindirilir ve üzeri sindirilir tüplerde (A), (B) vınlamak. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Zebra balığı modeli sistemi ilkel ve kesin omurgalı hematopoiesis çalışmak için verimli, etkili ve ucuz bir model haline gelmiştir. Hızlı, ucuz ve az teknik zorluklar deneyleri nesil küçük moleküller testi, mutant embriyo çözümlemek ve moleküler pathways HSPC Biyoloji için önemli elucidating için yararlı olabilir. HSPCs in vitro kaplama--dan yetişkin Zebra balığı mutagenesis, sitokinler ve hematopoetik hataları incelemek için etkili bir yöntemdir. Bu iletişim kuralı bu çalışmalar kurar ama embriyonik Zebra balığı kullanır. Bu deneyleri için embriyonik Zebra balığı uygulama daha hızlı veri toplama, daha az fiziksel mekan, daha az ilaç kullanımı (için uyuşturucu ekranları), kullanımı için izin verir ve test mRNA overexpression ve/veya morpholino (MO) nakavt belirli genetik yollar izin verir. Önemlisi, Ayrıca sadece erken omurgalı geliştirme sırasında ortaya hematopoiesis aşamaları çalışma sağlar.

Bu tahlil esneklik nedeniyle kolayca birçok çeşitli ihtiyaçlarını karşılamak için değiştirilebilir. Bu iletişim kuralı bir değişiklik gelişimsel zamanlama modülasyon olduğunu; kullanılan embriyo yaşın değiştirme HSPC üretimi Nefelometri zamanla sağlar. Bu da 36 önce ortaya farklı alt kümelerini HSPCs erythromyeloid ataları6gibi çalışma izin verebilirsiniz ortaya hpf, bona fide HSCs3,4,5,8, karşı daha sonra. Hiç kimse henüz ayırmak ve gelişmekte olan embriyo daha sınırlı Zebra balığı HSPC alt kümeleri tanımlamak mümkün olmuştur, ancak bu deneyleri bu deneyler izin. Bu hayvanların gelişim aşamalarında değiştirirken, hücre methylcellulose eklendi miktarı de optimize esastır; çok az hayvan yok koloniler, süre çok verecektir birçok sayılamayan bir plaka HSPC kolonileri oluşturur. Farklı sitokinler eklemek için belirli deneylerin uyarlanmış bir başka değişiklik olur. GCSF myeloid kolonileri numaralandırılmasına izin verirken Epo eklenmesi erythroid kolonilerin Nefelometri olanak tanır. Her ikisi de bu sitokinler eklenmesi çok lineage CFU üretimi olanak tanır. Önemlisi, bu deneyleri sözde sitokinler ve HSPC yayılması ve farklılaşma üzerindeki etkileri test izni. Bu deneyleri de büyük ölçekli uyuşturucu testi gerçekleştirmek için değiştirilebilir; embriyo farklı konsantrasyonları farklı zaman noktalarda bileşiklerin kimyasal kan üretimi üzerinde olumlu ya da olumsuz bir etkisi olup olmadığını anlamak için geliştirme sırasında maruz kalabilirler. Bu deneyler değiştirilebilir bir son embriyo ile belirli mRNA veya MOs, overexpress ya da devirme belirli genler, tek hücreli aşamada sırasıyla enjekte edilebilir olduğunu yoludur. 24-48 h için geliştirme sonra bu embriyoların kazanç - veya kaybı--fonksiyonu belirli genlerin HSPC oluşumu, yayılması ve farklılaşma önemli bir rol oynamak eğer belirlemek için bu deneyleri tabi. Zebra balığı farklı mutant suşları kullanan hız ve toplama ve veri yorumlama kolaylığı yardımcı olacak olduğunu unutmamak önemlidir. Bir erythroid gelişiminde ilgilenen varsa, örneğin, bu deneyler gata1içinde gerçekleştirmek kolay: erythroid özel transgenik Gata1 transkripsiyon faktörü DsRed sürüş organizatörü olan DsRed embriyo40, Floresan. Bu şekilde, erythroid kolonileri analiz ederken Floresans mikroskobu yararlı olabilir. Aynı şekilde, bu çalışmalar ile birden fazla transgenes aynı anda birden çok hücre soy için bakmak için mevcut hayvanlar üzerinde gerçekleştirilebilir. Bu teknik multilineage HSPCs tanımlamak için yararlı olacağını; erythroid ve myeloid kolonileri Morfoloji tarafından kolayca fark edilebilir olmakla birlikte, birden çok lineage özgü transgene ifade aynı koloni varlığı görselleştirme olmadan bipotential ataları içeren kolonileri tespit etmek zordur .

Bu deneyleri birçok faydası olsa da, bu deneyler gerçekleştirilen her zaman yeterli denetimleri ayarlama esastır; küçük varyasyonları teknik Yorumlar bulgular ve sonuçlar değişebilir. Örneğin, tekniğin kesin değilse farklı günlerde deneyler gerçekleştirdiğinizde HSPCs farklı sayıda almak mümkündür; Bu imkanı ile başa çıkmak için bir her zaman uygun bir denetim içermelidir. Bir deneme bir MO etkisi geliştirme test, sonra embriyo (ya da uninjected bir denetimle MO enjekte) aynı debriyaj olan kontrol gerçekleştirilirse de deneysel örnek işlenip. Deneme belirli bir ilaç etkisini test etmek için tasarlanmıştır Eğer tedavi edilmezse örnekleri bir denetim olarak dahil edilmelidir. Son olarak, geliştirme belirli bir sitokin etkilerini sınama olumlu sonuçlanırsa, sonra aynı debriyaj hayvanlardan Ayrıca işlenen ve kültür için eklendi sitokin kalmadan aynı anda inceledi.

Bu vitro tahlil gerçekleştirmek için basit ve sonuçları yorumlamak kolay iken, bazı olası sorunları işlem sırasında ortaya çıkabilir. Hiçbir kolonileri kültür 7 gün sonra görülürse oluşmuş olabilir birkaç sorun vardır. Öncelikle, sitokinler saf ve uygun konsantrasyonlarda emin olmak için kontrol edin; nasıl sitokinler üretilen bağlı olarak konsantrasyonları alter ve faaliyetlerini en iyi duruma getirmek için gerekli olabilir. Yaygın olarak ortaya çıkar bir başka konu embriyo, hangi HSPCs yok eder aşırı sindiriyormuş; sindirim adımda dikkat çekmek ve hiçbir kolonileri art arda görülürse zamanlama değiştirebilirler. Son olarak, methylcellulose ve sazan serum ilavesi ile karıştırma olabilir sorunu, yani tüm malzemeyi ekledi ve düzgün karışık olduğundan emin olun. Teknik sorunlara ek olarak, koloniler artık bu belirli koşullar altında geliştirmek gerekebilir fark etmek önemlidir; sık sık küçük koloniler çok daha kültür ek bir 3 gün sonra görülebilir. Methylcellulose kısa bir süre sonra kurumaya başladığında 10 gün durursanız, tavsiye edilmez. Başka bir ortak sorunu bazen koloniler 35 mm Petri yemekler kenarları etrafında toplamak eğiliminde olduğunu; Tabakları iyice, özellikle kenarlarda, tarama esastır. Ayrıca, bu koloninin bir kalın, yapışkan malzeme gelişmekte olan hatırlamak önemlidir; odağı yukarı ve aşağı biraz farklı gözlemlemek için mikroskop, odaklanan ayarladığınızda uçaklar-kolonilere plastik tabak dibinde oturan olacak değil.

Bu vitro deneyleri avantajları var, ama onlar da birkaç sınırlaması. Bu deneyleri bir Dede bir HSC sadece radyasyonlu hayvanlar uzun vadeli sulandırma tarafından kanıtlanmış-olduğunu kesin olarak ispat edemez en büyük sorundur. Ayrıca, tüm sitokinler tanımlanan ve soruşturma olması HSPCs türlerini sınırlayan Zebra balığı içinde henüz, araştırıldı. Örneğin, hiçbir Zebra balığı destekleyici lenfoid sitokinler henüz, bu deneyleri B ve T hücre üretimi engelleyen tespit edilmiştir. Ayrıca, eğer belirli sitokinler belirli türleri (veya tutarları) eklenmesi farklılaşma hematopoetik belirli yolları aşağı eğmek multipotent HSPCs kültür zaman belirsizdir. Başka bir potansiyel ihtar HSPCs aslında bir örnek varsa ama nedense ayırt etmek mümkün değildir (veya aksi takdirde geçerli değildir Eğer) bu tahlil etkin bir şekilde ayırt edemez var. Çoğu vitro deneyleri gibi ile daha fazla deneyler her zaman bulguları doğrulamak için yapılmalıdır. Bu sorunlar çok bilgi--dan bu klonal deneyleri panoda.

Çünkü onlar hızlı ve etkin tarama hematopoetik kusurların izin bu deneyleri önemlidir. Araştırmacılar genetik belirli yolları ile ecek aşağı vuruş yapabilirsiniz ve plaka hayvanlar gen hematopoiesis içinde bir rol oynar Eğer görmek için sindirilmiş. Ayrıca, (daha önce oluşturulan veya yeni oluşturulan mutagenesis ekranları) mutant balık hızla ve kolayca tespit edilebilir. Bu deneyleri de verimli uyuşturucu ilaç geliştirme veya hayatta kalma üzerinde olumsuz bir etkisi olup olmadığını gözlemlemek mümkün olurken aynı zamanda modülasyon HSPC Biyoloji tanımlamak için tüm canlı organizmalar üzerinde tarama deneyleri izin. Bu deneyleri de farklı timepoints HSPCs Nefelometri gelişmekte olan Zebra balığı içinde izin. Birden fazla çalışmalar HSC numaraları yetişkin7,27,30,41 ve embriyonik Zebra balığı3,4,42, quantitate için teşebbüs ederken 43, hiçbir çalışmalar lineage tarafından kısıtlanmış HSPCs Zebra balığı içinde farklı miktarlarda quantitated. Ayrıca, bu deneyleri incelemek ve moleküler yollar kan hücrelerinin oluşumu ve farklılaşma, esrarengiz kalır bir süreç önemli modüle yararlı olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından sağlanan finansman (NIH: K01-DK087814-01A1 D.L.S. için), Kaliforniya Devlet Üniversitesi programı için eğitim ve araştırma biyoteknoloji (CSUPERB: omurgalı hematopoetik niş D.L.S. için moleküler kontrolü) ve California State Üniversitesi Chico (için A.C.B.) lisansüstü ofisinden.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Bovine Serum Albumin in Iscove's MDM StemCell Technologies  9300
DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+ Life Technologies 14080-055
HyClone PBS (1x) GE Healthcare Life Sciences sh30256.01
 DMEM 500 mL Corning CellGrow 10-017-CV
 Ham's F12 500 mL Corning CellGrow 10-080-CV
FBS 500 mL Gemini Bio-Products 100-108
HEPES 100 mL (1 M) Gibco life technologies 15-630-080
Penicillin/streptomycin (5000 U/mL
and 5000 mg/mL) with L-Glutamine (200 mM)
Corning Mediatech 30-009-CI
Gentamycin Sulfate 10 mL (50 mg/mL) Corning Mediatech 30-005-CR
1.5 mL MCF tube FisherBrand 05-408-129
3 mL 23gx1 injection needle with Luer lock BD Safety Glide 305905
5 mL polystyrene round bottom tube with cell strainer cap Corning Falcon 352235
Methocel MC Sigma-Aldrich 64630
14 mL Polystyrene round bottom tube Corning Falcon 352057
10 mm polystyrene easygrip Petri dish Corning Falcon 351008
Librease TM Roche Sigma-Aldrich 5401119001 dissociation protease
Pronase Roche Sigma-Aldrich 11459643001 dechorionation protease
15 cm Petri dish Corning Falcon 351058
AB Zebrafish International Resource Center (ZIRC) ZL1 zebrafish strain used
Dithiolthreitol (DTT) Sigma-Aldrich 646563

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
  2. Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
  3. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
  4. Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
  5. Bertrand, J. Y., Kim, A. D., Teng, S., Traver, D. CD41+ cmyb+ precursors colonize the zebrafish pronephros by a novel migration route to initiate adult hematopoiesis. Development. 135, 1853-1862 (2008).
  6. Bertrand, J. Y., et al. Definitive hematopoiesis initiates through a committed erythromyeloid progenitor in the zebrafish embryo. Development. 134, 4147-4156 (2007).
  7. Ma, D., Zhang, J., Lin, H. F., Italiano, J., Handin, R. I. The identification and characterization of zebrafish hematopoietic stem cells. Blood. 118, 289-297 (2011).
  8. Lam, E. Y., Hall, C. J., Crosier, P. S., Crosier, K. E., Flores, M. V. Live imaging of Runx1 expression in the dorsal aorta tracks the emergence of blood progenitors from endothelial cells. Blood. 116, 909-914 (2010).
  9. Lam, E. Y., et al. Zebrafish runx1 promoter-EGFP transgenics mark discrete sites of definitive blood progenitors. Blood. 113, 1241-1249 (2009).
  10. Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106, 3803-3810 (2005).
  11. Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
  12. Weinstein, B. M., et al. Hematopoietic mutations in the zebrafish. Development. 123, 303-309 (1996).
  13. Ransom, D. G., et al. Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis. Development. 123, 311-319 (1996).
  14. Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).
  15. Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383, 829-832 (1996).
  16. Yeh, J. R., et al. Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation. Nat Chem Biol. 5, 236-243 (2009).
  17. Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis. Zebrafish. 7, 61-68 (2010).
  18. Ridges, S., et al. Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia. Blood. 119, 5621-5631 (2012).
  19. North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
  20. Astuti, Y., et al. A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing. Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).
  21. Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
  22. Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241, 58-62 (1988).
  23. Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1, 661-673 (1994).
  24. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
  25. Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nat Med. 3, 1337-1345 (1997).
  26. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183, 1797-1806 (1996).
  27. Gansner, J. M., et al. Sorting zebrafish thrombocyte lineage cells with a Cd41 monoclonal antibody enriches hematopoietic stem cell activity. Blood. 129, 1394-1397 (2017).
  28. Smith, A. C., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115, 3296-3303 (2010).
  29. Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat Protoc. 5, 383-394 (2010).
  30. de Jong, J. L., et al. Characterization of immune-matched hematopoietic transplantation in zebrafish. Blood. 117, 4234-4242 (2011).
  31. Wolf, A., et al. Zebrafish Caudal Haematopoietic Embryonic Stromal Tissue (CHEST) Cells Support Haematopoiesis. Sci Rep. 7, 44644 (2017).
  32. Campbell, C., et al. Zebrafish embryonic stromal trunk (ZEST) cells support hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) proliferation, survival, and differentiation. Exp Hematol. 43, 1047-1061 (2015).
  33. Svoboda, O., et al. Dissection of vertebrate hematopoiesis using zebrafish thrombopoietin. Blood. 124, 220-228 (2014).
  34. Stachura, D. L., et al. The zebrafish granulocyte colony-stimulating factors (Gcsfs): 2 paralogous cytokines and their roles in hematopoietic development and maintenance. Blood. 122, 3918-3928 (2013).
  35. Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118, 1274-1282 (2011).
  36. Stachura, D. L., et al. Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis. Blood. 114, 279-289 (2009).
  37. Svoboda, O., et al. Ex vivo tools for the clonal analysis of zebrafish hematopoiesis. Nat Protoc. 11, 1007-1020 (2016).
  38. Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110, 2718-2726 (2007).
  39. Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 133, 11-53 (2016).
  40. Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
  41. Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111, 1131-1137 (2008).
  42. Henninger, J., et al. Clonal fate mapping quantifies the number of haematopoietic stem cells that arise during development. Nat Cell Biol. 19, 17-27 (2017).
  43. Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160, 241-252 (2015).
Zebra balığı embriyo geliştirilmesinde bir <em>Vitro</em> tahlil hematopoetik kök ve yaratıcı Quantitate gelişimi (HSPCs) hücreleri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berrun, A. C., Stachura, D. L. Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (129), e56836, doi:10.3791/56836 (2017).More

Berrun, A. C., Stachura, D. L. Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (129), e56836, doi:10.3791/56836 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter