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Developmental Biology

Développement d’un test In Vitro pour doser les progéniteurs et souches hématopoïétiques cellules (HSPCs) dans le développement des embryons de poisson-zèbre

doi: 10.3791/56836 Published: November 30, 2017

Summary

Nous présentons ici une méthode simple pour quantifier les cellules hématopoïétiques souches et progénitrices (HSPCs) chez le poisson zèbre embryonnaire. HSPCs de poisson-zèbre dissocié sont plaqués en méthylcellulose facteurs favorables, DIFFERENCIATION en sang mature. Cela permet la détection du sang des défauts et permet aux médicaments de dépistage doit être réalisée facilement.

Abstract

L’hématopoïèse est un processus cellulaire essentiel dans lequel des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPCs) se différencient en la multitude de lignées cellulaires qui composent le sang mature. Isolement et identification de ces HSPCs est difficile parce qu’ils sont définis ex post facto; ils ne peuvent être définis qu’après leur différenciation en lignées cellulaires spécifiques. Dans les dernières décennies, le poisson zèbre (Danio rerio) est devenu un organisme modèle pour étudier l’hématopoïèse. Développent ex uterodes embryons de poisson-zèbre et par fécondation après 48 h (hpf) ont généré définitif HSPCs. tests afin d’évaluer la différenciation HSPC et capacités de prolifération ont été développées, utilisant la transplantation et suivantes reconstitution du système hématopoïétique en plus de la visualisation des lignées transgéniques spécialisées avec la microscopie confocale. Cependant, ces essais sont coût prohibitif, techniquement difficile et chronophage pour de nombreux laboratoires. Développement d’un modèle in vitro pour évaluer HSPCs serait rentable, plus rapide, et présentes moins de difficultés par rapport à précédemment décrit les méthodes, permettant aux laboratoires d’évaluer rapidement des écrans mutagenèse et de drogues qui affectent la biologie HSPC. Cette analyse roman in vitro pour évaluer HSPCs est réalisée par les embryons de poissons zèbres entier de placage dissociée et ajout des facteurs exogènes qui favorisent seulement la CSPH différentiation et la prolifération. Embryons sont dissociés en cellules individuelles et plaqués avec HSPC conciliants facteurs stimulants de colonie qui les amènent à générer des unités formant colonies (UFC) qui proviennent d’une cellule unique ancêtre. Ces tests devraient permettre un examen plus attentif des voies moléculaires responsables de la prolifération, la différenciation et la réglementation, ce qui permettra aux chercheurs de comprendre les fondements de l’hématopoïèse vertébré et son dérèglement HSPC au cours de la maladie.

Introduction

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L’hématopoïèse est le processus de fabrication de la multitude de cellules sanguines matures nécessaires à la survie de l’organisme. C’est un processus de développement clé qui implique la différenciation de cellules souches hématopoïétiques (CSH) dans une variété de types de cellules développemental restreinte qui composent le sang mature. Ces CSH doit se renouveler afin que le système n’est jamais épuisé et ils doivent persister depuis le début du développement embryonnaire jusqu'à la mort. Chez les vertébrés, la constante différenciation et la prolifération des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPCs) sont nécessaires pour remplir adéquatement la majorité des cellules sanguines qui sont post-mitotiques et être recyclé tous les jours. CSH génère des cellules sanguines matures en premier différenciant en sous-ensembles de cellules progénitrices restreinte ; commune cellules souches lymphoïdes (SPDP)1, qui finit par produire des cellules T et B NK et commune progéniteurs myéloïdes (CMPs)2 qui génèrent les granulocytes, les érythrocytes, les macrophages et les mégacaryocytes. Ces cellules souches se sont engagés à générer des lignées cellulaires spécifiques et davantage se différencient en plus progéniteurs développemental restreints tels que les progéniteurs érythroïdes myéloïde (députés) qui génèrent des érythrocytes et des plaquettes ou des granulocytes progéniteurs de macrophages (BPF) qui génèrent des basophiles, éosinophiles, neutrophiles et les macrophages2. Identifier et isoler ces cellules souches permettent l’identification d’importants mécanismes moléculaires impliqués dans la différenciation hématopoïétique et de nombreuses maladies hématopoïétiques telles que la leucémie se posent lorsque ces cellules progénitrices ne pas correctement faire la différence.

Dans les dernières décennies, le système de modèle de poisson zèbre (Danio rerio) est devenu un outil de recherche d’études hématopoïétiques embryonnaires et adultes. Poisson zèbre se prêtent à des analyses génétiques et sont les espèces de vertébrés modèle phylogénétiquement plus bas qui ont une vascularisation similaire et le système hématopoïétique aux humains. Développent des embryons de poisson-zèbre ex utero, et dans les 48 heures après la fécondation (hpf) générer HSPCs3,4,5,6,7,8. Poisson zèbre sont également très fécondes, les femelles portant sur 100 oeufs dans une seule couvée, permettant la réplication expérimentale et de vastes échantillons. Des embryons de poisson-zèbre sont optiquement transparentes, permettant une visualisation microscopique du système hématopoïétique. Plusieurs lignées transgéniques fluorescentes de poisson-zèbre marquage autorenouveler comme runx1: EGFP poisson9, cd41: EGFP pêcher10, et kdrl :mCherry ; CMJN: GFP3 double-positifs animaux, permettent pour la visualisation en temps réel de HSC émergence et l’expansion in vivo3,4,7,8, 9. Génération rapide temps et développement ex utero du poisson-zèbre a mené à son utilisation en mutagénèse études11,12,13,14,15 et drogues le dépistage de16,17,18,19,20 pour les composés qui sont thérapeutiques prometteuses pour troubles du sang humain. Dans l’ensemble, conservation du système hématopoïétique, la présence et le développement facile des lignées transgéniques et l’heure de régénération rapide a fait le poisson-zèbre, un modèle peu coûteux, rapide, flexible et idéal pour les études hématopoïétiques.

Nombreuses méthodes d’isolement et CSH ont été développés dans des systèmes hématopoïétiques chez les mammifères. Les enquêteurs peuvent utiliser une combinaison de récepteurs membranaires à Marc autorenouveler21,22,23,24, en plus d’exploiter la capacité des CSH à efflux colorant25,26. Après qu’ils sont étiquetés, cellule activée par fluorescence triant (FACS) permet leur séparation physique. Ce qui prouve qu’une cellule est un HSC nécessite irradier un animal hôte pour détruire HSPCs endogènes, repiquage autorenouveler putatif et en observant les reconstitution à long terme, lignée multiples de tous matures des types de cellules sanguines. Ces tests fonctionnent bien chez la souris, comme il y a de nombreux anticorps de surface cellulaire contre les cellules hématopoïétiques et souches de souris consanguines qui facilitent le système immunitaire correspondant à la transplantation. Cependant, quelques poissons zèbres hématopoïétiques anticorps de surface cellulaire ont été généré27, empêchant l’identification et l’isolement des CSH. La façon la plus courante pour marquer et isoler le poisson-zèbre CSH est avec des animaux transgéniques, selon lequel une séquence promotrice de la spécificité cellulaire est le moteur expression de la protéine fluorescente. Études ont visualisé et énuméré les CSH dans la paroi ventrale de l’aorte dorsale au microscope utilisant cette technique3,4,8,9. Autres laboratoires ont généré des souches clonales du poisson-zèbre28,29 et ont effectué des greffes réussies dans animaux appariés MHC30. Toutefois, ces techniques sont inabordable pour de nombreux laboratoires, sont techniquement difficiles et demandent beaucoup de temps. Pour résoudre ces problèmes, les laboratoires ont généré plusieurs essais in vitro pour tester la présence, le taux de prolifération et la capacité de différenciation des HSPCs31,32,33, 34,35,,36. Ces tests montrent la prolifération et la différenciation des HSPCs in vitro31,32,33,34,35,36, le sauvetage des hématopoïétiques défauts36et une méthode efficace pour découvrir et tester les cytokines33,34,35. Ils ont également été utilisés pour identifier les gènes responsables de la CSPH biologie31,32. Dans cette étude, nous prenons ces tests un peu plus loin, ce qui permet le dosage des HSPCs dans un embryon de poisson zèbre. Ces tests peuvent également être utilisées pour quantifier le nombre de HSPCs chez les animaux mutants et animaux traités avec des médicaments hématopoïétiques sans interruption. Essentiellement, ces tests sont rapides, présentes quelques difficultés techniques et des moyens peu coûteux pour quantifier les numéros HSPC, examiner leur prolifération et enquêter sur les blocs dans la différenciation.

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Protocol

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Le Conseil consultatif institutionnel animalier et utilisation Comité (IACUC) à la California State University, Chico, approuvé toutes les méthodes décrites ci-dessous.

1. eau de Javel 48 hpf embryons de poisson-zèbre

  1. Avec 15 cm x 15 (w) cm (l) x contenants de plastique de 7 cm (h) créer des stations de lavage 3 : 1) avec 1 mL d’eau de Javel 5 % dans 1000 mL de milieu d’embryon (E3 ; voir tableau 1), 2) avec E3 stérile et 3) E3 stérile. Veiller à ce que chaque conteneur possède 500 mL de solution de submerger les embryons dans.
    Remarque : Pour chaque condition testée, au moins 10 embryons seront nécessaires. Cette procédure de lavage peut accueillir jusqu'à 200 embryons.
  2. Avec une pipette de transfert, placez les embryons dans une passoire à thé et plonger les oeufs dans la station de lavage #1 pour 5 min. Retirez la passoire à thé (avec des embryons à l’intérieur) et placez dans la station de lavage #2 pendant 5 min ; Répétez pour station de lavage #3 pour un final 5 min.
  3. Après le dernier lavage, rinçage des embryons de passoire à thé en tournant à l’envers sur une boîte de Petri propre de 10 cm et rincer doucement les embryons au large de la passoire à thé avec E3 stérile et une pipette de transfert.

2. Dechorionate embryons

  1. Avec une pipette de transfert, enlever et jeter autant E3 que possible de la boîte de Pétri et ajouter 500 μl de dechorionation protéase (10 mg/mL) aux embryons. Incuber à température ambiante pendant 5 min. Tapotez doucement le côté de la boîte de Pétri pour supprimer complètement les chorions.
  2. Avec une pipette sérologique, ajouter 20 mL d’E3 stérile pour diluer la protéase. Permettre aux embryons de s’installer et supprimer l’E3 avec une pipette de transfert. Répétez cette étape de lavage 3 fois pour éliminer toute trace de la protéase de dechorionation.

3. préparation des échantillons de l’embryon

  1. À l’aide d’une pipette P1000, placez 10 embryons dans un tube de microcentrifuge unique stérile de 1,5 mL.
  2. Retirer l’E3 avec une pipette et jeter.
    ATTENTION : Pipetter avec soin car les embryons peuvent facilement être déplacées et rejetées au cours des étapes de lavage suivant.

4. préparation des embryons de Dissociation

  1. Transférer des échantillons de hotte à flux laminaire et laver les embryons en ajoutant 1 mL stérile E3. Permettre aux embryons se déposent au fond du tube et éliminer le surnageant avec une pipette P1000. Répéter pour un total de 3 lavages.
  2. Après le dernier lavage, enlever E3 et jeter. Ajouter 1 mL de 10 mM le dithiothréitol (DTT) en E3 pour enlever la couche de mucus (et spores, levure ou les bactéries qui peuvent être piégés dedans) qui entoure le poisson-zèbre embryonnaire. Poser des tubes de microcentrifuge horizontalement et incuber à température ambiante sous hotte à flux laminaire pour 25 min.

5. embryon Dissociation

  1. Laver l’échantillon 3 fois avec 1 mL de SPD stérile (avec Ca2 + , Mg2 +). Après le dernier lavage Ajouter 500 μl de SPD (avec Ca2 + , Mg2 +) et ajouter 5 μl de protéase de dissociation de 5 mg/mL (26 U/mL).
    ATTENTION : Cette enzyme a besoin de Ca2 + et Mg2 +, donc vous assurer que le SPD contienne ces ions.
  2. Incuber les échantillons à 37 ° C dans un agitateur orbital horizontal à 180 tr/min à 60 min. des échantillons de Place dans la hotte à flux laminaire et triturer les embryons avec un P1000 jusqu'à ce que les échantillons sont complètement dissociées.
    ATTENTION : Vérifier périodiquement pour déterminer quand ils deviennent dissociés des embryons. La solution de l’embryon doit avoir une quantité de tissu présent ; il ne devrait pas être complètement homogène. Il est possible de digérer excessive, qui détruira les HSPCs (voir la Figure 1).

6. préparation des embryons dissociés

  1. Embryons de pipette le 10 dissocié sur le réservoir supérieur d’un polystyrène de 5 mL rond tube inférieur avec un bouchon de crépine de cellule 35 μm.
  2. Avec une pipette, rincer le tube de Petri avec PBS stérile (sans et Ca2 + Mg2 +) et la solution de transfert de 5 mL tube en polystyrène contenant filtré les cellules de l’étape 6.1. Répétez jusqu'à ce que 4 mL de liquide est présent dans le tube de 5 mL en polystyrène.
    NOTE : PBS, SPD ou autres solutions tampon isotoniques peuvent être utilisées à ce stade, tant qu’ils ne contiennent pas de Ca2 + ou Mg2 +
  3. Centrifuger les tubes à 4 ° C et 300 x g pendant 5 min granuler l’échantillon homogénéisé cellulaire. Avec une pipette, retirer et jeter le surnageant du tube fond rond. Prenez soin de ne pas perturber les cellules granulés au fond du tube. Remettre en suspension les cellules dans 100 μl de PBS.

7. préparation de méthylcellulose

  1. Générer la solution stock de méthylcellulose complète (tableau 1) 1 x et ajouter 2,5 mL de tubes stériles fond rond 14 mL mL 3 seringues et aiguilles de 16 G. Utiliser un tube pour chaque condition testée.
  2. Ajouter des cytokines, petites molécules ou autres agents pour être étudiés dans chaque échantillon.
    1. De différenciation myéloïde, ajouter 1 % carpe sérum et 0,3 mg/mL zebrafish recombinants des colonies de granulocytes stimulant facteur (GC & SF)34 au milieu de la méthylcellulose. Voir Svoboda et al. 37 pour la description complète sur la façon de générer des cytokines de sérum et recombinant carpe.
    2. Pour la différenciation érythroïde, ajouter 1 % carpe sérum et 0,1 mg/mL zebrafish recombinant érythropoïétine (Epo)38 au milieu de la méthylcellulose.
    3. Pour examiner les progéniteurs multilignées, ajouter Epo et GC & SF.
      ATTENTION : Cytokines et additifs doivent total pas plus de 10 % du volume total, comme le milieu ne seront pas suffisamment visqueux pour discerner les colonies individuelles.

8. Ajout d’embryons dissociés de méthylcellulose

  1. À l’aide d’une pipette, ajouter 100 μL des dissociation 10 embryons à la surface de la méthylcellulose préparé avec du sérum de cytokines et carp recombinant. Bouchon couvercle et vortex doucement pour bien homogénéiser échantillon. Chaque tube doit maintenant contenir les tissus dissociés des 10 embryons.
  2. À l’aide de seringues de 3 mL et G 16 aiguilles, aliquote 1 mL d’échantillon dans les 2 boîtes de Pétri séparé de 35 mm. S’assurer que l’échantillon est entièrement dispersée tout au long de la boîte de Pétri. Répétez pour chaque échantillon.
  3. Placer les plats de Pétri de 35 mm avec des cellules dans méthylcellulose dans une boîte de Pétri de 15 cm. À chaque plat de 15 cm, ajouter une plaque de Petri 35 mm avec 5 mL d’eau stérile pour humidifier les échantillons. Incuber à 32 ° C et 5 % de CO2 pendant 7 à 10 jours.

9. visualisation des unités (UFC) formant des colonies HSPC dérivés

  1. Après incubation de 7 jours, placer les échantillons sur un microscope inversé à X 40-100 pour la visualisation et l’énumération. À ce stade, les colonies individuelles peuvent être isolés avec une pipette et soumis à l’analyse de coloration ou de gène.

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Representative Results

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Pour évaluer les numéros HSPC chez le poisson zèbre embryonnaire, 48 embryons hpf ont été digérés, plaqués en méthylcellulose présentant des facteurs de croissance hématopoïétiques conciliants exogènes et incubés pendant 7 jours (Figure 1A). Après 7 jours, unités formant colonies (UFC) ont été énumérés (Figure 1B) et représentation (Figure 1C). En contrôlant les différentes cytokines ajoutés, on peut contrôler les types de colonies produites : l’Epo est nécessaire à la différenciation érythroïde et GC & SF est nécessaire à la différenciation myéloïde. Sérum de carpe est analogue à l’utilisation de sérum de veau fœtal en culture de tissus chez les mammifères ; C’est une source de facteurs de croissance générales. Dans la Figure 1, OEB, GC & SF et sérum de carpes ont été ajoutés, ce qui permet l’énumération d’érythroïdes, colonies erythromyeloid myéloïde et mixtes. On peuvent discerner ces colonies en raison de leur forme et leur couleur ; les colonies érythroïdes sont serrés, petite et compacte et ont une couleur rouge en raison de hemoglobinization. Les colonies myéloïdes sont plus grandes et ont plus de cellules mobiles sur leurs bords, leur donnant un aspect ébouriffé.

Succès d’électrodéposition de poisson-zèbre embryonnaire traité avec HSPC conciliants facteurs rapportera UFC après 7-10 jours d’incubation. Ce qui est important, la quantité d’UFC est directement en corrélation avec le nombre d’embryons plaqué (Figure 1B). 4 ou 8 embryons / mL (ce qui correspond à partir de 10 ou 20 embryons au début de l’expérience) de placage donne environ de 1 200 ou 2 400 UFC, respectivement. Notre protocole suggère d’utiliser 10 embryons, car il est difficile et fastidieux de compter 2 400 UFC lorsque vous effectuez une plus grande expérience. En raison de la méthodologie de digérer les embryons entiers, débris divers est présent dans la méthylcellulose, mais on peut facilement discerner des colonies réelles avec un grossissement supérieur sous le microscope. Autres débris cellulaires peuvent également être présents, mais le seul UFC présent sera HSPC dérivés en raison de l’ajout des cytokines HSPC conciliants. Si UFC est petites et pas faciles à voir, les cultures peuvent être incubés jusqu'à 10 jours pour encourager une croissance accrue. Cependant, incubation accrue ne donneront pas plus UFC ; Si l’UFC n’est pas présents, cela indique une perte d’activité de cytokine, au cours de la digestion des embryons (et la destruction subséquente des HSPCs ; voir la Figure 1), ou le revêtement incorrecte des échantillons. Il est toujours important d’exécuter des contrôles appropriés chaque fois que cette expérience est effectuée afin de s’assurer que légères variations dans la technique ne donnent pas de fausses différences dans l’énumération HSPC. Par exemple, si une expérience est réalisée afin d’analyser le nombre de HSPCs présentes dans les embryons morphant, un échantillon avec des frères et soeurs normales doit être préparé aux côtés. Si une expérience est réalisée pour comparer l’effet d’un médicament sur le développement de HSPCs élaborerait un échantillon avec des frères et sœurs non traités et analysé aux côtés.

Figure 1
Figure 1 : Dérivés énumérant HSPC UFC de 48 embryons de poisson-zèbre hpf. (A) aperçu schématique de l’électrodéposition embryon sur méthylcellulose avec cytokines HSPC conciliants pour génération d’UFC hématopoïétique. 48 embryons de poisson-zèbre de hpf ont été dissociées et plaqués sur 1 % de méthylcellulose complète d’érythropoïétine (Epo), le facteur stimulant de colonies de granulocytes (GC & SF) et sérum de carpe, permettant une différenciation erythromyeloid. (B) dénombrement de colonies formant des unités (UFC) d’échantillons plaqués à des concentrations de 4 ou 8 embryons par mL (commençant l’expérience avec des embryons de 10 ou 20, respectivement). Énumération a été faite à 100 X sur un microscope inversé. Les barres indiquent le nombre moyen d’UFC, et barres d’erreur indiquent la déviation standard. (C) la morphologie des colonies représentative de l’électrodéposition d’embryon sur méthylcellulose. La morphologie de la colonie indique les types de cellules qui composent la colonie ; les images sont représentatives érythroïdes et colonies myéloïdes. CFU photographié à 400 X. Barreaux de l’échelle = 50 μm.  S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Supplemental Figure 1
Supplémentaire Figure 1 : Digestion des embryons avec protéase de dissociation. (A) Images de 10 embryons avant la digestion (à gauche, non digérée), après une digestion adéquate (milieu, digéré) et après digestion excès (droite ; plus digéré). (B) Zoomed en images (7.3 X) des tubes digérés digérés et plus dans (A). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

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Le système de modèle de poisson-zèbre est devenu un modèle efficient, efficace et peu coûteux pour étudier l’hématopoïèse vertébré primitif et définitive. Génération de tests qui sont rapides, peu coûteux et présenter quelques difficultés techniques peut être utilisée pour les essais de petites molécules, analysant les embryons mutants et élucider les voies moléculaires importantes pour la biologie HSPC. In vitro un placage de HSPCs de poisson-zèbre adulte est une méthode efficace pour étudier la mutagenèse, cytokines et défauts hématopoïétiques. Ce protocole repose sur ces études, mais utilise zebrafish embryonnaire. Appliquant ces dosages à zebrafish embryonnaire pour la collecte de données plus rapide, l’utilisation de l’espace physique, l’utilisation de moins de médicaments (pour les écrans de drogues) et permet de surexpression d’ARNm test et/ou knockdown morpholino (MO) de voies génétiques spécifiques. Ce qui est important, il permet également l’étude des étapes de l’hématopoïèse qui se produisent seulement au début du développement vertébré.

En raison de la flexibilité de ce test, facilement modifiable pour répondre aux nombreux besoins divers. Une modification du présent protocole est la modulation de la synchronisation du développement ; modification de l’âge d’embryons utilisés permet la quantification de la génération CSPH au fil du temps. Cela peut permettre également à l’étude des sous-ensembles distincts de HSPCs comme erythromyeloid progéniteurs6, qui surviennent avant 36 hpf, versus bona fide autorenouveler3,4,5,8, qui se posent par la suite. Personne n’a encore été en mesure d’isoler et d’identifier les sous-ensembles HSPC zebrafish plus restreints dans l’embryon en développement, mais ces tests permettent à ces expériences. Il est essentiel que lors du changement des stades de croissance des animaux, la quantité de cellules ajoutées dans la méthylcellulose est également optimisée ; trop peu d’animaux ne donnera aucune colonie, alors que de trop nombreux créera une plaque qui ne compte pas de colonies HSPC. L’ajout de différentes cytokines est une autre modification qui peut être adaptée à des expériences spécifiques. Ajouter Epo permettra de la quantification des colonies érythroïdes, tandis que gc & SF permettront de dénombrement des colonies myéloïdes. Ajouter les deux de ces cytokines permettra de génération UFC lignée multiples. Ce qui est important, ces tests de permettent à l’épreuve des cytokines putatif et leur effet sur HSPC prolifération et la différenciation. Ces tests peuvent également être modifiées pour effectuer le dépistage des drogues à grande échelle ; les embryons peuvent être exposés à différentes concentrations de composés à différents moments au cours du développement pour voir si les produits chimiques ont un effet positif ou négatif sur la production de sang. Un dernier trajet que ces expériences peuvent être modifiés est que les embryons peuvent être injectés au stade unicellulaire avec ARNm spécifique ou MOs, qui seront surexpriment ou des gènes spécifiques knockdown, respectivement. Après avoir développé pendant 24 à 48 heures, ces embryons peuvent être soumis à ces tests pour déterminer si le gain - ou perte de fonction de gènes spécifiques jouent un rôle essentiel dans la formation, la prolifération et la différenciation HSPC. Il est également important de noter qu’utilisant différentes souches transgéniques de poisson-zèbre contribuera à la rapidité et la facilité de la collecte et l’interprétation des données. Par exemple, si l'on s’intéresse au développement érythroïde, il est facile de réaliser ces expériences en gata1: DsRed embryons40, qui ont le promoteur érythroïdes spécifiques transgénique Gata1 transcription du facteur de conduite DsRed fluorescence. De cette façon, lors de l’analyse des colonies érythroïdes, microscopie à fluorescence peut être utilisée. De même, ces études sont possibles sur animaux avec plusieurs transgènes présents à rechercher à la fois plusieurs lignées cellulaires. Cette technique serait utile pour l’identification multilignées HSPCs ; Bien qu’érythroïdes et colonies myéloïdes sont facilement reconnaissables par la morphologie, il est difficile d’identifier les colonies qui contiennent des progéniteurs bipotential sans visualisation de la présence de l’expression spécifique à la lignée transgénique multiples dans la même colonie .

Ces tests ont de nombreux avantages, mais il est essentiel de mettre en place des contrôles adéquats chaque fois que ces expériences sont réalisées ; des variations mineures dans la technique pourraient changer les résultats et les interprétations des résultats. Par exemple, il est possible d’obtenir un nombre différent de HSPCs lorsque vous effectuez les expériences sur des jours différents, si votre technique n’est pas précis ; pour faire face à cette possibilité, on devrait toujours inclure un contrôle approprié. Si une expérience est réalisée pour tester l’effet d’un MO sur le développement, puis contrôler les embryons (soit non injecté avec un contrôle MO) qui proviennent de l’embrayage même doit également être traitée aux côtés de l’échantillon expérimental. Si l’expérience est conçue pour tester les effets d’un médicament particulier, échantillons non traités devraient être inclus comme un contrôle. Enfin, si tester les effets d’une cytokine spécifique sur le développement, puis animaux de l’embrayage même doit également être traitée et examiné en même temps sans avoir la cytokine ajoutée à la culture.

Bien que ce test in vitro est simple à effectuer et les résultats sont faciles à interpréter, certains problèmes potentiels peuvent survenir au cours de la procédure. Si aucune colonie n’est visibles après 7 jours de culture, il y a plusieurs questions qui aurait pu se produire. Tout d’abord, vérifiez que les cytokines sont purs et à des concentrations appropriées ; selon comment les cytokines ont été produites, il peut être nécessaire de modifier les concentrations et d’optimiser leur activité. Une autre question souvent soulevée est trop digérer les embryons, qui détruit les HSPCs ; prendre soin à l’étape de digestion et modifier le calendrier, si aucune colonie n’est vus à plusieurs reprises. Enfin, le mélange de méthylcellulose et ajout du sérum de la carpe pourrait être le problème, alors assurez-vous que tous les ingrédients ont été ajoutés et mélangés correctement. Outre les questions techniques, il est important de réaliser que les colonies ait besoin de plus de développer dans certaines circonstances ; souvent de petites colonies sont beaucoup plus visibles après 3 jours additionnels dans la culture. Avoir passé 10 jours n’est pas recommandé, car la méthylcellulose commence à se dessécher peu après. Un autre problème courant est que colonies ont parfois tendent à percevoir sur les bords de la Pétri de 35 mm ; les plaques d’analyse soigneusement, surtout sur les bords, est essentiel. En outre, il est important de se rappeler que ces colonies sont développent en une substance épaisse et visqueuse ; Lorsque la mise au point du microscope, ajuster le focus up et down pour observer un peu différents plans-les colonies ne sera pas assis sur le fond de la vaisselle en plastique.

Ces tests in vitro ont beaucoup d’avantages, mais ils ont aussi quelques limitations. Le plus grand problème est que ces tests ne peut pas prouver définitivement qu’un progéniteur est un HSC-qui seulement peut être prouvée par une reconstitution à long terme des animaux irradiés. En outre, pas toutes les cytokines ont été définies et étudiées chez le poisson zèbre encore, qui limite les types de HSPCs qui peuvent être l’objet d’une enquête. Par exemple, aucun cytokines lymphoïdes conciliants de poisson-zèbre n’ont été identifiés encore, empêchant la production de lymphocytes B et T dans ces essais. En outre, on ignore quand culture multipotentes HSPCs si l’ajout de certains types (ou montants) de cytokines spécifiques pouvant fausser la différenciation vers le bas de certaines voies hématopoïétiques. Une autre restriction éventuelle est que ce test ne peut pas discerner efficacement si les HSPCs sont effectivement présents dans un échantillon, mais pour une raison quelconque ne peuvent pas faire la différence (ou dans le cas contraire, ne sont pas viables). Comme pour la plupart en vitro tests, autres expériences devraient toujours être effectuées pour valider les résultats. Si l'on excepte ces questions, beaucoup d’informations peut être tiré de ces tests clones.

Ces tests sont importants, car ils permettent un dépistage rapide et efficace des défauts hématopoïétiques. Les chercheurs peuvent abattre certaines voies génétiques avec MOs, et plaque digérées animaux pour voir si le gène joue un rôle dans l’hématopoïèse. En outre, poissons mutants (précédemment généré ou nouvellement généré dans les écrans de mutagénèse) peuvent être évaluées rapidement et facilement. Ces tests permettent aussi de médicament efficace des tests de dépistage sur les organismes vivants, entiers pour identifier la modulation de la biologie de la CSPH tout en étant en mesure d’observer si les médicaments ont un effet négatif sur le développement ou la survie. Ces tests permettent également le dosage des HSPCs dans le poisson-zèbre en développement à différents intervalles. Alors que plusieurs études ont tenté de quantifier le nombre de HSC dans adultes7,27,30,41 et embryon de poisson zèbre3,4,,42, 43, aucune étude n’ont quantifié les différentes quantités de restriction lignée HSPCs chez le poisson zèbre. En outre, ces tests peuvent être utilisés pour examiner et moduler les voies moléculaires importantes dans la formation des globules et différenciation, un processus qui reste énigmatique.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Financé par le National Institutes of Health (NIH : K01-DK087814-01 a 1 à D.L.S.), Program de la California State University pour l’éducation et de recherche en biotechnologie (CSUPERB : contrôle moléculaire de la Niche hématopoïétiques vertébrés à D.L.S.) et du Bureau des études supérieures au California State University Chico (à A.C.B.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Bovine Serum Albumin in Iscove's MDM StemCell Technologies  9300
DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+ Life Technologies 14080-055
HyClone PBS (1x) GE Healthcare Life Sciences sh30256.01
 DMEM 500 mL Corning CellGrow 10-017-CV
 Ham's F12 500 mL Corning CellGrow 10-080-CV
FBS 500 mL Gemini Bio-Products 100-108
HEPES 100 mL (1 M) Gibco life technologies 15-630-080
Penicillin/streptomycin (5000 U/mL
and 5000 mg/mL) with L-Glutamine (200 mM)
Corning Mediatech 30-009-CI
Gentamycin Sulfate 10 mL (50 mg/mL) Corning Mediatech 30-005-CR
1.5 mL MCF tube FisherBrand 05-408-129
3 mL 23gx1 injection needle with Luer lock BD Safety Glide 305905
5 mL polystyrene round bottom tube with cell strainer cap Corning Falcon 352235
Methocel MC Sigma-Aldrich 64630
14 mL Polystyrene round bottom tube Corning Falcon 352057
10 mm polystyrene easygrip Petri dish Corning Falcon 351008
Librease TM Roche Sigma-Aldrich 5401119001 dissociation protease
Pronase Roche Sigma-Aldrich 11459643001 dechorionation protease
15 cm Petri dish Corning Falcon 351058
AB Zebrafish International Resource Center (ZIRC) ZL1 zebrafish strain used
Dithiolthreitol (DTT) Sigma-Aldrich 646563

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References

  1. Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
  2. Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
  3. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
  4. Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
  5. Bertrand, J. Y., Kim, A. D., Teng, S., Traver, D. CD41+ cmyb+ precursors colonize the zebrafish pronephros by a novel migration route to initiate adult hematopoiesis. Development. 135, 1853-1862 (2008).
  6. Bertrand, J. Y., et al. Definitive hematopoiesis initiates through a committed erythromyeloid progenitor in the zebrafish embryo. Development. 134, 4147-4156 (2007).
  7. Ma, D., Zhang, J., Lin, H. F., Italiano, J., Handin, R. I. The identification and characterization of zebrafish hematopoietic stem cells. Blood. 118, 289-297 (2011).
  8. Lam, E. Y., Hall, C. J., Crosier, P. S., Crosier, K. E., Flores, M. V. Live imaging of Runx1 expression in the dorsal aorta tracks the emergence of blood progenitors from endothelial cells. Blood. 116, 909-914 (2010).
  9. Lam, E. Y., et al. Zebrafish runx1 promoter-EGFP transgenics mark discrete sites of definitive blood progenitors. Blood. 113, 1241-1249 (2009).
  10. Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106, 3803-3810 (2005).
  11. Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
  12. Weinstein, B. M., et al. Hematopoietic mutations in the zebrafish. Development. 123, 303-309 (1996).
  13. Ransom, D. G., et al. Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis. Development. 123, 311-319 (1996).
  14. Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).
  15. Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383, 829-832 (1996).
  16. Yeh, J. R., et al. Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation. Nat Chem Biol. 5, 236-243 (2009).
  17. Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis. Zebrafish. 7, 61-68 (2010).
  18. Ridges, S., et al. Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia. Blood. 119, 5621-5631 (2012).
  19. North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
  20. Astuti, Y., et al. A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing. Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).
  21. Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
  22. Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241, 58-62 (1988).
  23. Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1, 661-673 (1994).
  24. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
  25. Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nat Med. 3, 1337-1345 (1997).
  26. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183, 1797-1806 (1996).
  27. Gansner, J. M., et al. Sorting zebrafish thrombocyte lineage cells with a Cd41 monoclonal antibody enriches hematopoietic stem cell activity. Blood. 129, 1394-1397 (2017).
  28. Smith, A. C., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115, 3296-3303 (2010).
  29. Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat Protoc. 5, 383-394 (2010).
  30. de Jong, J. L., et al. Characterization of immune-matched hematopoietic transplantation in zebrafish. Blood. 117, 4234-4242 (2011).
  31. Wolf, A., et al. Zebrafish Caudal Haematopoietic Embryonic Stromal Tissue (CHEST) Cells Support Haematopoiesis. Sci Rep. 7, 44644 (2017).
  32. Campbell, C., et al. Zebrafish embryonic stromal trunk (ZEST) cells support hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) proliferation, survival, and differentiation. Exp Hematol. 43, 1047-1061 (2015).
  33. Svoboda, O., et al. Dissection of vertebrate hematopoiesis using zebrafish thrombopoietin. Blood. 124, 220-228 (2014).
  34. Stachura, D. L., et al. The zebrafish granulocyte colony-stimulating factors (Gcsfs): 2 paralogous cytokines and their roles in hematopoietic development and maintenance. Blood. 122, 3918-3928 (2013).
  35. Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118, 1274-1282 (2011).
  36. Stachura, D. L., et al. Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis. Blood. 114, 279-289 (2009).
  37. Svoboda, O., et al. Ex vivo tools for the clonal analysis of zebrafish hematopoiesis. Nat Protoc. 11, 1007-1020 (2016).
  38. Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110, 2718-2726 (2007).
  39. Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 133, 11-53 (2016).
  40. Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
  41. Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111, 1131-1137 (2008).
  42. Henninger, J., et al. Clonal fate mapping quantifies the number of haematopoietic stem cells that arise during development. Nat Cell Biol. 19, 17-27 (2017).
  43. Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160, 241-252 (2015).
Développement d’un test <em>In Vitro</em> pour doser les progéniteurs et souches hématopoïétiques cellules (HSPCs) dans le développement des embryons de poisson-zèbre
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Berrun, A. C., Stachura, D. L. Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (129), e56836, doi:10.3791/56836 (2017).More

Berrun, A. C., Stachura, D. L. Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (129), e56836, doi:10.3791/56836 (2017).

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