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Developmental Biology

एक इन विट्रो परख के विकास के लिए Quantitate टेम स्टेम और जनक कोशिकाओं (HSPCs) Zebrafish भ्रूण के विकास में

doi: 10.3791/56836 Published: November 30, 2017

Summary

यहाँ, हम भ्रूण zebrafish में टेम स्टेम और जनक कोशिकाओं (HSPCs) quantitate करने के लिए एक सरल विधि प्रस्तुत करते हैं । असंबद्ध zebrafish से HSPCs सहायक कारकों के साथ methylcellulose में चढ़ाया जाता है, परिपक्व रक्त में अंतर । यह रक्त दोषों का पता लगाने की अनुमति देता है और दवा स्क्रीनिंग आसानी से आयोजित किया जा करने के लिए अनुमति देता है ।

Abstract

Hematopoiesis एक आवश्यक सेलुलर प्रक्रिया है जिसमें टेम स्टेम और जनक कोशिकाओं (HSPCs) अलग कोशिका वंश कि परिपक्व रक्त शामिल की भीड़ में अंतर है । अलगाव और इन HSPCs की पहचान मुश्किल है क्योंकि वे पूर्व पोस्ट वास्तविकपरिभाषित कर रहे हैं; वे केवल विशिष्ट कोशिका वंश में उनके भेदभाव के बाद परिभाषित किया जा सकता है । पिछले कुछ दशकों से zebrafish (ढाणियो rerio) hematopoiesis का अध्ययन करने वाला एक मॉडल जीव बन गया है । Zebrafish भ्रूण पूर्व uteroविकसित, और द्वारा ४८ ज बाद निषेचन (hpf) निश्चित HSPCs. परख पैदा की है HSPC भेदभाव और प्रसार क्षमताओं का आकलन करने के लिए विकसित किया गया है, प्रत्यारोपण और बाद का उपयोग टेम प्रणाली का पुनर्गठन फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ विशेष ट्रांसजेनिक लाइनों visualizing के अलावा । हालांकि, इन परख लागत पर प्रतिबंधक हैं, तकनीकी रूप से मुश्किल है, और कई प्रयोगशालाओं के लिए समय लगता है । एक इन विट्रो मॉडल के विकास HSPCs का आकलन करने के लिए प्रभावी लागत, जल्दी होगा, और कम कठिनाइयों पहले वर्णित विधियों की तुलना में वर्तमान, प्रयोगशालाओं जल्दी mutagenesis और दवा स्क्रीन है कि HSPC जीव विज्ञान को प्रभावित का आकलन करने के लिए अनुमति देता है । इस उपंयास इन विट्रो परख HSPCs का आकलन करने के लिए असंबद्ध पूरे zebrafish भ्रूण चढ़ाना और exogenous कारकों है कि केवल HSPC भेदभाव और प्रसार को बढ़ावा देने के द्वारा किया जाता है । भ्रूण एकल कोशिकाओं में असंबद्ध और HSPC के साथ चढ़ाया सहायक कॉलोनी कारकों उत्तेजक है कि उंहें पैदा करने के लिए कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFUs) है कि एक जनक सेल से पैदा उत्तेजित । इन परख आणविक HSPC प्रसार, भेदभाव के लिए जिंमेदार रास्ते के और अधिक सावधान परीक्षा की अनुमति चाहिए, और विनियमन है, जो शोधकर्ताओं हड्डीवाला hematopoiesis और उसके dysregulation के आधार समझने के लिए अनुमति देगा रोग के दौरान ।

Introduction

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Hematopoiesis एक जीव के अस्तित्व के लिए आवश्यक परिपक्व रक्त कोशिकाओं की भीड़ बनाने की प्रक्रिया है । यह एक महत्वपूर्ण विकास प्रक्रिया है कि विकास के लिए प्रतिबंधित कोशिका प्रकार है कि परिपक्व रक्त शामिल की एक किस्म में टेम स्टेम सेल (HSCs) के भेदभाव शामिल है । इन HSCs आत्म नवीकरण करना चाहिए ताकि प्रणाली कभी नहीं थक गया है और वे जल्दी भ्रूण विकास से मृत्यु तक बनाए रखना चाहिए । रीढ़ में, लगातार भेदभाव और टेम स्टेम और जनक कोशिकाओं (HSPCs) के प्रसार के लिए पर्याप्त रूप से रक्त कोशिकाओं है कि पोस्ट कर रहे है के बहुमत की भरपाई की जरूरत है mitotic और हर दिन पुनर्नवीनीकरण किया जा रहा है । HSCs पहले प्रतिबंधित जनक कोशिकाओं के उपसमुच्चय में अंतर से परिपक्व रक्त कोशिकाओं उत्पन्न; आम लसीकावत् progenitors (CLPs)1, जो अंततः टी, बी, और NK कोशिकाओं का उत्पादन, और आम माइलॉयड progenitors (CMPs)2 कि उत्पन्न granulocytes, एरिथ्रोसाइट्स, मैक्रोफेज, और megakaryocytes. इन progenitors विशिष्ट कोशिका वंश पैदा करने के लिए प्रतिबद्ध हैं, और आगे ऐसी माइलॉयड erythroid progenitors (MEPs) के रूप में अधिक विकास प्रतिबंधित जनक कोशिकाओं में अंतर है कि एरिथ्रोसाइट्स और प्लेटलेट्स उत्पन्न, या granulocyte macrophage progenitors (GMPs) जो बेसोफिल, इयोस्नोफिल्स, न्यूट्रोफिल, और मैक्रोफेज2उत्पन्न करता है । पहचान और अलग इन progenitors टेम भेदभाव में शामिल महत्वपूर्ण आणविक रास्ते की पहचान की अनुमति देता है और ल्यूकेमिया जैसे कई टेम रोगों उठता है जब इन जनक कोशिकाओं को ठीक करने के लिए असफल अंतर.

पिछले कुछ दशकों में, zebrafish (ढाणियो rerio) मॉडल प्रणाली भ्रूण और वयस्क टेम अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण अनुसंधान उपकरण बन गया है । Zebrafish आनुवंशिक विश्लेषण के लिए उत्तरदायी हैं और phylogenetically निम्नतम हड्डीवाला मॉडल प्रजातियाँ हैं जो मनुष्यों को एक समान vasculature और टेम प्रणाली है. Zebrafish भ्रूण पूर्व utero विकसित, और ४८ घंटे के भीतर निषेचन के बाद (hpf) उत्पंन HSPCs3,4,5,6,7,8। Zebrafish भी अत्यधिक उपजाऊ हैं, महिलाओं के साथ एक ही क्लच में १०० से अधिक अंडे बिछाने, बड़े नमूना आकार और प्रयोगात्मक प्रतिकृति के लिए अनुमति देता है । Zebrafish भ्रूण ऑप्टिकली पारदर्शी हैं, टेम प्रणाली के सूक्ष्म दृश्य के लिए अनुमति देता है । zebrafish के कई फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक लाइनें ऐसी runx1के रूप में HSCs अंकन: EGFP मछली9, cd41: EGFP मछली10, और kdrl:mCherry; cmyb: GFP3 डबल पॉजिटिव जानवरों, जीने के लिए अनुमति देते हैं, HSC उद्भव और विस्तार vivo3,4,7,8, 9. है zebrafish त्वरित पीढ़ी के समय और विकास के पूर्व utero mutagenesis अध्ययन में इसके उपयोग के लिए नेतृत्व किया है11,12,13,14,15 और नशीली दवाओं स्क्रीनिंग16,17,18,19,20 यौगिकों कि मानव रक्त विकारों के लिए चिकित्सीय वादा पकड़ के लिए । कुल मिलाकर, टेम प्रणाली के संरक्षण, उपस्थिति और ट्रांसजेनिक लाइनों के आसान विकास, और जल्दी पुनर्जनन समय zebrafish एक सस्ती, जल्दी, लचीला है, और टेम अध्ययन के लिए आदर्श मॉडल बना दिया है ।

अलग और परीक्षण HSCs के कई तरीकों स्तनधारी टेम प्रणालियों में विकसित किया गया है । जांचकर्ताओं HSCs21,22,23,24, के रूप में अच्छी तरह से समाप्ति डाई25,26के लिए HSCs की क्षमता का दोहन करने के लिए चिह्नित करने के लिए सेल सतह रिसेप्टर्स का एक संयोजन का उपयोग कर सकते हैं । वे लेबल कर रहे हैं के बाद, प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष छँटाई (FACS) उनके शारीरिक जुदाई की अनुमति देता है. साबित करना है कि एक सेल एक HSC है radiating अंतर्जात HSPCs को नष्ट करने के लिए एक मेजबान जानवर की आवश्यकता है, ख्यात HSCs प्रत्यारोपण, और दीर्घकालिक, बहु सभी परिपक्व रक्त कोशिका प्रकार के वंश पुनर्गठन देख । इन परख चूहों में अच्छी तरह से काम करते हैं, के रूप में वहां कई सेल टेम कोशिकाओं और नस्ल माउस उपभेदों कि प्रत्यारोपण के लिए प्रतिरक्षा मिलान की सुविधा के खिलाफ सतह एंटीबॉडी रहे हैं । हालांकि, कुछ zebrafish टेम कोशिका-सतह एंटीबॉडी27उत्पंन किया गया है, पहचान और HSCs के अलगाव में बाधा । zebrafish HSCs को चिह्नित और अलग करने का सबसे आम तरीका ट्रांसजेनिक जानवरों के साथ है, जिससे एक कोशिका-विशिष्ट प्रवर्तक अनुक्रम एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति चला रहा है । अध्ययनों की कल्पना की है और इस तकनीक का उपयोग सूक्ष्मता के साथ पृष्ठीय महाधमनी के ventral दीवार में HSCs की गणना की है3,4,8,9। अंय प्रयोगशालाओं zebrafish28,29 के क्लोनिंग उपभेदों उत्पंन किया है और MHC-मिलान पशुओं30में सफल प्रत्यारोपण का प्रदर्शन । हालांकि, इन तकनीकों की लागत कई प्रयोगशालाओं के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं, तकनीकी रूप से मुश्किल है, और समय लगता है । इन मुद्दों को संबोधित करने के लिए, प्रयोगशालाओं की उपस्थिति के लिए परीक्षण करने के लिए इन विट्रो परख में कई उत्पंन किया है, प्रसार दर, और HSPCs31के भेदभाव की क्षमता,३२,३३, ३४,३५,३६. ये परख इन विट्रो31,३२,३३,३४,३५,३६, के बचाव में HSPCs के प्रसार और भेदभाव दिखाते हैं । टेम दोष३६, और खोज और परीक्षण के लिए एक कुशल विधि साइटोकिंस३३,३४,३५। वे भी HSPC जीवविज्ञान31,३२के लिए जिंमेदार जीन की पहचान करने के लिए उपयोग किया गया है । इस अध्ययन में, हम इन परख एक कदम आगे ले, एक विकासशील zebrafish भ्रूण में HSPCs के quantitation की अनुमति । इन परख भी उत्परिवर्ती पशुओं और टेम-विघटनकारी दवाओं के साथ इलाज जानवरों में HSPCs की संख्या quantitate करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । संक्षेप में, इन परख तेजी से कर रहे हैं, वर्तमान कुछ तकनीकी चुनौतियों, और HSPC संख्या quantitate करने के लिए सस्ती तरीके हैं, उनके प्रसार की जांच, और भेदभाव में ब्लॉक की जांच ।

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Protocol

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संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) कैलिफोर्निया राज्य विश्वविद्यालय में सलाहकार बोर्ड, चिको, सभी तरीकों को मंजूरी दे दी नीचे वर्णित है ।

1. ब्लीच ४८ hpf Zebrafish भ्रूण

  1. 15 सेमी (डब्ल्यू) x 15 सेमी (एल) x 7 सेमी (एच) प्लास्टिक कंटेनर 3 धो स्टेशनों बनाने के साथ: 1) १००० मिलीलीटर भ्रूण माध्यम में 5% ब्लीच के 1 मिलीलीटर के साथ (E3; देखें तालिका 1), 2) बाँझ e3 के साथ, और 3) बाँझ e3 के साथ. सुनिश्चित करें कि प्रत्येक कंटेनर में भ्रूण को जलमग्न करने के लिए समाधान के ५०० मिलीलीटर है ।
    नोट: परीक्षण के लिए प्रत्येक शर्त के लिए, कम से कम 10 भ्रूण की जरूरत होगी । इस धुलाई प्रक्रिया २०० भ्रूण को समायोजित कर सकते हैं ।
  2. एक स्थानांतरण पिपेट के साथ, एक चाय छलनी में जगह भ्रूण और धो स्टेशन में अंडे जलमग्न 5 मिनट के लिए #1 । चाय छलनी (अंदर भ्रूण के साथ) और धो स्टेशन में जगह 5 मिनट के लिए #2 निकालें; एक अंतिम 5 मिनट के लिए धो स्टेशन #3 के लिए दोहराएँ ।
  3. पिछले धोने के बाद, यह एक साफ 10 सेमी पेट्री पकवान पर उल्टा मोड़ और धीरे बाँझ E3 और एक हस्तांतरण पिपेट के साथ चाय छलनी से भ्रूण धोने से चाय छलनी से कुल्ला भ्रूण ।

2. Dechorionate भ्रूण

  1. एक हस्तांतरण पिपेट के साथ, निकालें और पेट्री डिश से संभव के रूप में ज्यादा E3 के रूप में त्यागें और ५०० dechorionation के μL (10 मिलीग्राम/ 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन धीरे पूरी तरह से चोरियों को दूर करने के लिए पेट्री डिश की ओर नल ।
  2. एक सीरम पिपेट के साथ, बाँझ के 20 मिलीलीटर जोड़ने के लिए पतला करने के लिए तंग । अनुमति भ्रूण बसने के लिए, और एक स्थानांतरण पिपेट के साथ E3 को हटा दें । इस धो चरण 3 बार दोहराएं dechorionation के सभी निशान हटाने के लिए ।

3. भ्रूण के नमूनों की तैयारी

  1. एक P1000 पिपेट का उपयोग करना, एक ही बाँझ १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 10 भ्रूण जगह.
  2. एक पिपेट के साथ E3 निकालें और त्यागें ।
    सावधानी: भ्रूण के रूप में देखभाल के साथ पिपेट आसानी से विस्थापित किया जा सकता है और निम्नलिखित धोने चरणों के दौरान खारिज कर दिया ।

4. पृथक्करण के लिए भ्रूण की तैयारी

  1. लामिना फ्लो हूड के लिए स्थानांतरण नमूने, और 1 मिलीलीटर बाँझ E3 जोड़कर भ्रूण धोने. भ्रूण ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने और एक P1000 पिपेट के साथ supernatant हटाने की अनुमति दें । 3 बहाकर की कुल के लिए दोहराएं ।
  2. अंतिम धोने के बाद, E3 को हटाने और त्यागें । बलगम कोटिंग (और यह में फंस सकता है कि किसी भी बीजाणु, खमीर, या बैक्टीरिया) को दूर करने के लिए E3 में 10 मिमी dithiothreitol (डीटीटी) की 1 मिलीलीटर जोड़ें भ्रूण zebrafish आसपास । microcentrifuge ट्यूब क्षैतिज रखना, और 25 मिनट के लिए लामिना फ्लो हुड में कमरे के तापमान पर गर्मी ।

5. भ्रूण पृथक्करण

  1. धो नमूना 3 बाँझ DPBS के 1 मिलीलीटर के साथ बार (Ca के साथ2 + और मिलीग्राम2 +). अंतिम धोने के बाद DPBS के ५०० μL जोड़ें (Ca के साथ2 + और मिलीग्राम2 +) और 5 μL के 5 मिलीग्राम/एमएल (26 U/एमएल) पृथक्करण को जोड़ने ।
    चेतावनी: इस एंजाइम की जरूरत है Ca2 + और मिलीग्राम2 +, तो यह सुनिश्चित करें कि DPBS इन आयनों शामिल हैं.
  2. ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक क्षैतिज कक्षीय शेखर पर ६० मिनट के लिए १८० rpm पर मशीन नमूने लामिना प्रवाह हूड और नमूने पूरी तरह से असंबद्ध है जब तक एक P1000 के साथ triturate भ्रूण में जगह नमूने ।
    चेतावनी: भ्रूण जांच समय-समय पर यह निर्धारित करने के लिए जब वे असंबद्ध बन जाते हैं । भ्रूण समाधान ऊतक के कुछ राशि मौजूद होना चाहिए; यह पूरी तरह से समरूप नहीं होना चाहिए । यह अधिक से अधिक पचाने के लिए संभव है, जो HSPCs को नष्ट कर देगा ( पूरक चित्रा 1देखें) ।

6. असंबद्ध भ्रूण की तैयारी

  1. पिपेट एक ३५ माइक्रोन सेल छलनी टोपी के साथ एक 5 मिलीलीटर polystyrene दौर नीचे ट्यूब के शीर्ष जलाशय पर 10 असंबद्ध भ्रूण ।
  2. एक पिपेट के साथ, बाँझ पंजाबियों के साथ पेट्री ट्यूब कुल्ला (कोई Ca के साथ2 + या मिलीग्राम2 +) और 5 मिलीलीटर polystyrene ट्यूब कदम से फ़िल्टर किए गए कोशिकाओं को हस्तांतरण समाधान ६.१ । जब तक 4 मिलीलीटर तरल की 5 मिलीलीटर polystyrene ट्यूब में मौजूद है दोहराएँ ।
    नोट: पंजाबियों, DPBS, या अन्य isotonic बफ़र्ड समाधान इस स्तर पर उपयोग किया जा सकता है, जब तक वे शामिल नहीं Ca2 + या Mg2 +
  3. 4 डिग्री सेल्सियस और ३०० एक्स जी में 5 मिनट के लिए homogenized सेल नमूना गोली के लिए ट्यूब केंद्रापसारक । एक पिपेट के साथ, निकालें और गोल नीचे ट्यूब से supernatant त्यागें । ट्यूब के तल पर छर्रों कोशिकाओं को बाधित नहीं करने के लिए ध्यान रखना । पंजाब के १०० μL में कोशिकाओं को फिर से सस्पेंड ।

7. Methylcellulose की तैयारी

  1. 1x पूरा methylcellulose (तालिका 1) शेयर समाधान उत्पंन और २.५ एमएल जोड़ने के लिए गोल-नीचे 14 मिलीलीटर ट्यूबों के साथ 3 मिलीलीटर सिरिंजों और 16 जी सुई के साथ बाँझ । परीक्षण एक शर्त के लिए एक ट्यूब का प्रयोग करें ।
  2. प्रत्येक नमूने के लिए जांच की जानी करने के लिए साइटोकिंस, छोटे अणुओं, या अन्य एजेंटों जोड़ें.
    1. माइलॉयड भेदभाव के लिए, जोड़ने के लिए 1% कार्प सीरम और ०.३ मिलीग्राम/एमएल संयोजक zebrafish granulocyte कॉलोनी उत्तेजक फैक्टर (Gcsf)३४ methylcellulose मध्यम करने के लिए । देखें Svoboda एट अल । ३७ कैसे कार्प सीरम और संयोजक साइटोकिंस उत्पन्न करने पर पूर्ण विवरण के लिए.
    2. erythroid विभेदन के लिए, 1% कार्प सीरम और ०.१ मिलीग्राम/एमएल संयोजक zebrafish erythropoietin (ईपीओ)३८ को methylcellulose माध्यम से जोड़ें ।
    3. multilineage progenitors की जांच करने के लिए, ईपीओ और Gcsf जोड़ें ।
      चेतावनी: साइटोकिंस और additives कुल मात्रा के 10% से अधिक नहीं कुल चाहिए, के रूप में मध्यम पर्याप्त चिपचिपा अलग कालोनियों विचार नहीं होगा ।

8. Methylcellulose को असंबद्ध भ्रूण के अलावा

  1. एक पिपेट का प्रयोग, संयोजक साइटोकिंस और कार्प सीरम के साथ तैयार methylcellulose की सतह के लिए असंबद्ध 10 भ्रूण के १०० μL जोड़ें । कैप ढक्कन और भंवर धीरे पूरी तरह से homogenize नमूना है । प्रत्येक ट्यूब अब 10 भ्रूण के असंबद्ध ऊतक शामिल करना चाहिए ।
  2. 3 मिलीलीटर सीरिंज और 16 ग्राम सुई का प्रयोग, 2 अलग ३५ मिमी पेट्री व्यंजन में नमूने के 1 मिलीलीटर aliquot । सुनिश्चित करें कि नमूना पूरी तरह से पेट्री डिश भर में फैला हुआ है । प्रत्येक नमूने के लिए दोहराएँ ।
  3. एक 15 सेमी पेट्री डिश में methylcellulose में कोशिकाओं के साथ ३५ mm पेट्री व्यंजन रखें । प्रत्येक 15 सेमी डिश के लिए, humidify के नमूनों को बाँझ पानी की 5 मिलीलीटर के साथ १ ३५ mm पेट्री प्लेट जोड़ें । 7-10 दिनों के लिए ३२ ° c और 5%सह 2 पर मशीन ।

9. HSPC-व्युत्पन्न कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFUs) के दृश्य

  1. 7 दिनों के बाद, दृश्य और गणना के लिए ४०-100X पर एक औंधा माइक्रोस्कोप पर जगह के नमूने । इस बिंदु पर, व्यक्तिगत कालोनियों एक पिपेट के साथ अलग किया जा सकता है और धुंधला और/

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Representative Results

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भ्रूण zebrafish में HSPC संख्या का आकलन करने के लिए, ४८ hpf भ्रूण पचा रहे थे, exogenous टेम के साथ methylcellulose में चढ़ाया-सहायक विकास कारकों, और 7 दिनों के लिए मशीन (चित्रा 1) । 7 दिनों के बाद, कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFUs) (चित्रा 1बी) और imaged (चित्रा 1सी) थे गणना कर रहे थे । अलग साइटोकिंस को नियंत्रित करके, एक का उत्पादन किया कालोनियों के प्रकार को नियंत्रित कर सकते हैं: ईपीओ erythroid भेदभाव और Gcsf के लिए आवश्यक है माइलॉयड भेदभाव के लिए आवश्यक है । कार्प सीरम स्तनधारी ऊतक संस्कृति में भ्रूण गोजातीय सीरम के उपयोग के अनुरूप है; यह सामांय विकास कारकों का एक स्रोत है । चित्रा 1में, ईपीओ, Gcsf, और कार्प सीरम, erythroid, माइलॉयड, और मिश्रित erythromyeloid कालोनियों के गणन की अनुमति जोड़ रहे थे । इन कॉलोनियों उनके आकार और रंग के कारण समझदार हो सकता है; erythroid कालोनियों तंग कर रहे हैं, छोटे, कॉंपैक्ट, और hemoglobinization के कारण एक लाल रंग है । माइलॉयड कालोनियों बड़ा कर रहे है और उनके किनारों पर अधिक गतिशील कोशिकाओं है, उंहें एक असंतोष प्रकट दे रही है ।

HSPC के साथ इलाज भ्रूण zebrafish के सफल चढ़ाना-सहायक कारकों के बाद CFUs उपज होगा 7-10 दिन की मशीन । महत्वपूर्ण बात, CFUs की मात्रा सीधे भ्रूण चढ़ाया (चित्रा 1बी) की संख्या के साथ संबद्ध । (जो प्रयोग की शुरुआत में 10 या 20 भ्रूण के साथ शुरू करने के लिए संबद्ध) प्रति मिलीलीटर या तो 4 या 8 भ्रूण चढ़ाना लगभग १,२०० या २,४०० CFUs, क्रमशः पैदावार । हमारे प्रोटोकॉल 10 भ्रूण का उपयोग कर पता चलता है, क्योंकि यह मुश्किल है और समय लेने के लिए २,४०० CFUs गिनती जब एक बड़ा प्रयोग प्रदर्शन कर रहा है । पूरे भ्रूण को पचाने की पद्धति के कारण, विविध मलबे methylcellulose में मौजूद है, लेकिन आसानी से माइक्रोस्कोप के तहत उच्च आवर्धन के साथ वास्तविक कालोनियों से समझदार हो सकता है । अंय सेलुलर मलबे भी मौजूद हो सकता है, लेकिन केवल CFUs वर्तमान HSPC-HSPC के अतिरिक्त सहायक साइटोकिंस के कारण व्युत्पंन किया जाएगा । यदि CFUs छोटे है और आसानी से नहीं देखा है, संस्कृतियों 10 दिनों के लिए किया जा सकता है को बढ़ाने के लिए वृद्धि को प्रोत्साहित करते हैं । हालांकि, वृद्धि की गर्मी अधिक CFUs उपज नहीं होगा; यदि CFUs मौजूद नहीं हैं, यह cytokine गतिविधि की हानि इंगित करता है, भ्रूण के पाचन पर (और HSPCs के बाद विनाश; पूरक चित्रा 1देखें), या नमूनों की अनुचित चढ़ाना । यह हमेशा उचित नियंत्रण चलाने के लिए महत्वपूर्ण है हर बार इस प्रयोग कि तकनीक में मामूली बदलाव HSPC गणन में झूठी मतभेद उपज नहीं है सुनिश्चित करने के लिए किया जाता है । उदाहरण के लिए, यदि एक प्रयोग morphed भ्रूण में मौजूद HSPCs की संख्या का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है, सामान्य भाई बहनों के साथ एक नमूना के साथ तैयार किया जाना चाहिए. एक प्रयोग HSPCs के विकास पर एक दवा के प्रभाव की तुलना करने के लिए किया जाता है, तो अनुपचारित भाई बहन के साथ एक नमूना तैयार किया जाना चाहिए और साथ विश्लेषण.

Figure 1
चित्र 1: गणना HSPC-व्युत्पंन CFUs से ४८ hpf zebrafish भ्रूण । (क) HSPC के साथ methylcellulose पर भ्रूण चढ़ाना का योजनाबद्ध सिंहावलोकन-टेम CFUs की पीढ़ी के लिए सहायक साइटोकिंस. ४८ hpf zebrafish भ्रूण असंबद्ध और 1% पर चढ़ाया गया methylcellulose erythropoietin (ईपीओ), granulocyte (Gcsf), और कार्प सीरम उत्तेजक, erythromyeloid भेदभाव की अनुमति के साथ पूरा हो गया । (ख) कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFUs) के नमूनों से 4 या 8 प्रति मिलीलीटर भ्रूण की सांद्रता में चढ़ाया (10 या 20 भ्रूण, के साथ प्रयोग शुरू क्रमशः) की गणना । गणन 100X पर एक औंधा माइक्रोस्कोप पर किया गया था । पट्टियां CFUs की औसत संख्याओं को इंगित करती हैं, और त्रुटि पट्टियां मानक विचलन इंगित करती हैं । (ग) methylcellulose पर भ्रूण चढ़ाना की कॉलोनी आकृति विज्ञान प्रतिनिधि. कॉलोनी की आकृति विज्ञान कालोनी को शामिल करने वाले कक्षों के प्रकार को इंगित करती है; छवियां प्रतिनिधि erythroid और माइलॉयड कालोनियों हैं । 400X पर CFUs फोटो । स्केल बार्स = ५० माइक्रोन ।  कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Supplemental Figure 1
पूरक चित्रा 1: पृथक्करण के साथ भ्रूण के पाचन को छेड़ो । (क) पाचन से पहले 10 भ्रूण की छवियाँ (बाएँ; अजीर्ण), पर्याप्त पाचन के बाद (मध्य; पच), और अधिक पाचन के बाद (सही; ओवर पच). (ख) छवियों में ज़ूम (7.3 x) में पचता और पर पचा ट्यूबों में (ए)कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

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zebrafish मॉडल प्रणाली आदिम और निश्चित हड्डीवाला hematopoiesis के अध्ययन के लिए एक कुशल, प्रभावी, और सस्ती मॉडल बन गया है । परख की पीढ़ी है कि तेजी से कर रहे हैं, सस्ती, और वर्तमान कुछ तकनीकी कठिनाइयों छोटे अणुओं के परीक्षण के लिए उपयोग किया जा सकता है, उत्परिवर्ती भ्रूण का विश्लेषण, और elucidating आणविक HSPC जीव विज्ञान के लिए महत्वपूर्ण रास्ते । इन विट्रो में वयस्क zebrafish से HSPCs की चढ़ाना mutagenesis, साइटोकिंस, और टेम दोषों का अध्ययन करने के लिए एक प्रभावी तरीका है । इस प्रोटोकॉल उन अध्ययनों पर बनाता है, लेकिन भ्रूण zebrafish का उपयोग करता है । भ्रूण zebrafish के लिए इन परख लागू करने की अनुमति देता है जल्दी डेटा संग्रह के लिए, कम शारीरिक अंतरिक्ष के उपयोग, कम दवाओं के उपयोग (दवा स्क्रीन के लिए), और mRNA और/या morpholino (मो) विशिष्ट आनुवंशिक रास्ते के पछाड़ना परीक्षण परमिट । महत्वपूर्ण बात यह भी hematopoiesis के चरणों का अध्ययन है कि केवल जल्दी हड्डीवाला विकास के दौरान होने की अनुमति देता है ।

इस परख के लचीलेपन के कारण, यह आसानी से कई विविध जरूरतों को पूरा संशोधित किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल के एक संशोधन विकासात्मक समय का मॉडुलन है; भ्रूण की आयु को संशोधित करने का उपयोग समय के साथ HSPC पीढ़ी के quantitation की अनुमति देता है । यह भी erythromyeloid progenitors6, जो ३६ hpf से पहले उठता है जैसे HSPCs के विभिंन सबसेट के अध्ययन की अनुमति कर सकते हैं, सदाशई बनाम HSCs3,4,5,8, जो उठता बाद. कोई भी अभी तक अलग करने और विकासशील भ्रूण में अधिक प्रतिबंधित zebrafish HSPC सबसेट की पहचान करने में सक्षम है, लेकिन इन परख इन प्रयोगों की अनुमति । यह आवश्यक है कि जब पशुओं के विकास के चरणों में परिवर्तन, methylcellulose में जोड़ा कोशिकाओं की मात्रा भी अनुकूलित है; बहुत कम जानवरों कोई कालोनियों निकलेगा, जबकि बहुत सारे HSPC कालोनियों की एक बेशुमार थाली पैदा करेगा । अलग साइटोकिंस जोड़ना एक और संशोधन है कि विशिष्ट प्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । ईपीओ जोड़ना erythroid कालोनियों के quantitation की अनुमति देगा, जबकि Gcsf माइलॉयड कालोनियों के गणन की अनुमति देगा । इन दोनों साइटोकिंस को जोड़ने से बहु-वंश CFU पीढ़ी को अनुमति मिलेगी । महत्वपूर्ण बात, इन परख ख्यात साइटोकिंस और HSPC प्रसार और भेदभाव पर उनके प्रभाव के परीक्षण की अनुमति । इन परख भी बड़े पैमाने पर दवा परीक्षण करने के लिए संशोधित किया जा सकता है; भ्रूण विभिंन समय बिंदुओं पर यौगिकों के विभिंन सांद्रता के लिए विकास के दौरान उजागर किया जा सकता है देखने के लिए अगर रसायनों रक्त उत्पादन पर सकारात्मक या नकारात्मक प्रभाव पड़ता है । एक अंतिम तरीका है कि इन प्रयोगों को संशोधित किया जा सकता है कि भ्रूण एक विशिष्ट mRNA या राज्यमंत्री के साथ एक सेल मंच पर इंजेक्ट किया जा सकता है, जो स्पष्ट या पछाड़ना विशिष्ट जीन, क्रमशः होगा । 24-48 एच के लिए विकसित करने के बाद, इन भ्रूण इन परख के अधीन किया जा सकता है निर्धारित करने के लिए यदि लाभ या हानि-की-समारोह विशिष्ट जीन के HSPC गठन, प्रसार में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं, और भेदभाव । यह भी ध्यान दें कि zebrafish के विभिंन ट्रांसजेनिक उपभेदों का उपयोग गति में सहायता और इकट्ठा करने और डेटा की व्याख्या की आसानी होगी महत्वपूर्ण है । उदाहरण के लिए, यदि एक erythroid विकास में रुचि है, यह gata1:D sred भ्रूण४०है, जो erythroid के प्रवर्तक-विशिष्ट ट्रांसजेनिक gata1 प्रतिलेखन कारक ड्राइविंग में इन प्रयोगों प्रदर्शन आसान है DsRed प्रतिदीप्ति. इस तरह, erythroid कालोनियों का विश्लेषण करते समय, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया जा सकता है । इसी तरह, इन अध्ययनों एकाधिक transgenes वर्तमान के साथ पशुओं पर प्रदर्शन किया जा सकता है एक बार में कई सेल वंश के लिए देखो । यह तकनीक multilineage HSPCs की पहचान के लिए उपयोगी होगी; हालांकि erythroid और माइलॉयड कालोनियों के द्वारा आसानी से भेद योग्य हैं, यह एक ही कॉलोनी में एकाधिक वंश-विशिष्ट transgene अभिव्यक्ति की उपस्थिति visualizing के बिना bipotential progenitors होते हैं कि कालोनियों की पहचान करने के लिए मुश्किल है .

हालांकि इन परख कई लाभ है, यह पर्याप्त नियंत्रण स्थापित करने के लिए हर बार इन प्रयोगों प्रदर्शन आवश्यक है; तकनीक में मामूली बदलाव परिणाम और निष्कर्षों की व्याख्या बदल सकता है । उदाहरण के लिए, यह संभव है HSPCs के विभिंन नंबरों जब आप विभिंन दिनों पर प्रयोग प्रदर्शन करने के लिए यदि आपकी तकनीक सटीक नहीं है; इस संभावना से निपटने के लिए, एक हमेशा एक उचित नियंत्रण शामिल करना चाहिए । यदि एक प्रयोग के विकास पर एक एमओ के प्रभाव का परीक्षण किया जाता है, तो नियंत्रण भ्रूण (या तो इंजेक्शन या एक नियंत्रण एमओ के साथ इंजेक्शन) है कि एक ही क्लच से कर रहे है भी प्रयोगात्मक नमूना के साथ संसाधित किया जाना चाहिए । यदि प्रयोग एक विशेष दवा के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, तो अनुपचारित नमूने एक नियंत्रण के रूप में शामिल किया जाना चाहिए. अंत में, यदि विकास पर एक विशिष्ट cytokine के प्रभाव का परीक्षण, तो एक ही क्लच से पशुओं को भी कार्रवाई की जानी चाहिए और एक ही समय में जांच की संस्कृति को जोड़ा cytokine बिना ।

हालांकि इस में इन विट्रो परख करने के लिए सरल है और परिणाम की व्याख्या करने के लिए आसान कर रहे हैं, कुछ संभावित समस्याओं प्रक्रिया के दौरान पैदा कर सकते हैं । अगर संस्कृति में 7 दिनों के बाद कोई कालोनी नहीं देखी जाती तो कई मुद्दे ऐसे होते हैं जो शायद घटित हो चुके होते हैं । सबसे पहले, यह सुनिश्चित करें कि साइटोकिंस शुद्ध और उचित सांद्रता पर कर रहे हैं; निर्भर करता है कि कैसे साइटोकिंस का उत्पादन किया गया है यह एकाग्रता को बदलने और उनकी गतिविधि का अनुकूलन करने के लिए आवश्यक हो सकता है । एक और मुद्दा है कि आमतौर पर उठता है पर है भ्रूण, जो HSPCs को नष्ट कर पचा; पाचन कदम पर ध्यान रखना, और समय को बदलने अगर कोई कालोनियों बार में देखा जाता है । अंत में, methylcellulose और कार्प सीरम के अलावा के मिश्रण मुद्दा हो सकता है, तो सुनिश्चित करें कि सभी अवयवों को जोड़ा गया है और सही ढंग से मिश्रित कर सकते हैं । तकनीकी मुद्दों के अलावा, यह एहसास है कि कालोनियों अब कुछ परिस्थितियों में विकसित करने की आवश्यकता हो सकती है महत्वपूर्ण है; अक्सर छोटी कालोनियों संस्कृति में एक अतिरिक्त 3 दिनों के बाद बहुत अधिक दिखाई दे रहे हैं । पिछले 10 दिनों से जा रहे है अनुशंसित नहीं है, के रूप में methylcellulose के बाद शीघ्र ही बाहर सूखी शुरू होता है । एक अंय आम मुद्दा यह है कि कई बार कालोनियों ३५ mm पेट्री व्यंजन के किनारों के आसपास इकट्ठा करते हैं; प्लेटों अच्छी तरह से स्कैनिंग, विशेष रूप से किनारों के आसपास, आवश्यक है । इसके अलावा, यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि इन कॉलोनियों में एक मोटी, चिपचिपा सामग्री विकसित कर रहे हैं; जब माइक्रोस्कोप ध्यान केंद्रित करने, थोड़ा अलग विमानों का निरीक्षण करने के लिए ऊपर और नीचे ध्यान समायोजित-कालोनियों प्लास्टिक के व्यंजन के तल पर नहीं बैठा होगा ।

इन विट्रो में परख फायदे के बहुत है, लेकिन वे भी कुछ सीमाएं हैं । सबसे बड़ा मुद्दा यह है कि इन परख निश्चित साबित नहीं कर सकते कि एक जनक एक HSC है-कि केवल विकिरणित पशुओं के दीर्घकालिक पुनर्गठन द्वारा सिद्ध किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, नहीं सभी साइटोकिंस परिभाषित किया गया है और अभी तक zebrafish में जांच की है, जो HSPCs के प्रकार की सीमा है कि जांच की जा सकती है । उदाहरण के लिए, कोई zebrafish लसीकावत्-सहायक साइटोकिंस अभी तक पहचान की गई है, इन परख में बी और टी सेल उत्पादन को रोकने । इसके अलावा, यह स्पष्ट नहीं है जब संवर्धन multipotent HSPCs विशिष्ट साइटोकिंस के कुछ प्रकार (या मात्रा) के अलावा कुछ टेम रास्ते नीचे भेदभाव तिरछा कर सकते हैं । एक और संभावित चेतावनी यह है कि इस परख प्रभावी ढंग से अगर HSPCs वास्तव में एक नमूने में मौजूद है विचार नहीं कर सकते, लेकिन किसी कारण के लिए अंतर करने में असमर्थ है (या अंयथा व्यवहार्य नहीं हैं) । इन विट्रो परख के साथ के रूप में, और प्रयोगों हमेशा निष्कर्षों को मांय करने के लिए प्रदर्शन किया जाना चाहिए । इन मुद्दों को छोडक़र, अधिक जानकारी इन क्लोनी परख से बटोरी जा सकती है ।

इन परख महत्वपूर्ण हैं, क्योंकि वे टेम दोषों के त्वरित और कुशल स्क्रीनिंग की अनुमति । शोधकर्ताओं ने राज्यमंत्री के साथ कुछ आनुवंशिक रास्ते नीचे दस्तक कर सकते हैं, और थाली पचा जानवरों को देखने के लिए अगर जीन hematopoiesis में एक भूमिका निभाता है । इसके अतिरिक्त, उत्परिवर्ती मछली (पहले से उत्पंन या नव mutagenesis स्क्रीन में उत्पंन) जल्दी और आसानी से मूल्यांकन किया जा सकता है । इन परख भी रहते हैं, पूरे जीवों पर कुशल दवा स्क्रीनिंग परख की अनुमति HSPC जीव विज्ञान के मॉडुलन की पहचान करते हुए भी अगर दवाओं के विकास या अस्तित्व पर एक नकारात्मक प्रभाव है निरीक्षण करने में सक्षम किया जा रहा है । ये परख भी अलग timepoints पर विकासशील zebrafish में HSPCs के quantitation अनुमति देते हैं । जबकि एकाधिक अध्ययनों से वयस्क7,27,30,४१ और भ्रूण zebrafish3,4,४२, में HSC संख्या quantitate करने का प्रयास किया है ४३, कोई अध्ययन zebrafish में वंश-प्रतिबंधित HSPCs की विभिन्न मात्राओं को quantitated है. इसके अतिरिक्त, इन परख की जांच करने के लिए और रक्त कोशिका निर्माण और भेदभाव, एक प्रक्रिया है कि रहस्यपूर्ण रहता है में महत्वपूर्ण आणविक रास्ते मिलाना का उपयोग किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

धन स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा प्रदान की गई (NIH: K01-DK087814-01A1 D.L.S. के लिए), कैलिफोर्निया राज्य जैव प्रौद्योगिकी में शिक्षा और अनुसंधान के लिए विश्वविद्यालय कार्यक्रम (CSUPERB: हड्डीवाला टेम आला के आणविक नियंत्रण D.L.S. के लिए) और कैलिफोर्निया स्टेट यूनिवर्सिटी चिको (A.C.B. करने के लिए) में स्नातक अध्ययन कार्यालय से ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Bovine Serum Albumin in Iscove's MDM StemCell Technologies  9300
DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+ Life Technologies 14080-055
HyClone PBS (1x) GE Healthcare Life Sciences sh30256.01
 DMEM 500 mL Corning CellGrow 10-017-CV
 Ham's F12 500 mL Corning CellGrow 10-080-CV
FBS 500 mL Gemini Bio-Products 100-108
HEPES 100 mL (1 M) Gibco life technologies 15-630-080
Penicillin/streptomycin (5000 U/mL
and 5000 mg/mL) with L-Glutamine (200 mM)
Corning Mediatech 30-009-CI
Gentamycin Sulfate 10 mL (50 mg/mL) Corning Mediatech 30-005-CR
1.5 mL MCF tube FisherBrand 05-408-129
3 mL 23gx1 injection needle with Luer lock BD Safety Glide 305905
5 mL polystyrene round bottom tube with cell strainer cap Corning Falcon 352235
Methocel MC Sigma-Aldrich 64630
14 mL Polystyrene round bottom tube Corning Falcon 352057
10 mm polystyrene easygrip Petri dish Corning Falcon 351008
Librease TM Roche Sigma-Aldrich 5401119001 dissociation protease
Pronase Roche Sigma-Aldrich 11459643001 dechorionation protease
15 cm Petri dish Corning Falcon 351058
AB Zebrafish International Resource Center (ZIRC) ZL1 zebrafish strain used
Dithiolthreitol (DTT) Sigma-Aldrich 646563

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एक इन <em>विट्रो</em> परख के विकास के लिए Quantitate टेम स्टेम और जनक कोशिकाओं (HSPCs) Zebrafish भ्रूण के विकास में
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Berrun, A. C., Stachura, D. L. Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (129), e56836, doi:10.3791/56836 (2017).More

Berrun, A. C., Stachura, D. L. Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (129), e56836, doi:10.3791/56836 (2017).

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