Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

Разработка в Vitro Assay чтобы Quantitate гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPCs) в развитии эмбрионов у рыбок данио

doi: 10.3791/56836 Published: November 30, 2017

Summary

Здесь мы представляем простой метод, чтобы quantitate гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPCs) в zebrafish эмбриона. HSPCs от диссоциированных данио рерио в метилцеллюлоза покрыты благоприятных факторов, дифференциации в зрелых кровь. Это позволяет обнаружение крови дефектов и позволяет наркотиков скрининг легко проводить.

Abstract

Кроветворения является важным процессом сотовых в котором гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPCs) дифференцироваться в множество различных клеточных линий, которые составляют пожилые крови. Изоляция и идентификации этих HSPCs трудно, потому что они определены ex post facto в; они могут быть определены только после их дифференцировке в определенной ячейке. За последние несколько десятилетий данио рерио (Danio рерио) стала модель организма для изучения кроветворения. Zebrafish эмбриона развиваются ex внутриутробнои на 48 ч после оплодотворения (hpf) вызвали окончательное HSPCs. анализы для оценки HSPC дифференциации и были разработаны возможности распространения, используя трансплантации и последующих восстановление кроветворной системы в дополнение к визуализации специализированных трансгенных линий с confocal микроскопии. Однако эти анализы являются стоимость непомерно высока, технически сложным и трудоемким для многих лабораторий. Разработка в vitro модели для оценки HSPCs будет экономически эффективным, быстрее, и нынешние трудности меньше, по сравнению с ранее описанные методы, позволяющие лаборатории быстро оценить мутагенеза и наркотиков экраны, которые влияют на HSPC биологии. Этот роман в vitro оценить HSPCs генотипирования отрыве покрытия всей данио рерио эмбрионов и Добавление внешних факторов, которые способствуют только HSPC дифференциации и распространения. Эмбрионы отделить в одной клетки и покрыт HSPC-благоприятной колонии стимулирующие факторы, которые вызывают их для создания колонии формируя единиц (CFUs), которые возникают из клеток одного прародителя. Эти анализы должны позволить более тщательного изучения молекулярные pathways отвечает за распространение HSPC, дифференциация и регулирования, который позволит исследователям понять основы позвоночных кроветворения и его регуляции во время болезни.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Кроветворения — это процесс превращения множество зрелых клеток крови, необходимые для выживания организма. Это ключевой процесс развития, который включает дифференциация гемопоэтических стволовых клеток (СКК) в различные типы развивающих ограничены клеток, которые составляют пожилые крови. Эти СКК должны самостоятельно обновлять так, что система никогда не исчерпаны, и они должны сохраняться от раннего эмбрионального развития вплоть до смерти. В позвоночных, постоянное дифференциации и распространения гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPCs) необходимо адекватно пополнить большинство клеток крови, которые после митотическая и перезапуск каждый день. СКК генерировать зрелые клетки крови, первый дифференцироваться в подмножества ограниченного прародитель клеток; Общие лимфоидные предшественники (МЦУЗ)1, который в конечном счете производят T, B и NK клеток и общих миелоидного прародителями (CMPs)2 , генерировать гранулоциты, эритроциты, макрофаги и megakaryocytes. Эти предшественники привержены генерации линий определенных ячеек и далее дифференцироваться в более развивающих ограниченный прародителя клетки как миелоидного эритроидные предшественники (MEP) которые генерируют эритроцитов и тромбоцитов или гранулоцитов прародителями макрофагов (ГИП), которые генерируют2базофилы, эозинофилов, нейтрофилов и макрофагов. Выявление и изоляция этих прародителями позволяет выявлять важные молекулярные пути участвующих в дифференциации кроветворных и многие кроветворных заболеваний, таких как лейкемия возникают, когда эти клетки-предшественники не правильно дифференцировать.

За последние несколько десятилетий данио рерио (Danio рерио) модель системы стала ключевым исследовательского инструмента для исследования гемопоэтических эмбриональных и взрослых. Данио рерио поддаются генетический анализ и филогенетически низкие видов позвоночных модели, которые имеют аналогичные сосудистую и Кроветворная система для людей. Данио рерио эмбрионов развивать ex внутриутробно, и в течение 48 часов пост оплодотворение (hpf) генерировать HSPCs3,4,5,6,,78. Данио рерио являются также весьма плодотворного, с самками, отстаивается 100 яиц в одном сцепления, позволяя для больших выборок и экспериментальной репликации. Данио рерио эмбрионов оптически прозрачным, позволяя микроскопических визуализации кроветворной системы. Несколько флуоресцентные трансгенных линий данио рерио, маркировка СКК например runx1: EGFP рыбы9, cd41: EGFP рыбы10, и kdrl:mCherry; cmyb: GFP3 двойной инфицированных животных, позволяют жить в реальном времени визуализации HSC возникновение и расширение в естественных условиях3,4,,78, 9. Данио рерио быстрого поколения время и развития бывших utero привела к его использования мутагенеза исследования11,12,13,,1415 и наркотиков Скрининг16,17,18,,1920 для соединений, которые держат терапевтические обещания для расстройств крови человека. В целом сохранению кроветворной системы, присутствие и легко развития трансгенных линий и быстрой регенерации времени сделал данио рерио недорогой, быстрый, гибкий и идеальная модель для гемопоэтических исследований.

Были разработаны многочисленные методы изоляции и тестирования СКК в млекопитающих кроветворной систем. Исследователи могут использовать сочетание поверхности рецепторы клеток марка СКК21,,2223,24, а также использовать способность СКК измеряем краситель25,26. После того, как они помечены, активируемых флуоресценции клеток, сортируя (FACS) позволяет их физическое разделение. Доказав, что ячейка HSC требует облучения хост животных, чтобы уничтожить эндогенного HSPCs, пересадка предполагаемого СКК и наблюдая за долгосрочный, мульти линии растворения всех Зрелые типы клеток крови. Эти анализы хорошо работают в мышей, поскольку есть многочисленные клетк поверхности антител против гемопоэтических клеток и инбредные мыши штаммов, которые облегчают иммунной соответствия для трансплантации. Однако несколько данио рерио гемопоэтических клеток поверхности антитела были созданные27, препятствуя выявление и изоляция СКК. Наиболее распространенный способ пометить и изолировать данио рерио СКК-трансгенных животных, whereby клеток конкретных промоутер последовательность является движущей флуоресцентных белков. Исследования имеют визуализируется и перечислил СКК в брюшной стенке грудной аорты с микроскопией, используя этот метод3,4,8,9. Другие лаборатории породили клоновых штаммов данио рерио28,29 и выполнили успешные трансплантации в MHC-согласованной животных30. Однако эти методы являются стоимость непомерно много лабораторий, технически трудно и много времени. Для решения этих вопросов, лаборатории породили несколько в vitro анализов для проверки присутствия, темпы распространения и возможности дифференциации HSPCs31,,3233, 34,35,36. Эти анализы показывают пролиферации и дифференцировки HSPCs в vitro31,,3233,34,35,36, спасение Кроветворная дефекты36и эффективный метод для обнаружения и тестирования цитокинов33,34,35. Они также были использованы для идентификации генов, ответственных за HSPC биологии31,32. В этом исследовании мы принимаем эти анализы на шаг дальше, позволяя количественный HSPCs развивающихся zebrafish эмбриона. Эти анализы также могут быть использованы чтобы quantitate количество HSPCs в мутанта животных и животных лечат гемопоэтических подрывной препаратами. По сути эти анализы являются быстрый, настоящий несколько технических проблем и недорогих способов quantitate HSPC чисел, изучить их распространения, и расследовать блоков в дифференциации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) Консультативный Совет в университете штата Калифорния, Чико, одобрил все методы, описанные ниже.

1. Блич 48 hpf Zebrafish эмбриона

  1. С 15 см (ш) x 15 см (l) x 7 cm (h) пластиковые контейнеры создать 3 мойки: 1) с 1 мл 5% хлорки в 1000 мл зародыш среднего (E3; см. таблицу 1), 2) с стерильных E3 и 3) стерильные E3. Убедитесь, что каждый контейнер имеет 500 мл раствора погружаться эмбрионов в.
    Примечание: Для каждого условия испытания, потребуется по меньшей мере 10 эмбрионов. Эта Стиральная процедура вмещает до 200 эмбрионов.
  2. С передача пипетки место эмбрионов в стрейнер чая и погружать яйца в стирки станции #1 для 5 минут удаления стрейнер чая (с эмбрионами внутри) и поместить в стирки станции #2 для 5 мин; Повторите для стирки станции #3 для окончательного 5 мин.
  3. После последнего мыть промыть эмбрионов от ситечко, повернув вниз над чистой 10 см Петри и нежно полоскания эмбрионов с ситечко с стерильных E3 и передачи пипетки.

2. Dechorionate эмбрионов

  1. С передачи пипетки удалить и удалить столько E3 как можно дальше от Петри и добавьте 500 мкл dechorionation протеазы (10 мг/мл) эмбрионов. Инкубации при комнатной температуре за 5 минут осторожно нажмите на стороне Петри блюдо, чтобы полностью удалить chorions.
  2. С Серологические Пипетки добавьте 20 мл стерильной E3 разбавлять протеазы. Позволить эмбрионов для урегулирования и удалите E3 с передачей пипетки. Повторите этот шаг мыть 3 раза, чтобы удалить все следы dechorionation протеазы.

3. Подготовка образцов эмбриона

  1. Использование пипетки P1000, место 10 эмбрионов в единый 1,5 мл стерильного microcentrifuge трубку.
  2. Удаление E3 с пипетки и отбросить.
    Предупреждение: Пипетка с осторожностью, как эмбрионы могут легко перемещенных и отбрасывается на следующих этапах мыть.

4. Подготовка эмбрионов для диссоциации

  1. Передача образцов Ламинарный шкаф и мыть эмбрионов, добавив 1 мл стерильного E3. Позвольте эмбрионов поселиться в нижней части трубки и удалить супернатант с P1000 пипетки. Повторите эти действия для в общей сложности 3 стирок.
  2. После последнего вымыть удалить E3 и отбросить. Добавьте 1 mL 10 мм Дитиотреитол (DTT) в E3 удалить покрытие слизь (и любые споры, дрожжей или бактерий, которые могут попасть в нем) вокруг эмбриональных данио рерио. Положите пробки microcentrifuge горизонтально и инкубировать в Ламинарный шкаф для 25 мин при комнатной температуре.

5. эмбриона диссоциации

  1. Помойте образец 3 раза с 1 мл стерильного DPBS (с Ca2 + и Mg2 +). После последнего стирки добавьте 500 мкл DPBS (с Ca2 + и Mg2 +) и 5 мкл протеазы диссоциации 5 мг/мл (26 ед/мл).
    Предупреждение: Этот фермент нуждается Ca2 + и Mg2 +, поэтому убедитесь, что DPBS содержит ионы.
  2. Проинкубируйте образцы при 37 ° C на горизонтальной орбитальный шейкер на 180 об/мин, 60 мин место образцов в Ламинарный шкаф и нарезанных эмбрионов с P1000 пока образцы полностью отделить.
    Внимание: Проверьте эмбрионов периодически, чтобы определить, когда они становятся отделить. Эмбриона раствор должен иметь некоторое количество ткани присутствует; Это не должно быть полностью однородной. Это позволяет чрезмерной дайджест, который уничтожит HSPCs (см. дополнительный рисунок 1).

6. Подготовка диссоциированных эмбрионов

  1. Пипетки 10 отделить эмбрионов на верхнем водохранилище 5 мл полистирола круглая труба внизу с крышкой ситечко ячейки 35 мкм.
  2. С пипеткой промыть Петри трубу с стерильных PBS (с не Ca2 + или мг2 +) и решение передачи до 5 мл полистирола трубка содержит отфильтрованные клетки от шага 6.1. Повторяйте до тех пор, пока в 5 мл полистирола присутствует 4 мл жидкости.
    Примечание: PBS, DPBS или других изотонический буферизации решения может использоваться на данном этапе, до тех пор, как они не содержат Ca2 + или мг2 +
  3. Центрифуга для трубы на 4 ° C и 300 x g за 5 мин до Пелле гомогенизированные ячейки выборки. С пипеткой снимите и выбросьте супернатант с круглым дном трубки. Позаботьтесь, чтобы не нарушить клетки, гранулированных в нижней части трубки. Ресуспензируйте клетки в 100 мкл PBS.

7. Подготовка метилцеллюлоза

  1. Генерировать 1 x полная метилцеллюлоза (Таблица 1) Стоковый раствор и добавить 2,5 мл стерильного раунд дно 14 мл пробирок с 3 мл-шприцы и иглы 16 G. Использование одной трубки для каждого условия испытания.
  2. Добавьте цитокинов, малые молекулы или других агентов, чтобы быть исследованы для каждого образца.
    1. Для миелоидных дифференциации добавляют 1% карп сыворотки и 0,3 мг/мл рекомбинантных данио рерио гранулоцитов колонии стимулирующий фактор (африканское)34 метилцеллюлоза средний. Смотреть "Свобода" и др. 37 на полное описание на как создать цитокинов сыворотки и рекомбинантные карп.
    2. Для дифференциации клеток добавьте 1% карп сыворотки и 0,1 мг/мл данио рерио рекомбинантного эритропоэтина (ЭП)38 метилцеллюлоза среднего.
    3. Для изучения мультилинейного прародителями, добавьте ЕПВ и организовавшими.
      Предупреждение: Цитокинов и добавки должны не всего более чем 10% от общего объема, как носитель не будет достаточно вязкая, чтобы различить отдельные колонии.

8. Добавление диссоциированных эмбрионов метилцеллюлоза

  1. С помощью пипетки, добавьте 100 мкл диссоциированных 10 эмбрионов на поверхности подготовленной метилцеллюлоза с рекомбинантным цитокинов и карп сыворотки. Колпачок крышки и вихревой мягко до полной гомогенизации образца. Каждая трубка должен теперь содержать диссоциированных ткани 10 эмбрионов.
  2. Использование 3 мл-шприцы и иглы 16 G, аликвота 1 мл образца в 2 чашки Петри отдельных 35 мм. Убедитесь, что образец полностью рассеяны по всему Петри. Повторите для каждого образца.
  3. Место Петри 35 мм с ячейками в метилцеллюлоза в 15 см Петри. Для каждого 15 см блюдо добавьте одну плиту Петри 35 мм с 5 мл стерильной воды для увлажнения образцы. Инкубируйте на 32 ° C и 5% CO2 , 7-10 дней.

9. Визуализация HSPC-производные колонии, образуя единиц (CFUs)

  1. После инкубации 7 дней, место образцы на инвертированным микроскопом на 40-100 X для визуализации и перечисления. На данный момент можно изолированных с пипеткой и подвергается пятнать или гена анализ отдельных колоний.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Чтобы оценить HSPC чисел в zebrafish эмбриона, 48 hpf эмбрионов были переваривается, покрытием в метилцеллюлоза с экзогенной гемопоэтических благоприятных факторов роста и инкубировали в течение 7 дней (рис. 1A). После 7 дней колонии формируя единиц (CFUs) были перечисленных (рис. 1Б) и фотосъемка (рис. 1C). Контролируя различные цитокины добавил, можно контролировать типы колоний производства: ЕПВ является необходимым для дифференциации эритроидные и организовавшими необходима для миелоидных дифференциации. Карп сыворотка является аналогом плода бычьим сывороточным использования в млекопитающих культуры ткани; Это источник общих факторов роста. На рисунке 1были добавлены ЕПВ, организовавшими и карп сыворотки, позволяя перечисление эритроидных колоний миелоидного и смешанные erythromyeloid. Эти колонии можно выделить из-за их формы и цвета; эритроидных колоний туго, небольшой, компактный и имеют красный цвет из-за hemoglobinization. Миелоидные колоний больше и имеют более подвижные клетки на их края, давая им взъерошенный вид.

Успешный покрытие из эмбриональных данио рерио лечение с HSPC-благоприятных факторов даст CFUs после 7-10 дней инкубации. Важно отметить, что количество CFUs напрямую коррелирует с количество эмбрионов покрытием (рис. 1Б). Покрытие 4 или 8 эмбрионов в мл, (которая коррелирует, начиная с 10 или 20 эмбрионов в начале эксперимента) дает примерно 1200 или 2400 CFUs, соответственно. Наш протокол предполагает использование 10 эмбрионов, как он является сложным и трудоемким для подсчета 2400 CFUs при выполнении больших эксперимент. Из-за методологии переваривание всей эмбрионов Прочее мусор присутствует в метилцеллюлоза, но можно легко различить от фактической колоний с большим увеличением под микроскопом. Другие сотовой мусора может также присутствовать, но только настоящий CFUs будет HSPC-производные связано с добавлением поддержки HSPC цитокинов. Если CFUs являются небольшими и не легко видели, культур можно инкубировали до 10 дней для поощрения роста. Однако увеличение инкубации не даст более CFUs; Если присутствуют не CFUs, это указывает на потерю цитокина активности, за пищеварение эмбрионов (и последующее уничтожение HSPCs; Дополнительные рис. 1), или ненадлежащее покрытие проб. Это всегда важно для выполнения надлежащего контроля, каждый раз, когда этот эксперимент проводится для того, что небольшие различия в технике не дают Ложные различия в HSPC перечисления. Например если эксперимент проводится для анализа количество HSPCs в morphant эмбрионы, наряду с должен быть подготовлен образец с нормальной братьев и сестер. Если эксперимент проводится сравнить эффект препарата на развитие HSPCs образец с необработанной братьев и сестер должна быть подготовлена и проанализированы вместе.

Figure 1
Рисунок 1: CFUs перечисление HSPC-производные от 48 hpf zebrafish эмбриона. (A) Схематический обзор обшивки эмбриона на метилцеллюлоза с цитокинами HSPC-благоприятной для поколения кроветворных CFUs. 48 hpf zebrafish эмбриона были отделены и покрытием на 1% полной метилцеллюлоза эритропоэтина (ЭП), гранулоцитарный колонии стимулирующий фактор (африканское) и карп сыворотки, позволяя erythromyeloid дифференциация. (B) перечисление колонии, образуя единиц (CFUs) от образцов покрытием в концентрациях эмбрионов 4 или 8 мл, (начиная эксперимент с 10 или 20 эмбрионов, соответственно). Перечисление было сделано на 100 X на инвертированным микроскопом. Бары указывают среднее количество CFUs, и погрешностей указать стандартное отклонение. (C) колонии морфология представитель обшивки эмбриона на метилцеллюлоза. Колонии морфология указывает типы клеток, которые составляют колонии; изображения являются представительной эритроидные и миелоидного колоний. CFUs, фотографируют на 400 X. Масштаб баров = 50 мкм.  Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Supplemental Figure 1
Дополнительные рисунок 1: пищеварение эмбрионов с диссоциации протеазы. (A) изображения 10 эмбрионов до пищеварение (слева; непереваренной), после надлежащего пищеварения (средний; переваривается) и после избыточного пищеварение (справа; более переваривается). (B) Zoomed в изображениях (7.3 X) перевариваются и более переваривается труб в (A). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Данио рерио модель системы стала эффективной, действенной и недорогой моделью для изучения примитивных и окончательного позвоночных кроветворения. Поколение анализов, которые являются быстрый, недорогой и представить некоторые технические трудности могут быть использованы для тестирования малые молекулы, анализ мутанта эмбрионов и выяснения молекулярные пути важно для HSPC биологии. В vitro покрытием HSPCs от взрослых рыбок данио является эффективным методом для изучения мутагенеза, цитокинов и кроветворная дефектов. Этот протокол основывается на эти исследования, но использует zebrafish эмбриона. Применяя эти анализы эмбриональных данио рерио позволяет для быстрого сбора данных, использования менее физического пространства, использование меньше наркотиков (для экранов наркотиков) и позволяет тестирования мРНК гиперэкспрессия или нокдаун Морфолино (MO) конкретных генетических путей. Главное она также позволяет изучение этапов кроветворения, которые происходят во время раннего развития позвоночных.

Благодаря гибкости этот assay можно легко изменить для удовлетворения многих разнообразных потребностей. Одна модификация этого протокола является модуляция развития сроков; изменение возраста использовали эмбрионов позволяет количественный HSPC поколения с течением времени. Это может также позволить исследования различных подмножеств HSPCs например erythromyeloid прародителями6, которые возникают перед 36 ЖКХ, против bona fide СКК3,4,5,8, которые возникают После этого. Никто еще не удалось изолировать и идентифицировать более ограниченных подмножеств HSPC данио рерио в развивающихся эмбрионов, но эти анализы позволяют эти эксперименты. Важно, что при изменении этапы развития животных, количество клеток, добавлены в метилцеллюлоза также оптимизирован; слишком мало животных даст никаких колоний, в то время как слишком много будет создавать бесчисленные пластины HSPC колоний. Добавление различных цитокинов является другой модификации, которые могут быть адаптированы для конкретных экспериментов. Добавление ЕПВ позволит количественный эритроидных колоний, в то время как африканское позволит перечисление миелоидного колоний. Добавление оба этих цитокинов позволит мульти линии CFU поколения. Важно отметить, что эти анализы позволяют тестирования предполагаемым цитокинов и их влияние на HSPC пролиферации и дифференцировки. Эти анализы также могут быть изменены для тестирования крупных масштабах наркотиков; эмбрионов может подвергаться воздействию различных концентраций соединений в разное время точках во время разработки, чтобы увидеть, если химические вещества имеют положительное или отрицательное влияние на производство крови. Последний способ, что эти эксперименты могут быть изменены, что эмбрионы могут быть введены на один клеточной стадии с конкретные мРНК или MOs, которые будут overexpress или специфических генов нокдаун, соответственно. После разработки за 24-48 ч, эти эмбрионы могут подвергаться эти анализы, чтобы определить, если выгоды или потери от функцию - специфических генов играют важную роль в формировании HSPC, пролиферации и дифференцировки. Важно также отметить, что использование различных трансгенных штаммов данио рерио поможет в скорость и простота сбора и интерпретации данных. Например, если один заинтересована в развитии эритроидные, это легко выполнять эти эксперименты в gata1: DsRed эмбрионы40, которые имеют промоутер эритроидные конкретных трансгенных Gata1 транскрипционного фактора вождения DsRed флуоресцирование. Таким образом, при анализе эритроидных колоний могут быть использованы микроскопии флуоресцирования. Аналогичным образом эти исследования могут выполняться на животных с нескольких трансгенов настоящий искать сразу несколько линий клеток. Эта техника будет использоваться для идентификации мультилинейного HSPCs; Хотя эритроидные и миелоидного колоний легко отличить по морфологии, трудно определить колоний, которые содержат bipotential прародителями без визуализации присутствие нескольких трансген линии конкретного выражения в том же колонии .

Хотя эти анализы имеют много преимуществ, важно создать надлежащие механизмы контроля, каждый раз, когда выполняются эти эксперименты; незначительные изменения в технике может изменить результаты и интерпретации результатов. Например это позволяет получить различное количество HSPCs при выполнении экспериментов в разные дни, если ваша техника не является точным; чтобы справиться с этой возможностью, один следует всегда включать соответствующий элемент управления. Если эксперимент проводится тестирование эффект MO на развитие, а затем контролировать эмбрионов (либо uninjected, либо вводят с элементом управления MO), которые от же сцепление также должны обрабатываться наряду с экспериментальный образец. Если эксперимент призван проверить действие конкретного препарата, неочищенные пробы следует включить как элемент управления. Наконец если тестирование последствий определенных цитокинов по развитию, затем животных от же сцепления следует также обрабатывается и рассмотрены в то же время не имея цитокинов, добавлены к культуре.

Хотя этот assay в vitro простой для выполнения и результаты легко интерпретировать, некоторые потенциальные проблемы могут возникнуть во время процедуры. Если не колоний видны после 7 дней в культуре, существует несколько проблем, которые могут иметь место. Во-первых проверьте, чтобы убедиться, что цитокины являются чистой и в надлежащей концентрации; в зависимости от того, как были произведены цитокинов может быть необходимо изменить концентрации и оптимизации их деятельности. Еще один вопрос, который часто возникает чрезмерно переваривания эмбрионы, который разрушает HSPCs; Позаботьтесь на шаге пищеварение и изменить сроки, если не колоний неоднократно видели. Наконец смешивание метилцеллюлоза и добавлением Карп сыворотки может быть вопрос, поэтому убедитесь, что все ингредиенты были добавлены и смешивается правильно. Помимо технических вопросов важно понимать, что колоний может разработать больше при определенных обстоятельствах; часто небольшие колонии являются гораздо более заметной после еще 3 дней в культуре. Идя за последние 10 дней не рекомендуется, поскольку метилцеллюлоза начинает высыхать вскоре после этого. Другой распространенной проблемой является, что иногда колонии, как правило, собирать по краям чашки Петри 35 мм; Сканирование пластины тщательно, особенно вокруг краев, имеет важное значение. Кроме того важно помнить, что эти колонии развиваются в толстый, вязкого материала; Когда фокусировки микроскопа, Отрегулируйте фокус вверх и вниз, чтобы наблюдать несколько различных самолетов-колонии не будет сидеть на нижней части пластиковой посуды.

Эти анализы в vitro имеют много преимуществ, но они также имеют несколько ограничений. Крупнейшей проблемой является, что эти анализы не может окончательно доказать, что является прародителем HSC-что может быть доказано только долгосрочное восстановление облученных животных. Кроме того были определены и исследованы в еще, данио рерио, который ограничивает виды HSPCs, которые могут расследоваться не все цитокинов. Например не данио рерио лимфоидных поддерживающих цитокинов было выявлено еще, предотвращение производства Б и Т-клеток в этих анализов. Кроме того неясно, когда культивирование Multipotent с HSPCs, если добавление определенных типов (или суммы) определенных цитокинов может исказить дифференциация вниз некоторые гемопоэтических пути. Другим потенциальным оговоркой является, что этот assay не может различить эффективно, если HSPCs действительно присутствуют в образце, но по некоторым причинам неспособны продифференцировать (или иным образом не жизнеспособной). Как и в случае большинства в vitro анализов, дальнейшие эксперименты всегда должно проводиться для проверки результатов. За исключением эти вопросы много информации можно почерпнуть из этих клоновых анализов.

Эти анализы являются значительными, потому что они позволяют быстро и эффективно скрининг гемопоэтических дефектов. Исследователи могут сбить определенные генетические пути с MOs, и пластины усваивается организмом животных, чтобы увидеть, если ген играет определенную роль в кроветворения. Кроме того мутант рыбы (ранее созданных или недавно созданных мутагенеза экранах) можно оценить быстро и легко. Эти анализы позволяют эффективным наркотиков скрининг анализов на живой, целые организмы для идентификации модуляции HSPC биологии, а также в состоянии соблюдать, если препараты имеют негативное воздействие на развитие и выживание. Эти анализы позволяют количественный HSPCs в развивающихся данио рерио на разных timepoints. В то время как многочисленные исследования пытались quantitate HSC числа взрослых7,27,,3041 и эмбриональных данио рерио3,4,42, 43, исследования не предел различное количество ограничено линии HSPCs в данио рерио. Кроме того эти анализы могут быть использованы для изучения и модулировать молекулярные пути важное значение формирования кровяных клеток и дифференциации, процесс, который остается загадочной.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Финансирование было предоставлено национальных институтов здравоохранения (НИЗ: К01-DK087814-01A1 для Д.Ю.Н.), Калифорнийский университет государственной программы для образования и исследования в области биотехнологии (CSUPERB: молекулярные управления позвоночных гемопоэтических ниши для Д.Ю.Н.) и из отделения аспирантуры в Чико Калифорния государственный университет (для A.C.B.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Bovine Serum Albumin in Iscove's MDM StemCell Technologies  9300
DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+ Life Technologies 14080-055
HyClone PBS (1x) GE Healthcare Life Sciences sh30256.01
 DMEM 500 mL Corning CellGrow 10-017-CV
 Ham's F12 500 mL Corning CellGrow 10-080-CV
FBS 500 mL Gemini Bio-Products 100-108
HEPES 100 mL (1 M) Gibco life technologies 15-630-080
Penicillin/streptomycin (5000 U/mL
and 5000 mg/mL) with L-Glutamine (200 mM)
Corning Mediatech 30-009-CI
Gentamycin Sulfate 10 mL (50 mg/mL) Corning Mediatech 30-005-CR
1.5 mL MCF tube FisherBrand 05-408-129
3 mL 23gx1 injection needle with Luer lock BD Safety Glide 305905
5 mL polystyrene round bottom tube with cell strainer cap Corning Falcon 352235
Methocel MC Sigma-Aldrich 64630
14 mL Polystyrene round bottom tube Corning Falcon 352057
10 mm polystyrene easygrip Petri dish Corning Falcon 351008
Librease TM Roche Sigma-Aldrich 5401119001 dissociation protease
Pronase Roche Sigma-Aldrich 11459643001 dechorionation protease
15 cm Petri dish Corning Falcon 351058
AB Zebrafish International Resource Center (ZIRC) ZL1 zebrafish strain used
Dithiolthreitol (DTT) Sigma-Aldrich 646563

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
  2. Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
  3. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
  4. Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
  5. Bertrand, J. Y., Kim, A. D., Teng, S., Traver, D. CD41+ cmyb+ precursors colonize the zebrafish pronephros by a novel migration route to initiate adult hematopoiesis. Development. 135, 1853-1862 (2008).
  6. Bertrand, J. Y., et al. Definitive hematopoiesis initiates through a committed erythromyeloid progenitor in the zebrafish embryo. Development. 134, 4147-4156 (2007).
  7. Ma, D., Zhang, J., Lin, H. F., Italiano, J., Handin, R. I. The identification and characterization of zebrafish hematopoietic stem cells. Blood. 118, 289-297 (2011).
  8. Lam, E. Y., Hall, C. J., Crosier, P. S., Crosier, K. E., Flores, M. V. Live imaging of Runx1 expression in the dorsal aorta tracks the emergence of blood progenitors from endothelial cells. Blood. 116, 909-914 (2010).
  9. Lam, E. Y., et al. Zebrafish runx1 promoter-EGFP transgenics mark discrete sites of definitive blood progenitors. Blood. 113, 1241-1249 (2009).
  10. Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106, 3803-3810 (2005).
  11. Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
  12. Weinstein, B. M., et al. Hematopoietic mutations in the zebrafish. Development. 123, 303-309 (1996).
  13. Ransom, D. G., et al. Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis. Development. 123, 311-319 (1996).
  14. Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).
  15. Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383, 829-832 (1996).
  16. Yeh, J. R., et al. Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation. Nat Chem Biol. 5, 236-243 (2009).
  17. Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis. Zebrafish. 7, 61-68 (2010).
  18. Ridges, S., et al. Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia. Blood. 119, 5621-5631 (2012).
  19. North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
  20. Astuti, Y., et al. A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing. Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).
  21. Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
  22. Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241, 58-62 (1988).
  23. Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1, 661-673 (1994).
  24. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
  25. Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nat Med. 3, 1337-1345 (1997).
  26. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183, 1797-1806 (1996).
  27. Gansner, J. M., et al. Sorting zebrafish thrombocyte lineage cells with a Cd41 monoclonal antibody enriches hematopoietic stem cell activity. Blood. 129, 1394-1397 (2017).
  28. Smith, A. C., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115, 3296-3303 (2010).
  29. Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat Protoc. 5, 383-394 (2010).
  30. de Jong, J. L., et al. Characterization of immune-matched hematopoietic transplantation in zebrafish. Blood. 117, 4234-4242 (2011).
  31. Wolf, A., et al. Zebrafish Caudal Haematopoietic Embryonic Stromal Tissue (CHEST) Cells Support Haematopoiesis. Sci Rep. 7, 44644 (2017).
  32. Campbell, C., et al. Zebrafish embryonic stromal trunk (ZEST) cells support hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) proliferation, survival, and differentiation. Exp Hematol. 43, 1047-1061 (2015).
  33. Svoboda, O., et al. Dissection of vertebrate hematopoiesis using zebrafish thrombopoietin. Blood. 124, 220-228 (2014).
  34. Stachura, D. L., et al. The zebrafish granulocyte colony-stimulating factors (Gcsfs): 2 paralogous cytokines and their roles in hematopoietic development and maintenance. Blood. 122, 3918-3928 (2013).
  35. Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118, 1274-1282 (2011).
  36. Stachura, D. L., et al. Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis. Blood. 114, 279-289 (2009).
  37. Svoboda, O., et al. Ex vivo tools for the clonal analysis of zebrafish hematopoiesis. Nat Protoc. 11, 1007-1020 (2016).
  38. Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110, 2718-2726 (2007).
  39. Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 133, 11-53 (2016).
  40. Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
  41. Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111, 1131-1137 (2008).
  42. Henninger, J., et al. Clonal fate mapping quantifies the number of haematopoietic stem cells that arise during development. Nat Cell Biol. 19, 17-27 (2017).
  43. Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160, 241-252 (2015).
Разработка <em>в Vitro</em> Assay чтобы Quantitate гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPCs) в развитии эмбрионов у рыбок данио
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berrun, A. C., Stachura, D. L. Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (129), e56836, doi:10.3791/56836 (2017).More

Berrun, A. C., Stachura, D. L. Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (129), e56836, doi:10.3791/56836 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter