Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

Desarrollo de un ensayo In Vitro para cuantificar Progenitor y vástago hematopoyética células (HSPCs) en el desarrollo de embriones de pez cebra

doi: 10.3791/56836 Published: November 30, 2017

Summary

Aquí, presentamos un método simple para cuantificar madre y progenitoras células hematopoyéticas (HSPCs) en el pez cebra embrionario. HSPCs de pez cebra disociado se platean en metilcelulosa con factores de apoyo, diferenciando en sangre madura. Esto permite la detección de sangre defectos y permite para realizarse fácilmente de detección de drogas.

Abstract

La hematopoyesis es un proceso celular esencial en el que las células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPCs) se diferencian en la multitud de linajes celulares diferentes que conforman la sangre madura. Aislamiento e identificación de estos HSPCs es difícil porque son definidos ex post facto; puede ser definidos sólo después de su diferenciación en linajes de células específicas. En las últimas décadas, el pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en un organismo modelo para el estudio de la hematopoyesis. Embriones de pez cebra desarrollan ex úteroy por la fertilización después de 48 h (hpf) han generado definitivo HSPCs. ensayos para evaluar la diferenciación HSPC y han desarrollado capacidades de proliferación, utilizando el trasplante y posterior reconstitución del sistema hematopoyético además visualizar líneas transgénicas especializadas con microscopía confocal. Sin embargo, estos ensayos son de costo prohibitivo, técnicamente difícil y desperdiciador de tiempo para muchos laboratorios. Desarrollo de un modelo en vitro para evaluar HSPCs sería rentable, más rápido y presentan menos dificultades comparadas anteriormente describen métodos, permitiendo a los laboratorios evaluar rápidamente pantallas de mutagénesis y drogas que afectan la biología de la HSPC. Este ensayo novela en vitro para evaluar la HSPCs se realiza en embriones de pez cebra todo chapado disociado y agregando factores exógenos que promueven la proliferación y diferenciación de la HSPC. Embriones son disociados en las células y plateados con apoyo HSPC factores estimulantes de Colonia que hacer generar unidades formadoras de colonias (UFC) que surgen de una célula del progenitor único. Estos ensayos permitirán examinación más cuidadosa de las vías moleculares responsables de la proliferación, diferenciación y regulación, que permitirá a los investigadores a entender los fundamentos de la hematopoyesis vertebrado y su dysregulation HSPC durante la enfermedad.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

La hematopoyesis es el proceso de hacer que la multitud de células maduras de la sangre necesaria para la supervivencia de un organismo. Es un proceso clave de desarrollo que consiste en la diferenciación de las células madre hematopoyéticas (HSCs) en una variedad de tipos celulares desarrollo restringido que comprenden sangre madura. Las HSCs uno deben renovar para que el sistema nunca se agota y deben persistir de desarrollo embrionario hasta la muerte. En los vertebrados, la constante diferenciación y proliferación de las células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPCs) se necesitan para reponer adecuadamente la mayoría de las células sanguíneas que son poste-mitotic y se reciclan todos los días. HSCs generan células sanguíneas maduras distinguiendo primero en subconjuntos de células progenitoras restringido; común progenitores linfoides (CLPs)1, que finalmente producen las células T, B y NK y de progenitores mieloides (CMP) común2 que generan los granulocitos, eritrocitos, macrófagos y megacariocitos. Estos progenitores comprometidos a generar linajes celulares específicos y además se diferencian en más células progenitoras desarrollo restringido como progenitores mieloide eritroide (MEPs) que generan los eritrocitos y las plaquetas o granulocitos progenitores del macrófago (GMPs) que generan los basófilos, eosinófilos, neutrófilos y los macrófagos2. Identificar y aislar a estos progenitores permiten la identificación de importantes vías moleculares implicadas en la diferenciación Hematopoyética y muchas enfermedades hematopoyéticas, como la leucemia se presentan cuando estas células progenitoras no correctamente distinguir.

En las últimas décadas, el sistema de modelo de pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en una herramienta clave de investigación para estudios hematopoyéticos embrionarios y adultos. Pez cebra son susceptible de análisis genético y las especies modelo vertebrados filogenéticamente más bajas que tienen un similar vasculatura y sistema hematopoyético a los seres humanos. Desarrollan de embriones de pez cebra ex útero, y dentro de 48 horas post fecundación (hpf) generan HSPCs3,4,5,6,7,8. Pez cebra son también altamente fecundo, con hembras sobre 100 huevos en un solo embrague, lo que permite tamaños de muestra grandes y replicación experimental. Los embriones de pez cebra son ópticamente transparentes, que permite la visualización microscópica del sistema hematopoyético. Varias líneas transgénicas fluorescentes del pez cebra marca HSCs como runx1: EGFP pescado9, cd41: EGFP peces10, y kdrl:mCherry; CMYB: animales de doble positivo de3 de GFP, permitir la visualización en tiempo real, vivo de HSC aparición y expansión en vivo3,4,7,8, 9. Generación rápida tiempo y desarrollo ex útero del pez cebra ha conducido a su uso en mutagénesis estudios11,12,13,14,15 y proyección16,17,18,19,20 compuestos que promesa terapéutica para trastornos de la sangre humana. En general, conservación del sistema hematopoyético, la presencia y desarrollo de líneas transgénicas y tiempo de regeneración rápida ha hecho el pez cebra un modelo barato, rápido, flexible e ideal para estudios hematopoyéticos.

Se han desarrollado numerosos métodos de aislamiento y pruebas de HSCs en mamíferos sistemas hematopoyéticos. Los investigadores pueden utilizar una combinación de receptores de superficie celular para marcar HSCs21,22,23,24, así como aprovechar la capacidad de HSCs de emanación tinte25,26. Después están rotuladas, celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación permite su separación física. Demostrando que una célula es una HSC requiere irradiar un animal del anfitrión para destruir HSPCs endógenas, transplante de HSCs putativas y observando que a largo plazo, multilineal reconstitución de todo maduras tipos de células sanguíneas. Estas pruebas funcionan bien en ratones, ya que hay numerosos anticuerpos de superficie celular contra las células hematopoyéticas y cepas consanguíneas de ratón que facilitan el inmunes que empareja para el trasplante. Sin embargo, pocos anticuerpos de superficie de la célula hematopoyética de pez cebra han sido generado27, lo que dificulta la identificación y aislamiento de HSCs. La forma más común de marcar y aislar HSCs de pez cebra es con animales transgénicos, por el que una secuencia de promotor de la célula-específica está impulsando la expresión de una proteína fluorescente. Estudios han visualizado y enumerar las HSCs en la pared ventral de la aorta dorsal con microscopía utilizando esta técnica3,4,8,9. Otros laboratorios han generado variedades clonales de pez cebra28,29 y han realizado trasplantes exitosos en animales emparejados MHC30. Sin embargo, estas técnicas son costo prohibitivo para muchos laboratorios, son técnicamente difíciles y son lentos. Para abordar estas cuestiones, los laboratorios han generado diversos estudios en vitro para probar para la presencia, las tasas de proliferación y la capacidad de diferenciación de HSPCs31,32,33, 34,35,36. Estos ensayos muestran proliferación y diferenciación de HSPCs en vitro31,32,33,34,35,36, el rescate de defectos hematopoyéticas36y un método eficaz para descubrir y probar citoquinas33,34,35. También se han utilizado para identificar los genes responsables de la HSPC biología31,32. En este estudio, tomamos estos análisis un paso más, permitiendo la cuantificación de HSPCs en un embrión de pez cebra en desarrollo. Estos ensayos también pueden ser utilizados para cuantificar el número de HSPCs en animales mutantes y animales trataron con fármacos hematopoyéticos no disruptivo. En esencia, estos ensayos son rápidos, presentes pocas dificultades técnicas y baratas formas de cuantificar números HSPC, examinar su proliferación e investigar bloques en diferenciación.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

El Consejo Consultivo institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de California State University, Chico, aprobó todos los métodos descritos a continuación.

1. bleach 48 hpf embriones de pez cebra

  1. Con 15 cm (w) x 15 cm (l) x envases de plástico de 7 cm (h) crear estaciones de lavado de 3: 1) con 1 mL de cloro 5% en medio del embrión de 1000 mL (E3; ver tabla 1), 2) con la E3 estéril y 3) con la E3 estéril. Asegúrese de que cada envase de 500 mL de solución para sumergir los embriones en.
    Nota: Para cada condición de prueba, se necesitarán por lo menos 10 embriones. Este procedimiento de lavado puede acomodar hasta 200 embriones.
  2. Con una pipeta, coloque los embriones en un colador de té y sumergir los huevos en la estación de lavado #1 para 5 minutos Retire el colador de té (con embriones dentro) y coloque en la estación de lavado #2 por 5 min; Repita para estación de lavado #3 para una final 5 minutos.
  3. Después del último lavado, enjuague los embriones de colador de té girándolo boca abajo sobre una limpia plato de Petri de 10 cm y suavemente enjuague los embriones fuera el colador de té con E3 estéril y una pipeta de transferencia.

2. Dechorionate de embriones

  1. Con una pipeta de transferencia, retire y deseche tanto E3 posible de la caja Petri y añadir 500 μL de dechorionation proteasa (10 mg/mL) a los embriones. Incubar a temperatura ambiente por 5 minutos golpee suavemente el lado de la caja Petri para eliminar chorions.
  2. Con una pipeta serológica, añadir 20 mL de E3 estéril para diluir la proteasa. Permiten embriones colocar y quitar el E3 con una pipeta de transferencia. Repita este paso de lavado 3 veces para quitar todos los rastros de la proteasa dechorionation.

3. preparación de muestras de embriones

  1. Usando una pipeta P1000, coloque 10 embriones en un tubo de microcentrífuga estéril solo 1,5 mL.
  2. Retire el E3 con una pipeta y deseche.
    PRECAUCIÓN: Pipetear con cuidado, como embriones pueden ser fácilmente desplazados y desechados durante los pasos de lavado.

4. preparación de embriones para disociación

  1. Transferir las muestras en campana de flujo laminar y embriones mediante la adición de 1 mL estériles E3. Permite embriones al fondo del tubo y retirar el sobrenadante con una pipeta P1000. Repita para un total de 3 lavados.
  2. Después del último lavado, eliminar E3 y deseche. Añadir 1 mL de 10 mM Ditiotreitol (DTT) en E3 para quitar la capa de moco (y cualquier esporas, levaduras o bacterias que pueden quedar atrapadas en él) que rodea el embrión pez cebra. Coloque el tubo de microcentrífuga horizontalmente e incubar a temperatura ambiente en campana de flujo laminar durante 25 minutos.

5. embrión disociación

  1. Lavar la muestra 3 veces con 1 mL de DPBS estéril (con Ca2 + y Mg2 +). Después del último lavado 500 μL de DPBS (con Ca2 + y Mg2 +) y añadir 5 μL de proteasa de disociación 5 mg/mL (26 U/mL).
    PRECAUCIÓN: Esta enzima necesita Ca2 + y Mg2 +, así que asegúrese de que la DPBS contiene estos iones.
  2. Incubar las muestras a 37 ° C en un agitador orbital horizontal a 180 rpm para las muestras de lugar de 60 min en la campana de flujo laminar y triturate embriones con una P1000 hasta que las muestras son totalmente disociadas.
    PRECAUCIÓN: Compruebe periódicamente para determinar cuándo se disocian los embriones. La solución del embrión debe tener cierta cantidad de tejido presente; no debe ser completamente homogéneo. Es posible digerir excesiva, que destruirá las HSPCs (ver figura 1 complementaria).

6. preparación de embriones disociados

  1. Los embriones en el depósito superior de un poliestireno de 5 mL pipeta 10 disociado redondo tubo inferior con una tapa de tamiz de 35 μm celular.
  2. Con una pipeta, enjuague el tubo de Petri con PBS estéril (con sin Ca2 + o Mg2 +) y solución de transferencia a 5 mL que contienen tubo poliestireno filtra las células en el paso 6.1. Repita hasta 4 mL de líquido está presente en el tubo de poliestireno de 5 mL.
    Nota: PBS, DPBS u otras soluciones tampón isotónicas pueden utilizarse en esta etapa, siempre y cuando no contengan Ca2 + o Mg2 +
  3. Centrifugar los tubos a 4 º C y 300 x g durante 5 minutos para que sedimenten la muestra homogeneizada de la célula. Con una pipeta, retire y deseche el sobrenadante del tubo de fondo redondo. Tenga cuidado de no romper las células peleteadas en la parte inferior del tubo. Resuspender las células en 100 μL de PBS.

7. preparación de metilcelulosa

  1. Generar 1 x solución metilcelulosa completa (tabla 1) y añadir 2,5 mL a tubos estériles 14 mL de fondo redondo con agujas 16 G y jeringas de 3 mL. Un tubo para cada condición de uso probado.
  2. Añadir citocinas, moléculas pequeñas u otros agentes para investigar a cada muestra.
    1. Para la diferenciación mieloide, añadir 1% carpa suero y 0,3 mg/mL pez cebra recombinante granulocitos estimulantes de colonias factor (Gcsf)34 a medio de metilcelulosa. Ver Svoboda et al. 37 para una descripción completa sobre cómo generar citoquinas suero y recombinante de la carpa.
    2. Para la diferenciación eritroide, añadir 1% carpa suero y 0.1 mg/mL pez cebra recombinante eritropoyetina (Epo)38 a medio de metilcelulosa.
    3. Para examinar del multilineage progenitores, agrega Epo y Gcsf.
      PRECAUCIÓN: Citoquinas y aditivos deben no total más del 10% del volumen total, como el medio no será lo suficientemente viscoso para distinguir colonias individuales.

8. adición de embriones disociados hasta la pastilla

  1. Usando una pipeta, añada 100 μL de los 10 embriones disociados a la superficie de la metilcelulosa preparado con suero carpa y citocinas recombinante. Tapón tapa y agitar suavemente para homogeneizar completamente la muestra. Cada tubo debe contener ahora el tejido disociado de 10 embriones.
  2. Utilizando jeringas de 3 mL y agujas de 16 G, alícuota 1 mL de la muestra en placas de Petri separadas 35 mm 2. Asegúrese de que la muestra está completamente dispersa a lo largo de la caja Petri. Repetir para cada muestra.
  3. Colocar platos de Petri de 35 mm con células en metilcelulosa en una placa de Petri de 15 cm. Añadir a cada plato de 15 cm, una placa de Petri de 35 mm con 5 mL de agua estéril para humedecer las muestras. Incubar a 32 ° C y 5% CO2 para 7-10 días.

9. visualización de la HSPC derivados colonias formando unidades (UFC)

  1. Después de 7 días de incubación, coloque las muestras en un microscopio invertido en 40-100 X para la visualización y enumeración. En este punto, colonias individuales pueden aisladas con una pipeta y sometidas a análisis de la coloración o gene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Para evaluar los números de la HSPC en pez cebra embrionario, 48 embriones hpf fueron digeridos plateados en metilcelulosa con factores exógenos de crecimiento hematopoyético apoyo y se incuba durante 7 días (figura 1A). Después de 7 días, unidades formadoras de colonias (UFC) fueron enumerados (figura 1B) y reflejada (figura 1C). Mediante el control de las diferentes citoquinas añadidas, uno puede controlar los tipos de colonias producidos: Epo es necesaria para la diferenciación eritroide y Gcsf es necesario para la diferenciación mieloide. Suero de carpa es análogo al uso de suero fetal bovino en cultivo de tejidos de mamífero; es una fuente general de factores de crecimiento. En la figura 1, Epo, Gcsf y serum de la carpa fueron agregados, permitiendo que la enumeración de eritroides, mieloides y mixta erythromyeloid colonias. Estas colonias se observan debido a su forma y color; las colonias eritroides son apretado, pequeño y compacto y tienen un color rojo debido a la hemoglobinization. Las colonias mieloides son grandes y tienen más células móviles en sus bordes, dándoles un aspecto rizado.

Exitosa de la galjanoplastia del pez cebra embrionaria tratada con HSPC apoyo factores rinde UFC después de 7-10 días de incubación. Lo importante, la cantidad de unidades formadoras de colonias se correlaciona directamente con el número de embriones plateado (figura 1B). De la galjanoplastia 4 o 8 embriones por mL (que se corresponde con a partir de 10 o 20 embriones al inicio del experimento) rinde aproximadamente 1.200 o 2.400 unidades formadoras de colonias, respectivamente. Nuestro protocolo sugiere utilizar 10 embriones, ya que es difícil y desperdiciador de tiempo para contar 2.400 UFC al realizar un experimento más grande. Debido a la metodología de digerir todo embriones, desechos varios está presente en la metilcelulosa, pero fácilmente se pueden discernir de las colonias reales de mayor aumento al microscopio. Otros desechos celulares también pueden estar presentes, pero el único unidades formadoras de colonias presentes será HSPC derivados debido a la adición de citocinas HSPC-apoyo. Si UFC es pequeñas y no fácil de ver, las culturas pueden ser incubadas a 10 días para promover el mayor crecimiento. Sin embargo, mayor incubación no producirá más unidades formadoras de colonias; Si UFC no está presentes, esto indica una pérdida de actividad de citocinas, sobre la digestión de los embriones (y posterior destrucción del HSPCs; vea la figura 1 complementaria), o galjanoplastia inadecuada de las muestras. Siempre es importante realizar controles adecuados cada vez que este experimento se realiza para garantizar que pequeñas variaciones en la técnica no den falsas diferencias en la enumeración de la HSPC. Por ejemplo, si se realiza un experimento para analizar el número de HSPCs presentes en embriones de morphant, una muestra con los hermanos normales debe estar preparada junto a. Si se realiza un experimento para comparar el efecto de un fármaco sobre el desarrollo de HSPCs una muestra con hermanos sin tratar debe ser preparada y analizó junto a.

Figure 1
Figura 1: Derivados de enumeración HSPC UFC 48 embriones de pez cebra de hpf. (A) Descripción esquemática de la galjanoplastia del embrión en metilcelulosa con citoquinas HSPC-apoyo para la generación de unidades formadoras de colonias hematopoyéticas. 48 embriones de pez cebra de hpf disociados y plateados en completa metilcelulosa al 1% con eritropoyetina (Epo), factor estimulante de colonias de granulocitos (Gcsf) y suero de carpa, que permite la diferenciación erythromyeloid. (B) enumeración de colonias formando unidades (UFC) de muestras de plateado a concentraciones de 4 u 8 embriones por mL (a partir del experimento con embriones de 10 o 20, respectivamente). Enumeración se realizó a 100 X en un microscopio invertido. Las barras indican el número promedio de UFC, y barras de error indican la desviación estándar. (C) morfología de las colonias representativa de galjanoplastia del embrión de metilcelulosa. Morfología de la Colonia indica los tipos de células que conforman la Colonia; las imágenes son representativa eritroide y mieloides colonias. UFC fotografiada a 400 X. Barras de escala = 50 μm.  Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Supplemental Figure 1
Suplementario Figura 1: digestión de embriones con proteasa de disociación. (A) imágenes de 10 embriones antes de la digestión (a la izquierda; sin digerir), después de la digestión adecuada (media; digerido) y después de la digestión exceso (derecha; más digerido). (B) Zoomed en imágenes (7.3 X) de los digeridos y más digeridos tubos (A). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

El sistema de modelo de pez cebra se ha convertido en un modelo eficiente, eficaz y barato para el estudio de la hematopoyesis vertebrada primitiva y definitiva. Generación de análisis rápido, barato y presentar algunas dificultades técnicas que puede utilizarse para pruebas de moléculas pequeñas, analizar embriones mutantes y dilucidar las vías moleculares importantes para la biología de la HSPC. In vitro la galjanoplastia de HSPCs de pez cebra adulto es un método eficaz para el estudio de mutagénesis, citoquinas y defectos hematopoyéticos. Este protocolo se basa en los estudios, pero utiliza embrionario pez cebra. Aplicación de estos ensayos a embrionario pez cebra permite la recogida de datos más rápida, el uso de menos espacio físico, el uso de menos medicamentos (para pantallas de drogas) y permite pruebas sobreexpresión de mRNA o caída de morfolino (MO) de vías genéticas específicas. Lo importante, también permite el estudio de fases de la hematopoyesis que sólo ocurren durante el desarrollo vertebrado temprano.

Debido a la flexibilidad de este ensayo, se puede modificar fácilmente para satisfacer las diversas necesidades de muchos. Una modificación de este protocolo es la modulación de la sincronización del desarrollo; modificación de la edad de los embriones utilizados permite la cuantificación de la generación de la HSPC con el tiempo. Esto también permite el estudio de subconjuntos distintos de HSPCs como erythromyeloid progenitores6, que se presentan antes de 36 hpf, versus bona fide HSCs3,4,5,8, que se presentan luego. Nadie ha podido aislar e identificar subconjuntos HSPC pez cebra más restringidos en el embrión en desarrollo, pero estos ensayos permiten estos experimentos. Es esencial que al cambiar las etapas de desarrollo de los animales, la cantidad de células que se agregan en la metilcelulosa es también optimizada; muy pocos animales no dará colonias, mientras que también muchos creará una placa incontable de colonias HSPC. Adición de diferentes citocinas es otra modificación que puede ser adaptado para experimentos específicos. Adición de Epo permite la cuantificación de colonias eritroides, mientras que Gcsf permitirá enumeración de colonias mieloides. Añadir dos de estas citoquinas permitirá generación de UFC multilineal. Lo importante, estos ensayos permiten pruebas de supuesta citoquinas y su efecto sobre la proliferación de la HSPC y diferenciación. Estos ensayos también pueden ser modificados para realizar las pruebas de drogas a gran escala; los embriones pueden estar expuestos a diferentes concentraciones de compuestos en diferentes momentos durante el desarrollo para ver si los productos químicos tienen un efecto positivo o negativo sobre la producción de sangre. Una forma final que pueden ser modificados estos experimentos es que los embriones se pueden inyectar en la etapa de una célula con mARN específico o MOs, que se sobreexpresan genes específicos de precipitación, respectivamente. Después de desarrollar durante 24-48 h, estos embriones pueden someterse a estas pruebas para determinar si ganar - o pérdida-de-función de genes específicos juegan un papel esencial en la formación de HSPC, proliferación y diferenciación. También es importante tener en cuenta que utilizando diferentes cepas transgénicas de pez cebra ayudará en la rapidez y facilidad de recogida e interpretación de datos. Por ejemplo, si uno está interesado en el desarrollo eritroide, es fácil de realizar estos experimentos en gata1: DsRed embriones40, que tiene el promotor el eritroide-específica transgénico Gata1 del factor de transcripción conduce DsRed fluorescencia. De esta manera, al analizar las colonias eritroides, microscopía de fluorescencia puede ser utilizado. Asimismo, estos estudios se pueden realizar en animales con múltiples transgenes presentes para buscar múltiples linajes celulares a la vez. Esta técnica sería útil para la identificación del multilineage HSPCs; Aunque eritroide y mieloides colonias son fácilmente distinguibles por la morfología, es difícil identificar las colonias que contienen bipotential progenitores sin visualizar la presencia de múltiple expresión de transgenes específicos de linaje en la misma Colonia .

Aunque estos ensayos tienen muchos beneficios, es imprescindible establecer controles adecuados cada vez que se realizan estos experimentos; pequeñas variaciones en la técnica podrían cambiar los resultados y las interpretaciones de los resultados. Por ejemplo, es posible obtener números diferentes de HSPCs al realizar los experimentos en días diferentes, si tu técnica no es precisa; para hacer frente a esta posibilidad, uno siempre debe incluir un control apropiado. Si se realiza un experimento para probar el efecto de un mes sobre el desarrollo, entonces los embriones (o uninjected o inyectado con un control MO) que son del mismo embrague de control también debe ser procesada junto a la muestra experimental. Si el experimento está diseñado para probar el efecto de un medicamento en particular, las muestras sin tratar deben ser incluidas como un control. Finalmente, si pruebas los efectos de una citoquina específica en desarrollo, luego animales desde el mismo embrague deben también ser procesados y examinó al mismo tiempo sin tener la citocina agregada a la cultura.

Mientras que este ensayo en vitro es sencillo de realizar y los resultados son fáciles de interpretar, algunos problemas pueden surgir durante el procedimiento. Si no hay colonias se observan después de 7 días en la cultura, hay varias cuestiones que se han producido. En primer lugar, verifique que las citoquinas son puro y en concentraciones adecuadas; dependiendo de cómo se han producido las citoquinas puede ser necesario alterar las concentraciones y optimizar su actividad. Otra cuestión que frecuentemente surge es digerir demasiado los embriones, que destruye el HSPCs; Tenga cuidado en el paso de la digestión y alterar la sincronización si no hay colonias se observan repetidamente. Por último, la mezcla de metilcelulosa y adición de suero la carpa podría ser el problema, así que asegúrese de que todos los ingredientes añadidos y mezclados correctamente. Además de cuestiones técnicas, es importante tener en cuenta que las colonias pueden necesitar ya desarrollar bajo ciertas circunstancias; a menudo pequeñas colonias son mucho más visibles después de 3 días adicionales en la cultura. Que va más allá de 10 días no se recomienda, como la metilcelulosa comienza a secarse pronto después de eso. Otro problema común es que a veces las colonias tienden a recolectar alrededor de los bordes de los platos de Petri de 35 mm; Análisis de las placas de fondo, especialmente alrededor de los bordes, es esencial. También, es importante recordar que estas colonias se están desarrollando en un material grueso, viscoso; Cuando enfocando el microscopio, ajuste el enfoque hacia arriba y hacia abajo para observar algo diferente planos-las colonias que no estar en la parte inferior de los platos de plástico.

Estos ensayos en vitro tienen un montón de ventajas, pero también tienen algunas limitaciones. El problema más grande es que estos ensayos no pueden probar definitivamente que un progenitor es una HSC-que sólo puede ser probado por largo plazo reconstitución de animales irradiados. Además, no todas las citocinas han sido definidas e investigó en el pez cebra, que limita los tipos de HSPCs que pueden ser investigados. Por ejemplo, no citoquinas linfoide apoyo del pez cebra se han identificado aún, prevenir la producción de células B y T en estos ensayos. Además, no está claro cuando HSPCs multipotentes de cultivo si la adición de ciertos tipos o cantidades de citocinas específicas puede sesgar la diferenciación por ciertas vías hematopoyéticas. Otro problema potencial es que este análisis no pueden discernir con eficacia si HSPCs están realmente presentes en una muestra, pero por alguna razón son incapaces de distinguir (o de lo contrario no son viables). Como con la mayoría en vitro ensayos, más experimentos se deben siempre realizar para validar los resultados. Salvo estos temas, mucha información puede extraerse de estos ensayos clonales.

Estos ensayos son importantes, porque permiten rápida y eficiente detección de defectos hematopoyéticos. Los investigadores pueden derribar ciertas vías genéticas con MOs y placa digerido animales para ver si el gen juega un papel en la hematopoyesis. Además, pescado mutante (previamente generado o recién generado en las pantallas de mutagénesis) puede ser evaluada rápidamente y fácilmente. Estos ensayos también permiten eficientes drogas ensayos de investigación sobre organismos vivos, todo para identificar a la modulación de la biología de la HSPC mientras que también siendo capaces de observar si las drogas tienen un efecto negativo sobre el desarrollo o supervivencia. Estos ensayos permiten la cuantificación de HSPCs en el pez cebra en desarrollo en diferentes puntos de tiempo. Mientras que varios estudios han intentado cuantificar número de HSC en adultos7,27,30,41 y embrión de pez cebra3,4,42, 43, ningunos estudios han cuantificado las cantidades diferentes de restricción de linaje HSPCs en pez cebra. Además, estos ensayos pueden ser utilizados para examinar y modulan vías moleculares importantes en la formación de células sanguíneas y diferenciación, un proceso que sigue siendo enigmático.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

La financiación fue proporcionada por los institutos nacionales de salud (NIH: DK087814-K01-01A1 a D.L.S.), el programa de Universidad del estado de California para la educación y la investigación en biotecnología (CSUPERB: Control Molecular del nicho hematopoyético vertebrados a D.L.S.) y de la oficina de estudios de posgrado en el Chico de la Universidad Estatal de California (a A.C.B.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Bovine Serum Albumin in Iscove's MDM StemCell Technologies  9300
DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+ Life Technologies 14080-055
HyClone PBS (1x) GE Healthcare Life Sciences sh30256.01
 DMEM 500 mL Corning CellGrow 10-017-CV
 Ham's F12 500 mL Corning CellGrow 10-080-CV
FBS 500 mL Gemini Bio-Products 100-108
HEPES 100 mL (1 M) Gibco life technologies 15-630-080
Penicillin/streptomycin (5000 U/mL
and 5000 mg/mL) with L-Glutamine (200 mM)
Corning Mediatech 30-009-CI
Gentamycin Sulfate 10 mL (50 mg/mL) Corning Mediatech 30-005-CR
1.5 mL MCF tube FisherBrand 05-408-129
3 mL 23gx1 injection needle with Luer lock BD Safety Glide 305905
5 mL polystyrene round bottom tube with cell strainer cap Corning Falcon 352235
Methocel MC Sigma-Aldrich 64630
14 mL Polystyrene round bottom tube Corning Falcon 352057
10 mm polystyrene easygrip Petri dish Corning Falcon 351008
Librease TM Roche Sigma-Aldrich 5401119001 dissociation protease
Pronase Roche Sigma-Aldrich 11459643001 dechorionation protease
15 cm Petri dish Corning Falcon 351058
AB Zebrafish International Resource Center (ZIRC) ZL1 zebrafish strain used
Dithiolthreitol (DTT) Sigma-Aldrich 646563

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
  2. Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
  3. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
  4. Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
  5. Bertrand, J. Y., Kim, A. D., Teng, S., Traver, D. CD41+ cmyb+ precursors colonize the zebrafish pronephros by a novel migration route to initiate adult hematopoiesis. Development. 135, 1853-1862 (2008).
  6. Bertrand, J. Y., et al. Definitive hematopoiesis initiates through a committed erythromyeloid progenitor in the zebrafish embryo. Development. 134, 4147-4156 (2007).
  7. Ma, D., Zhang, J., Lin, H. F., Italiano, J., Handin, R. I. The identification and characterization of zebrafish hematopoietic stem cells. Blood. 118, 289-297 (2011).
  8. Lam, E. Y., Hall, C. J., Crosier, P. S., Crosier, K. E., Flores, M. V. Live imaging of Runx1 expression in the dorsal aorta tracks the emergence of blood progenitors from endothelial cells. Blood. 116, 909-914 (2010).
  9. Lam, E. Y., et al. Zebrafish runx1 promoter-EGFP transgenics mark discrete sites of definitive blood progenitors. Blood. 113, 1241-1249 (2009).
  10. Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106, 3803-3810 (2005).
  11. Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
  12. Weinstein, B. M., et al. Hematopoietic mutations in the zebrafish. Development. 123, 303-309 (1996).
  13. Ransom, D. G., et al. Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis. Development. 123, 311-319 (1996).
  14. Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).
  15. Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383, 829-832 (1996).
  16. Yeh, J. R., et al. Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation. Nat Chem Biol. 5, 236-243 (2009).
  17. Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis. Zebrafish. 7, 61-68 (2010).
  18. Ridges, S., et al. Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia. Blood. 119, 5621-5631 (2012).
  19. North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
  20. Astuti, Y., et al. A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing. Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).
  21. Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
  22. Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241, 58-62 (1988).
  23. Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1, 661-673 (1994).
  24. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
  25. Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nat Med. 3, 1337-1345 (1997).
  26. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183, 1797-1806 (1996).
  27. Gansner, J. M., et al. Sorting zebrafish thrombocyte lineage cells with a Cd41 monoclonal antibody enriches hematopoietic stem cell activity. Blood. 129, 1394-1397 (2017).
  28. Smith, A. C., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115, 3296-3303 (2010).
  29. Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat Protoc. 5, 383-394 (2010).
  30. de Jong, J. L., et al. Characterization of immune-matched hematopoietic transplantation in zebrafish. Blood. 117, 4234-4242 (2011).
  31. Wolf, A., et al. Zebrafish Caudal Haematopoietic Embryonic Stromal Tissue (CHEST) Cells Support Haematopoiesis. Sci Rep. 7, 44644 (2017).
  32. Campbell, C., et al. Zebrafish embryonic stromal trunk (ZEST) cells support hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) proliferation, survival, and differentiation. Exp Hematol. 43, 1047-1061 (2015).
  33. Svoboda, O., et al. Dissection of vertebrate hematopoiesis using zebrafish thrombopoietin. Blood. 124, 220-228 (2014).
  34. Stachura, D. L., et al. The zebrafish granulocyte colony-stimulating factors (Gcsfs): 2 paralogous cytokines and their roles in hematopoietic development and maintenance. Blood. 122, 3918-3928 (2013).
  35. Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118, 1274-1282 (2011).
  36. Stachura, D. L., et al. Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis. Blood. 114, 279-289 (2009).
  37. Svoboda, O., et al. Ex vivo tools for the clonal analysis of zebrafish hematopoiesis. Nat Protoc. 11, 1007-1020 (2016).
  38. Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110, 2718-2726 (2007).
  39. Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 133, 11-53 (2016).
  40. Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
  41. Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111, 1131-1137 (2008).
  42. Henninger, J., et al. Clonal fate mapping quantifies the number of haematopoietic stem cells that arise during development. Nat Cell Biol. 19, 17-27 (2017).
  43. Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160, 241-252 (2015).
Desarrollo de un ensayo <em>In Vitro</em> para cuantificar Progenitor y vástago hematopoyética células (HSPCs) en el desarrollo de embriones de pez cebra
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berrun, A. C., Stachura, D. L. Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (129), e56836, doi:10.3791/56836 (2017).More

Berrun, A. C., Stachura, D. L. Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (129), e56836, doi:10.3791/56836 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter