Desarrollo de un ensayo In Vitro para cuantificar Progenitor y vástago hematopoyética células (HSPCs) en el desarrollo de embriones de pez cebra
Summary
Aquí, presentamos un método simple para cuantificar madre y progenitoras células hematopoyéticas (HSPCs) en el pez cebra embrionario. HSPCs de pez cebra disociado se platean en metilcelulosa con factores de apoyo, diferenciando en sangre madura. Esto permite la detección de sangre defectos y permite para realizarse fácilmente de detección de drogas.
Abstract
La hematopoyesis es un proceso celular esencial en el que las células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPCs) se diferencian en la multitud de linajes celulares diferentes que conforman la sangre madura. Aislamiento e identificación de estos HSPCs es difícil porque son definidos ex post facto; puede ser definidos sólo después de su diferenciación en linajes de células específicas. En las últimas décadas, el pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en un organismo modelo para el estudio de la hematopoyesis. Embriones de pez cebra desarrollan ex úteroy por la fertilización después de 48 h (hpf) han generado definitivo HSPCs. ensayos para evaluar la diferenciación HSPC y han desarrollado capacidades de proliferación, utilizando el trasplante y posterior reconstitución del sistema hematopoyético además visualizar líneas transgénicas especializadas con microscopía confocal. Sin embargo, estos ensayos son de costo prohibitivo, técnicamente difícil y desperdiciador de tiempo para muchos laboratorios. Desarrollo de un modelo en vitro para evaluar HSPCs sería rentable, más rápido y presentan menos dificultades comparadas anteriormente describen métodos, permitiendo a los laboratorios evaluar rápidamente pantallas de mutagénesis y drogas que afectan la biología de la HSPC. Este ensayo novela en vitro para evaluar la HSPCs se realiza en embriones de pez cebra todo chapado disociado y agregando factores exógenos que promueven la proliferación y diferenciación de la HSPC. Embriones son disociados en las células y plateados con apoyo HSPC factores estimulantes de Colonia que hacer generar unidades formadoras de colonias (UFC) que surgen de una célula del progenitor único. Estos ensayos permitirán examinación más cuidadosa de las vías moleculares responsables de la proliferación, diferenciación y regulación, que permitirá a los investigadores a entender los fundamentos de la hematopoyesis vertebrado y su dysregulation HSPC durante la enfermedad.
Introduction
La hematopoyesis es el proceso de hacer que la multitud de células maduras de la sangre necesaria para la supervivencia de un organismo. Es un proceso clave de desarrollo que consiste en la diferenciación de las células madre hematopoyéticas (HSCs) en una variedad de tipos celulares desarrollo restringido que comprenden sangre madura. Las HSCs uno deben renovar para que el sistema nunca se agota y deben persistir de desarrollo embrionario hasta la muerte. En los vertebrados, la constante diferenciación y proliferación de las células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPCs) se necesitan para reponer adecuadamente la mayoría de las células sanguíneas que son poste-mitotic y se reciclan todos los días. HSCs generan células sanguíneas maduras distinguiendo primero en subconjuntos de células progenitoras restringido; común progenitores linfoides (CLPs)1, que finalmente producen las células T, B y NK y de progenitores mieloides (CMP) común2 que generan los granulocitos, eritrocitos, macrófagos y megacariocitos. Estos progenitores comprometidos a generar linajes celulares específicos y además se diferencian en más células progenitoras desarrollo restringido como progenitores mieloide eritroide (MEPs) que generan los eritrocitos y las plaquetas o granulocitos progenitores del macrófago (GMPs) que generan los basófilos, eosinófilos, neutrófilos y los macrófagos2. Identificar y aislar a estos progenitores permiten la identificación de importantes vías moleculares implicadas en la diferenciación Hematopoyética y muchas enfermedades hematopoyéticas, como la leucemia se presentan cuando estas células progenitoras no correctamente distinguir.
En las últimas décadas, el sistema de modelo de pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en una herramienta clave de investigación para estudios hematopoyéticos embrionarios y adultos. Pez cebra son susceptible de análisis genético y las especies modelo vertebrados filogenéticamente más bajas que tienen un similar vasculatura y sistema hematopoyético a los seres humanos. Desarrollan de embriones de pez cebra ex útero, y dentro de 48 horas post fecundación (hpf) generan HSPCs3,4,5,6,7,8. Pez cebra son también altamente fecundo, con hembras sobre 100 huevos en un solo embrague, lo que permite tamaños de muestra grandes y replicación experimental. Los embriones de pez cebra son ópticamente transparentes, que permite la visualización microscópica del sistema hematopoyético. Varias líneas transgénicas fluorescentes del pez cebra marca HSCs como runx1: EGFP pescado9, cd41: EGFP peces10, y kdrl:mCherry; CMYB: animales de doble positivo de3 de GFP, permitir la visualización en tiempo real, vivo de HSC aparición y expansión en vivo3,4,7,8, 9. Generación rápida tiempo y desarrollo ex útero del pez cebra ha conducido a su uso en mutagénesis estudios11,12,13,14,15 y proyección16,17,18,19,20 compuestos que promesa terapéutica para trastornos de la sangre humana. En general, conservación del sistema hematopoyético, la presencia y desarrollo de líneas transgénicas y tiempo de regeneración rápida ha hecho el pez cebra un modelo barato, rápido, flexible e ideal para estudios hematopoyéticos.
Se han desarrollado numerosos métodos de aislamiento y pruebas de HSCs en mamíferos sistemas hematopoyéticos. Los investigadores pueden utilizar una combinación de receptores de superficie celular para marcar HSCs21,22,23,24, así como aprovechar la capacidad de HSCs de emanación tinte25,26. Después están rotuladas, celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación permite su separación física. Demostrando que una célula es una HSC requiere irradiar un animal del anfitrión para destruir HSPCs endógenas, transplante de HSCs putativas y observando que a largo plazo, multilineal reconstitución de todo maduras tipos de células sanguíneas. Estas pruebas funcionan bien en ratones, ya que hay numerosos anticuerpos de superficie celular contra las células hematopoyéticas y cepas consanguíneas de ratón que facilitan el inmunes que empareja para el trasplante. Sin embargo, pocos anticuerpos de superficie de la célula hematopoyética de pez cebra han sido generado27, lo que dificulta la identificación y aislamiento de HSCs. La forma más común de marcar y aislar HSCs de pez cebra es con animales transgénicos, por el que una secuencia de promotor de la célula-específica está impulsando la expresión de una proteína fluorescente. Estudios han visualizado y enumerar las HSCs en la pared ventral de la aorta dorsal con microscopía utilizando esta técnica3,4,8,9. Otros laboratorios han generado variedades clonales de pez cebra28,29 y han realizado trasplantes exitosos en animales emparejados MHC30. Sin embargo, estas técnicas son costo prohibitivo para muchos laboratorios, son técnicamente difíciles y son lentos. Para abordar estas cuestiones, los laboratorios han generado diversos estudios en vitro para probar para la presencia, las tasas de proliferación y la capacidad de diferenciación de HSPCs31,32,33, 34,35,36. Estos ensayos muestran proliferación y diferenciación de HSPCs en vitro31,32,33,34,35,36, el rescate de defectos hematopoyéticas36y un método eficaz para descubrir y probar citoquinas33,34,35. También se han utilizado para identificar los genes responsables de la HSPC biología31,32. En este estudio, tomamos estos análisis un paso más, permitiendo la cuantificación de HSPCs en un embrión de pez cebra en desarrollo. Estos ensayos también pueden ser utilizados para cuantificar el número de HSPCs en animales mutantes y animales trataron con fármacos hematopoyéticos no disruptivo. En esencia, estos ensayos son rápidos, presentes pocas dificultades técnicas y baratas formas de cuantificar números HSPC, examinar su proliferación e investigar bloques en diferenciación.
Protocol
Representative Results
Discussion
El sistema de modelo de pez cebra se ha convertido en un modelo eficiente, eficaz y barato para el estudio de la hematopoyesis vertebrada primitiva y definitiva. Generación de análisis rápido, barato y presentar algunas dificultades técnicas que puede utilizarse para pruebas de moléculas pequeñas, analizar embriones mutantes y dilucidar las vías moleculares importantes para la biología de la HSPC. In vitro la galjanoplastia de HSPCs de pez cebra adulto es un método eficaz para el estudio de mutagénesis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La financiación fue proporcionada por los institutos nacionales de salud (NIH: DK087814-K01-01A1 a D.L.S.), el programa de Universidad del estado de California para la educación y la investigación en biotecnología (CSUPERB: Control Molecular del nicho hematopoyético vertebrados a D.L.S.) y de la oficina de estudios de posgrado en el Chico de la Universidad Estatal de California (a A.C.B.).
Materials
| 10% Bovine Serum Albumin in Iscove's MDM | StemCell Technologies | 9300 | |
| DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
| DMEM 500 mL | Corning CellGrow | 10-017-CV | |
| Ham's F12 500 mL | Corning CellGrow | 10-080-CV | |
| FBS 500 mL | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
| HEPES 100 mL (1 M) | Gibco life technologies | 15-630-080 | |
| Penicillin/streptomycin (5000 U/mL and 5000 mg/mL) with L-Glutamine (200 mM) |
Corning Mediatech | 30-009-CI | |
| Gentamycin Sulfate 10 mL (50 mg/mL) | Corning Mediatech | 30-005-CR | |
| 1.5 mL MCF tube | FisherBrand | 05-408-129 | |
| 3 mL 23gx1 injection needle with Luer lock | BD Safety Glide | 305905 | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube with cell strainer cap | Corning Falcon | 352235 | |
| Methocel MC | Sigma-Aldrich | 64630 | |
| 14 mL Polystyrene round bottom tube | Corning Falcon | 352057 | |
| 10 mm polystyrene easygrip Petri dish | Corning Falcon | 351008 | |
| Librease TM | Roche Sigma-Aldrich | 5401119001 | dissociation protease |
| Pronase | Roche Sigma-Aldrich | 11459643001 | dechorionation protease |
| 15 cm Petri dish | Corning Falcon | 351058 | |
| AB | Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | ZL1 | zebrafish strain used |
| Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 |
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