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Immunology and Infection

चयापचय मानचित्रण: मात्रात्मक एंजाइम Cytochemistry और Histochemistry कोशिकाओं और ऊतकों में Dehydrogenases की गतिविधि निर्धारित करने के लिए

Published: May 26, 2018 doi: 10.3791/56843
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Cancer Center Amsterdam, Department of Medical Biology, Academic Medical Center, University of Amsterdam, Amsterdam, The Netherlands

Summary

यहां, हम एक प्रोटोकॉल है कि microscopically कल्पना और कोशिकाओं और ऊतकों और उसके कैनेटीक्स, समारोह और उपसेलुलर स्थानीयकरण में dehydrogenases की गतिविधि यों तो इस्तेमाल किया जा सकता है प्रस्तुत करते हैं ।

Abstract

बदल सेलुलर चयापचय कई रोगों की एक बानगी है, कैंसर सहित, हृदय रोगों और संक्रमण. कोशिकाओं की चयापचय मोटर इकाइयों एंजाइमों और उनकी गतिविधि भारी transcriptional, mRNA स्थिरता, शोधों, पोस्ट-शोधों और कार्यात्मक स्तर सहित कई स्तरों पर विनियमित है । इस जटिल विनियमन का अर्थ है कि पारंपरिक मात्रात्मक या इमेजिंग परख, जैसे मात्रात्मक mRNA प्रयोगों, पश्चिमी दाग और immunohistochemistry, अपूर्ण एंजाइमों की अंतिम गतिविधि के बारे में जानकारी उपज, उनके कार्य और/ उनके सेलुलर स्थानीयकरण । मात्रात्मक एंजाइम cytochemistry और histochemistry (यानी, चयापचय मानचित्रण) एक लगभग सच करने के लिए प्रकृति की स्थिति में सीटू एंजाइमी गतिविधि और इसके कैनेटीक्स, समारोह और उपसेलुलर स्थानीयकरण में पर गहराई से जानकारी दिखाते हैं ।

हम dehydrogenases की गतिविधि का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन, जो एंजाइमों कि redox प्रतिक्रियाओं प्रदर्शन कर रहे हैं जैसे कि णड (पी) के रूप में cofactors को कम करने के लिए+ और सनक. कोशिकाओं और ऊतक वर्गों एक मध्यम है कि एक डिहाइड्रोजनेज की एंजाइमी गतिविधि के लिए विशिष्ट है में मशीन हैं । बाद में, डिहाइड्रोजनेज कि जांच का विषय है अपनी एंजाइमी गतिविधि में अपनी सेलुलर साइट करता है । प्रतिक्रिया माध्यम के साथ एक रासायनिक प्रतिक्रिया में, यह अंततः है डिहाइड्रोजनेज गतिविधि के स्थल पर नीले रंग formazan उत्पंन करता है । formazan के अवशोषण इसलिए डिहाइड्रोजनेज की गतिविधि का एक सीधा उपाय है और रंग प्रकाश माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण का उपयोग कर quantified जा सकता है । इस प्रोटोकॉल के मात्रात्मक पहलू शोधकर्ताओं इन परख से सांख्यिकीय निष्कर्ष आकर्षित करने के लिए सक्षम बनाता है ।

प्रेक्षणीय अध्ययन के अलावा, इस तकनीक विशिष्ट एंजाइमों के निषेध अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस संदर्भ में, अध्ययन सही से लाभ चयापचय मानचित्रण के प्रकृति लाभ, सीटू परिणाम है कि शारीरिक रूप से अधिक से अधिक प्रासंगिक हो सकता है में देने से इन विट्रो एंजाइम संकोच अध्ययन. सभी में, चयापचय मानचित्रण सेलुलर या ऊतक के स्तर पर चयापचय का अध्ययन करने के लिए एक अनिवार्य तकनीक है । तकनीक को अपनाने के लिए आसान है, में प्रदान करता है गहराई से, व्यापक और एकीकृत चयापचय जानकारी और तेजी से मात्रात्मक विश्लेषण सक्षम बनाता है ।

Introduction

सेलुलर फिजियोलॉजी की एक अनिवार्य आधारशिला चयापचय है । चयापचय सभी शारीरिक प्रक्रियाओं के लिए आवश्यक ऊर्जा के साथ कोशिकाओं को प्रदान करता है, macromolecular के लिए इमारत ब्लॉकों बचाता है, और अपशिष्ट उत्पादों, विषाक्त अणुओं और विधानसभा के संबंध में सेलुलर homeostasis को नियंत्रित और अनावश्यक या बेकार सेलुलर घटकों के पुनर्चक्रण । एंजाइमों उत्प्रेरित लगभग सभी महत्वपूर्ण सेलुलर रासायनिक प्रतिक्रियाओं और इसलिए कोशिकाओं के फिजियोलॉजी में मोटर इकाइयों रहे हैं । 1 , 2

एंजाइमों की गतिविधि कसकर कई स्तरों पर विनियमित है और इसलिए मात्रात्मक एंजाइम histochemistry और cytochemistry (चयापचय मानचित्रण भी कहा जाता है) सीटू मेंएंजाइम गतिविधि का अध्ययन करने के लिए पसंदीदा तरीका है. transcriptional स्तर पर, mRNA में जीन अभिव्यक्ति विनियमित है । प्रतिलेखन के विनियमन के प्रभाव जैसे microarrays या प्रत्यक्ष आरएनए अनुक्रमण, या गुणात्मक mRNA परख, जैसे में-सीटू संकरण जो (उप) सेलुलर पर जानकारी देता है के रूप में मात्रात्मक mRNA परख, का उपयोग कर निर्धारित किया जा सकता mRNA अणुओं का स्थानीयकरण । यह यह संभव कोशिकाओं के बीच transcriptional गतिविधि में सापेक्ष मतभेद की सराहना करने के लिए बनाता है । हालांकि, व्याख्या और चयापचय गतिविधि के संबंध में इन mRNA परख की वैधता जटिल है क्योंकि विनियमन भी mRNA स्तर पर होता है, जहां अनुक्रम और mRNA अणुओं की स्थिरता के बाद यह डीएनए से लिखित है संपादित कर रहे हैं । इस संपादन ribosomes पर प्रोटीन isoform अनुवाद और प्रोटीन अनुवाद मात्रा को नियंत्रित करता है । इसके अलावा, प्रोटीन अनुवाद की प्रक्रिया को नियंत्रित किया जाता है और अंततः एंजाइम अभिव्यक्ति और इसलिए गतिविधि को प्रभावित करता है । aforementioned विनियामक कदम के संयुक्त प्रभाव इस तरह के रूप में पश्चिमी सोख्ता या रिवर्स चरण प्रोटीन lysate microarrays, या गुणात्मक प्रोटीन अभिव्यक्ति परख, के रूप में मात्रात्मक प्रोटीन अभिव्यक्ति परख, का उपयोग की सराहना की जा सकती है immunocytochemistry और immunohistochemistry, लेकिन इन तकनीकों में प्रोटीन के बाद के अनुवाद संशोधन के रूप में बहाव विनियामक प्रभाव और उनकी भीड़ microenvironment में एंजाइमों के कार्यात्मक विनियमन शामिल करने में विफल । इसके अलावा, एक एंजाइम की अभिव्यक्ति खराब अपनी गतिविधि के साथ सहसंबंधी हो सकता है, ताकि कोशिका या ऊतक homogenates या पतला समाधान में एक शुद्ध एंजाइम के गतिविधि माप व्यापक रूप से एंजाइम गतिविधि अध्ययन के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । हालांकि, इन प्रयोगों एक एंजाइम की गतिविधि पर एक भीड़ compartmentalized कोशिका द्रव्य या organelle के प्रभाव को दोहराने के लिए असफल । इसके अलावा, सभी aforementioned तकनीक या तो मात्रा या mRNA या एंजाइम अभिव्यक्ति के स्थानीयकरण निर्धारित करते हैं, लेकिन एंजाइम अभिव्यक्ति के इन पहलुओं के दोनों पर व्यापक जानकारी देने में असमर्थ हैं, अकेले चलो इस के एकीकरण एंजाइम गतिविधि निर्धारण के साथ जानकारी । 2 , 3 , 4

चयापचय मानचित्रण aforementioned चर के सभी की सराहना की अनुमति देता है कि एक एंजाइम की गतिविधि निर्धारित करते हैं । क्या अधिक है, चयापचय मानचित्रण कोशिकाओं और ऊतकों है कि विश्लेषण के दौरान बरकरार रखा जाता है के साथ सेल या ऊतक इमेजिंग का एक रूप है एक लगभग सच करने के लिए प्रकृति स्थिति एंजाइमों की गतिविधि के डेटा उत्पन्न करने के लिए उत्पन्न करने के लिए. यह एक कोशिका या ऊतक डिब्बे के भीतर एंजाइम गतिविधि के रूप में अच्छी तरह से मजबूत ठहराव एंजाइम गतिविधि के स्थान की दोनों विस्तृत सराहना की सुविधा है कि छवियों का उत्पादन. 3 , 4 प्रोटोकॉल dehydrogenases की गतिविधि के चयापचय मानचित्रण के लिए यहां वर्णित सभी उपलब्ध एंजाइम histochemical तरीकों की प्रयोगशाला मैनुअल पर आधारित हैं,5 मात्रात्मक एंजाइम histochemistry के सिद्धांतों पर,6 और पर मात्रात्मक चयापचय मानचित्रण की छवि विश्लेषण । 4

Dehydrogenases एंजाइम हैं जो विहित cofactors को कम करने के लिए redox प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन करते हैं जैसे णड+, NADP+ और सनक को नध, NADPH और फॊध२क्रमशः. बरकरार कोशिकाओं या cryostat ऊतक वर्गों है कि रासायनिक तय नहीं कर रहे हैं एक प्रतिक्रिया माध्यम है जो में शामिल हैं, अन्य रिएजेंट के बीच में, सब्सट्रेट और cofactors एक विशिष्ट डिहाइड्रोजनेज और एक tetrazolium नमक की मशीन. बाद में, कि डिहाइड्रोजनेज अपनी उत्प्रेरक गतिविधि करता है और कम कर देता है, उदाहरण के लिए, NADP+ NADPH । एक इलेक्ट्रॉन वाहक के द्वारा, 2 NADPH अणुओं अंततः 1 पानी में घुलनशील अर्द्ध बेरंग tetrazolium नमक अणु को कम करने के लिए 1 जल अघुलनशील नीले formazan अणु कि तुरंत डिहाइड्रोजनेज के स्थल पर हाला. इसलिए, उपजी formazan के अवशोषण एक डिहाइड्रोजनेज की स्थानीय गतिविधि का एक सीधा उपाय है और प्रकाश माइक्रोस्कोपी या रंग प्रकाश माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण का उपयोग कर quantified का उपयोग कर मनाया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल के मात्रात्मक पहलू शोधकर्ताओं इन परख से सांख्यिकीय निष्कर्ष आकर्षित करने के लिए सक्षम बनाता है । इसके अलावा, इस ठहराव इस तरह के अधिक से अधिक एंजाइम गतिविधि (वीमैक्स) और एक एंजाइम (Km) के लिए एक सब्सट्रेट के अपनत्व के रूप में सीटू काइनेटिक एंजाइम पैरामीटर, के निर्धारण की सुविधा. 3 , 4 , 5 , ६

जब एक चयापचय मानचित्रण प्रयोग की योजना बना, यह है कि प्रयोग के प्रति एहसास महत्वपूर्ण है, सेल की तैयारी या ऊतक वर्गों का पालन के साथ ५० ग्लास स्लाइड की एक अधिकतम क्रम में लगातार प्राप्त करने के लिए मशीन के दौरान समय देरी कम करने के लिए सिफारिश कर रहे है परिणाम. जब इन प्रोटोकॉल चरणों को एक से अधिक प्रयोगकर्ता द्वारा सहकारी रूप से बाहर किया जाता है, तो अधिक स्लाइड्स और/या मध्यम रचनाओं को संसाधित करना संभव है । इसके अलावा, कुछ परिवर्तनशीलता प्रयोगों के बीच मौजूद है । इसलिए, समान प्रयोगों प्रत्येक सेल तैयारी या प्रत्येक ऊतक नमूने से वर्गों और उचित नियंत्रण से cytospins के साथ कम से कम 3 बार दोहराया जाना चाहिए प्रत्येक प्रयोग में शामिल किया जाना चाहिए. हमेशा सब्सट्रेट के अभाव में एक नियंत्रण गर्मी मध्यम तैयार है, लेकिन cofactors की उपस्थिति में गैर विशिष्ट एंजाइम गतिविधि धुंधला के लिए नियंत्रित करने के लिए. सबसे प्रतिनिधि परिणामों के प्रयोगों में प्राप्त कर रहे हैं, जहां अलग सब्सट्रेट/cofactor सांद्रता ऊतक वर्गों या एक ही नमूना से सेल की तैयारी के लिए लागू कर रहे हैं, ताकि प्रयोगकर्ता एंजाइम कैनेटीक्स का विश्लेषण प्रदर्शन कर सकते हैं खुराक-गतिविधि घटता ।

Protocol

यह प्रोटोकॉल अकादमिक चिकित्सा केंद्र के चिकित्सा-नैतिक समीक्षा बोर्ड के मानव सामग्री के उपयोग पर दिशानिर्देश का पालन करता है ।

1. कोशिकाओं या ऊतक वर्गों की तैयारी

  1. कक्षों
    1. संस्कृति व्यंजन से Trypsinize कोशिकाओं का उपयोग कर ०.२५% trypsin-EDTA 5 मिनट के लिए ३७ ° c में एक 10 मिमी पेट्री पकवान में और कोशिकाओं लाने के एक ३७ ° c के निलंबन में 50000-200000 कोशिकाओं/एमएल, कोशिकाओं के आकार पर निर्भर करता है ।
    2. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 20 एक्स जी में एक cytocentrifuge में cytospin कीप का उपयोग सूक्ष्म स्लाइड पर सेल निलंबन के २०० µ एल संलग्न करें ।
    3. एयर शुष्क कमरे के तापमान पर 24 घंटे के लिए cytospins । यह डिहाइड्रोजनेज गतिविधि को प्रभावित नहीं करता है । 5
  2. ऊतक वर्गों
    1. नैतिक परमिट के अनुसार रोगियों या जानवरों से ऊतक निकालें । 10 मिमी3 ऊतक के कई प्रयोगों के लिए पर्याप्त है ।
    2. छोटे सुराख में ऊतक के टुकड़े डाल 2 मिलीलीटर प्लास्टिक शीशियों और स्नैप-फ्रीज तरल नाइट्रोजन में ऊतक के टुकड़े युक्त शीशियों ।
    3. आगे की प्रोसेसिंग तक − ८० ° c पर टिशू पीस वाली शीशियों को स्टोर कर लें ।
    4. एक जेल की तरह का प्रयोग करें इष्टतम काटने तापमान (OCT) नामक एक चक पर ऊतक का नमूना है कि नीचे जमा देता है-20 डिग्री सेल्सियस करने के लिए-25 डिग्री सेल्सियस तेजी से, ताकि पानी क्रिस्टल फार्म नहीं कर सकते हैं ।
    5. काटने के लिए एक cryostat का प्रयोग करें और पहले इच्छित स्तर तक ब्लॉक ट्रिम (आदर्श रूप से आधा एक माइक्रोस्कोपी ग्लास स्लाइड की चौड़ाई, 5 मिमी x 5 मिमी उदा ).
    6. अनुभाग पर, उपयोग ब्रश और एक विरोधी रोल प्लेट ऊपर की ओर कर्लिंग से वर्गों को रोकने के लिए ।
    7. एक धीमी लेकिन लगातार गति पर 6-10 µm-मोटी वर्गों में ऊतक के नमूनों में कटौती (अनुभाग प्रति 1 एस) । जब कोई सेक्शन सही तरीके से कट जाता है तो एंटी-रोल प्लेट के नीचे microtome चाकू पर फ्लैट बना रहता है ।
    8. microscopical ग्लास स्लाइड पर 1-3 वर्गों उठाओ और उपयोग जब तक − ८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । तैयार वर्गों की संख्या ऊतक नमूने के आकार और वर्गों की वांछित मोटाई पर निर्भर करता है ।

2. घुलनशील Dehydrogenases के लिए एंजाइम Histo/Cytochemistry

  1. प्रतिक्रिया बफ़र तैयार कर रहा है ।
    1. सही पीएच के फॉस्फेट बफर की १०० मिलीलीटर तैयार ( तालिका 1देखें; हर एंजाइम एक इष्टतम पीएच है जिस पर अपनी गतिविधि उच्चतम है) । उदाहरण के लिए, ०.१ मीटर KH2पीओ4 (अम्लीय) और ०.१ एम ना2HPO4 (बेसिक) के मिश्रण समाधान जब तक सही पीएच के साथ एक बफर बनाया है ।
    2. PVA धूल और विषाक्त है के रूप में एक धुएं डाकू के तहत फॉस्फेट बफर में polyvinyl शराब (PVA) के 18 जी वजन ।
      1. १०० ° c पर फास्फेट बफर में 18% डब्ल्यू/वी PVA को भंग बफर au bain marie वार्मिंग द्वारा (उबलते पानी में कांच की बोतल डाल) और जब तक PVA पूरी तरह से भंग है सरगर्मी । समाधान तो पारदर्शी होगा, छोटे हवा के बुलबुले के साथ जो चमचे के कारण होते हैं । यह आम तौर पर PVA के लिए ~ 15 मिनट की आवश्यकता को भंग ।
        नोट: फॉस्फेट बफर में 18% डब्ल्यू/वी PVA चिपचिपा है और 15 मिलीलीटर प्रतिक्रिया बफर ट्यूबों एक व्यापक पिपेट का उपयोग करने के लिए हस्तांतरित किया जा सकता है । फॉस्फेट बफर में 18% डब्ल्यू/वी PVA के अल्पकालिक भंडारण ≥ ४० डिग्री सेल्सियस और ≥ ६० डिग्री सेल्सियस पर लंबी अवधि के भंडारण (2 सप्ताह तक) पर हो जाना चाहिए । २५० फॉस्फेट बफर में 18% डब्ल्यू/वी PVA के µ एल आम तौर पर एक cytospin तैयारी के लिए आवश्यक है, जबकि ५०० µ एल एक ऊतक अनुभाग के लिए आवश्यक है ।
    3. tetrazolium नमक (nitroBT) घोल तैयार करें । हर 1 मिलीलीटर की मशीन के लिए, nitroBT समाधान के ४० µ l की आवश्यकता है, जिसमें nitroBT के 5 मिलीग्राम (एक पीला पाउडर) 20 µ एल dimethylformamide (DMF) और 20 µ एल के मिश्रण में भंग किया गया है, जो एक हल्का पीला पारदर्शी समाधान होगा ।
      नोट: क्योंकि nitroBT की स्थिरता सभी आवश्यक रिएजेंट की सबसे कम है, यह nitroBT स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए पिछले और प्रतिक्रिया मध्यम पहले में nitroBT भंग की सिफारिश की है ।
      1. DMF और इथेनॉल में nitroBT भंग समय की एक छोटी अवधि के दौरान एक गिलास शीशी में हीटिंग द्वारा (~ 10 एस) एक Bunsen बर्नर का उपयोग कर । ताप के दौरान शीशी को हिलाएं और वाष्पीकरण को रोकने के लिए शीशी को भी लौ में लंबे समय तक न छोड़ें ।
      2. भंग प्रक्रिया के दौरान DMF और इथेनॉल के वाष्पीकरण के लिए अनुमति देने के लिए 10% अतिरिक्त nitroBT समाधान बनाओ ।
    4. ढाल इलेक्ट्रॉन वाहक phenazine methosulfate (पीएमएस) या (1-methoxy)-phenazine methosulfate (mPMS), और मशीन मीडिया ग्लास भंडारण शीशी के आसपास टिनफॉईल लपेटकर प्रत्यक्ष प्रकाश से एम (पीएमएस) युक्त ।
    5. तालिका 1 के अनुसार पुनर्अभिकर्ता समाधान तैयार करें उन्हें आसुत एच2ओ में भंग करके । कुछ रिएजेंट तेजी से नाश करते हैं, इसलिए जितनी जल्दी हो सके प्रयोग से पहले उन्हें तैयार करें । बर्फ पर या उपयोग करने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर एजेंट समाधान रखें ।
    6. तालिका 1 में दिखाए गए के रूप में मशीन मीडिया तैयार करें और कोमल सरगर्मी से प्रत्येक चरण के बाद समाधान homogenize । लगातार क्रियाशीलता और रंग को उभारते हुए मशीनी माध्यम की सतह के नीचे रखने से हवा के बुलबुले की पीढ़ी से बचें ।
  2. ऊतक वर्गों के लिए मशीन माध्यम लागू
    1. cytospins या ऊतक वर्गों के साथ पूर्व गर्म माइक्रोस्कोपी स्लाइड ३७ ° c में एक immunohistochemistry मशीन चैंबर में संलग्न 15 मिनट के लिए गर्म पानी के साथ immunohistochemistry मशीन चैंबर के नीचे जलमग्न में एक निरंतर तापमान बनाए रखने के लिए मशीन.
    2. ध्यान से तोड़ या व्यापक भाग के लिए संकीर्ण से संक्रमण पर पाश्चर पिपेट बंद देखा । नियमित रूप से पाश्चर पिपेट भी चिपचिपा गर्मी मध्यम महाप्राण करने के लिए संकीर्ण कर रहे हैं, तो इस कदम के लिए पर्याप्त पाश्चर पिपेट मशीन माध्यम की आकांक्षा के लिए व्यापक बनाने की जरूरत है ।
    3. एक पाश्चर पिपेट के विस्तृत भाग का उपयोग कर सूक्ष्म स्लाइड पर प्रत्येक कोशिका तैयारी या ऊतक अनुभाग के लिए उपयुक्त मशीन माध्यम के 250-500 µ एल लागू करें ।
    4. पिपेट टिप का उपयोग करने के लिए बाहर की मशीन मध्यम समान रूप से फैल । इन सतह के लिए नाव और माइक्रोस्कोपी स्लाइड पर सेल तैयारी या ऊतक अनुभाग में एंजाइमी प्रतिक्रिया के साथ हस्तक्षेप नहीं होगा क्योंकि, गर्मी के माध्यम में छोटे हवा बुलबुले उपेक्षा ।
    5. एक ३७ ° c मशीन में माइक्रोस्कोप स्लाइड पर सेल की तैयारी या ऊतक वर्गों की मशीन (उदा. एक पूर्व निर्दिष्ट अवधि के लिए एक ऊतक संस्कृति मशीन), एंजाइम कैनेटीक्स और एक विशेष सेल तैयारी में अपनी अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है या ऊतक (तालिका 1) । बाहर सुखाने से प्रतिक्रिया बफर को रोकने के लिए एक आर्द्र वातावरण बनाए रखने के लिए बंद immunohistochemistry गर्मी चैंबर के ढक्कन रखो ।
  3. माइक्रोस्कोपी स्लाइड धुलाई
    1. एक ऊतक पर अतिरिक्त मशीन माध्यम से ठोकर ।
    2. यांत्रिक स्लाइड से ६० ° c फॉस्फेट बफर, पीएच ५.३ में माइक्रोस्कोपी स्लाइड से कुल्ला करने के लिए, ऊपर और नीचे बफर में सूक्ष्म स्लाइड्स चलती द्वारा । इससे एंजाइमी प्रतिक्रिया बंद हो जाती है ।
    3. ६० ° c फॉस्फेट बफर, 20 मिनट के लिए पीएच ५.३ में रखने के द्वारा माइक्रोस्कोपी स्लाइड धो लें ।
    4. ६० ° c नल के पानी में माइक्रोस्कोपिक स्लाइड्स को खिंचने से धो लें ।
    5. ६० ° c में 20 मिनट के लिए नल का पानी रख कर उन्हें माइक्रोस्कोप स्लाइड धो लें ।
    6. पानी और स्लाइड धीरे से शांत हो जाओ के साथ कमरे के तापमान नल के पानी का मिश्रण ६० ° c 1 मिनट के पाठ्यक्रम पर नल पानी ।
    7. कमरे के तापमान आसुत जल में एक अंतिम यांत्रिक धुलाई कदम प्रदर्शन करते हैं ।
  4. माइक्रोस्कोपी स्लाइड पर दाग Cytospins या ऊतक वर्गों संलग्न
    1. पूर्व गर्म एक स्लाइड 50-60 डिग्री सेल्सियस पर गर्म ।
    2. ध्यान से माइक्रोस्कोपी स्लाइड के पीछे की ओर एक कागज तौलिया का उपयोग कर सूखी और उंहें स्लाइड गर्म करने के लिए माइक्रोस्कोप स्लाइड के ऊपर की ओर सूखी जगह ।
    3. जब स्लाइड शुष्क कर रहे हैं, ग्लिसरॉल जेली बढ़ते मध्यम और coverslips का उपयोग कर माइक्रोस्कोप स्लाइड पर सेल की तैयारी या ऊतक वर्गों संलग्न ।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक फ्रिज में अंधेरे में सेल की तैयारी या ऊतक वर्गों माइक्रोस्कोपी स्लाइड सहेजें या तुरंत छवि अधिग्रहण के साथ आगे बढ़ना ।

3. छवि अधिग्रहण

  1. पर्याप्त गतिशील रेंज के साथ एक वैज्ञानिक मोनोक्रोम सीसीडी कैमरा के साथ छवियों को रिकॉर्ड (कम से कम 8 बिट लेकिन अधिमानतः 10 बिट या 12 बिट), निश्चित लाभ और एक रैखिक प्रतिक्रिया ।
  2. एक उचित उद्देश्य (cytospins के लिए 20X-63X और ऊतक वर्गों के लिए 10 63X) का चयन करें ।
  3. यह देखने के क्षेत्र से थोड़ा बड़ा है कि इतना क्षेत्र डायाफ्राम संकीर्ण द्वारा चकाचौंध को कम करें ।
  4. एक अवरक्त अवरुद्ध फिल्टर के साथ संयोजन में formazan हाला7 की isobestic तरंग दैर्ध्य के पास एक 10 एनएम वाइड bandpass अनुमान फिल्टर लागू करने के द्वारा रंग प्रकाश का प्रयोग करें ( सामग्री तालिकादेखें) ।
    नोट: nitroBT का अधिकतम isobestic अवशोषक ५८५ एनएम पर है ।
  5. रोशनी का अनुकूलन करने के लिए सुनिश्चित करें कि कैमरे की पूरी ग्रे स्तर रेंज (यानी, प्रदीप्ति स्तर सेट इतना है कि अधिकतम रोशनी के बिना हासिल की है, जब एक खाली माइक्रोस्कोप स्लाइड रिकॉर्डिंग) का उपयोग किया जाता है ।
  6. ज्ञात अवशोषक (या ऑप्टिकल घनत्व [आयुध डिपो]) मूल्यों के लिए मापा ग्रे स्तर जांचना । यह अंत करने के लिए, या तो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ( सामग्री तालिकादेखें) या तो वाणिज्यिक रूप से एक अंशांकन स्लाइड या कदम के साथ ज्ञात आयुध डिपो के मान (देखें कदम शुू) के कम से कम 10 विभिंन चरणों के ग्रे पैमाने पर छवियों को कैप्चर करें) या एक द्वारा एक कस्टम बनाया ग्रे स्केल कील कदम गोली उपाय densitophotometer और परिणामों का उपयोग करने के लिए ज्ञात अवशोषक मूल्यों मापा ग्रे मूल्यों जांचना ।
  7. ब्याज की कोशिकाओं या ऊतक वर्गों के photomicrographs पर कब्जा ।

4. छवि विश्लेषण

  1. छवि विश्लेषण से पहले, अवशोषित माप के लिए ImageJ सॉफ्टवेयर जांचना ।
    1. ज्ञात आयुध डिपो मूल्यों के साथ अंशांकन स्लाइड या कदम गोली में ज्ञात अवशोषण मापदंडों के साथ कम से कम 10 अंशांकन क्षेत्रों के photomicrographs के अवशोषक (आयुध डिपो) को मापने । ImageJ में, का उपयोग करें → माप मेनू का विश्लेषण या Ctrl + एम हॉटकी एक चयनित क्षेत्र को मापने के लिए ।
    2. → अंशांकन विश्लेषण करने के लिए जा रहा द्वारा अवशोषक अंशांकन प्रक्रिया प्रारंभ करें । फ़ंक्शन "Rodbard (NIH Image)" चुनें । खोलता है जो विंडो के बाएँ स्तंभ में, अंशांकन स्लाइड/चरण टैबलेट के प्रत्येक चरण से धूसर स्तर माप के परिणाम शुू में प्रदर्शन पहले से ही मौजूद हैं । यदि नहीं, तो उंहें ImageJ परिणाम स्क्रीन से कॉपी । दाएँ स्तंभ में, प्रत्येक संगत ज्ञात अवशोषित मान के रूप में आप नपेed कदम गोली के साथ प्राप्त प्रमाणपत्र पर मुद्रित दर्ज करें । टिक बक्से "वैश्विक अंशांकन" और "दिखाएं भूखंड" और प्रेस "ठीक है" ।
    3. गुणवत्ता नियंत्रण के लिए, सुनिश्चित करें कि Rodbard फ़ंक्शन का R2 > 0.99 है । अगर यह < 0.99 है, तो जांचें कि क्या अंशांकन स्लाइड्स में फोटो खिंचवाने थे और सही तरीके से मापा जाता है और क्या ज्ञात अवशोषक पैरामीटर सही तरीके से दर्ज किए गए थे ।
    4. ImageJ अब जब तक आप इस कार्यक्रम को बंद करने पर तुले है (इसलिए "वैश्विक अंशांकन") । अवशोषित माप के लिए, एक नपे ImageJ सत्र हमेशा मनाया अवशोषक का मतलब है 0 और 1 के बीच मूल्यों के लिए, जहां 0 और 1 शून्य और पूर्ण अवशोषण के asymptotes, क्रमशः कर रहे हैं ।
  2. cytospins के लिए, > 100 एक यादृच्छिक तरीके से एकल कोशिकाओं का चयन करें । ऊतक वर्गों के लिए, सभी वर्गों में एक निश्चित लंबाई और चौड़ाई के हित के एक या अधिक क्षेत्रों का चयन करें ।
    1. photomicrographs पर एक रैस्टर परियोजना के लिए निष्पक्ष सेल चयन में सहायता करते हैं । ImageJ में, परियोजना Plugins → विश्लेषण → ग्रिड मेनू के माध्यम से एक छवि पर एक ग्रिड ।
    2. ImageJ में, एकल कक्षों का चयन करने के लिए अंडाकार उपकरण का उपयोग करें, और ऊतक क्षेत्रों का चयन करने के लिए आयत उपकरण का उपयोग करें ।
  3. चयनित कक्षों या ऊतक क्षेत्रों के अवशोषण और क्षेत्र को मापने । ऑप्टिकल घनत्व और क्षेत्र ImageJ परिणाम स्प्रेडशीट में क्रमशः "मतलब" और "क्षेत्र" कहा जाता है ।
    नोट: एक कोशिका या ऊतक क्षेत्र के कुल अवशोषित (यदि आप विभिंन आकारों के साथ कई ऊतक क्षेत्रों का चयन किया है) सभी अलग पिक्सेल absorbances के योग के बराबर है । यदि एक सेल १००० पिक्सेल द्वारा imaged है, तो कुल अवशोषक १००० absorbances की राशि द्वारा दिया जाता है और मतलब अवशोषक कुल अवशोषित द्वारा दिया जाता है 1000/। इस कार्यविधि भी वितरण त्रुटि से बचा जाता है ।
  4. नियंत्रण स्लाइड (ओं), जो एक नमूना है कि सब्सट्रेट के अभाव में गर्मी के माध्यम से नियंत्रण करने के लिए उजागर किया गया है, लेकिन cofactors की उपस्थिति में से > 30 कोशिकाओं या ऊतक क्षेत्रों के औसत कुल अवशोषित निर्धारित करते हैं । इस नियंत्रण अवशोषण गैर विशिष्ट एंजाइम गतिविधि धुंधला और अवशोषित प्रयुक्त माइक्रोस्कोपी स्लाइड, बढ़ते मध्यम, कवर पर्ची या माइक्रोस्कोप द्वारा प्रेरित कलाकृतियों के लिए नियंत्रित करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
  5. cofactor (लेकिन सब्सट्रेट और/या अवरोध करनेवाला की अलग सांद्रता) के समान एकाग्रता के साथ मशीनी माध्यम से अवगत कराया गया कि नमूनों की सभी कुल अवशोषक माप से औसत नियंत्रण अवशोषक घटाना । यह एक कोशिका या ऊतक क्षेत्र के सही कुल अवशोषित देता है ।
  6. सांख्यिकीय औसत कुल सही absorbances छात्र टी परीक्षण या एक तरह से ANOVA परीक्षण, अपने प्रयोगात्मक डिजाइन पर निर्भर करता है का उपयोग कर की तुलना करें ।
  7. Formazan अवशोषक एंजाइम गतिविधि में परिवर्तित किया जा सकता है (µmol प्रति मिलीलीटर में परिवर्तित सब्सट्रेट) Lambert-बियर के कानून का उपयोग कर: c = A/(є × d), जहां सी प्रतिक्रिया माध्यम में Formazan की एकाग्रता है, एक अंशांकन के बाद ImageJ में मापा अवशोषित है; є formazan के विलुप्त होने गुणांक है (५८५ एनएम पर १६.०००)8 और डी प्रकाश यात्रा दूरी है, जो औसत सेल मोटाई या नाममात्र खंड काटने मोटाई (6-10 इस प्रोटोकॉल में µm) के बराबर है ।
    नोट: सुखाने के बाद, ऊतक अनुभाग मोटाई नाममात्र अनुभाग काटने मोटाई से ~ ५०% कम हो जाती है, लेकिन यह ऊपर गणना में प्रतिबिंबित नहीं है क्योंकि नाममात्र अनुभाग काटने मोटाई जैविक रूप से सबसे अधिक प्रासंगिक है । औसत सेल मोटाई और कोशिका preparates के क्षेत्र आयाम माइक्रोस्कोपी ग्लास स्लाइड का पालन फोकल माइक्रोस्कोपी या व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी, जिसके लिए प्रोटोकॉल कहीं और पाया जा सकता है का उपयोग कर निर्धारित किया जा सकता है । 9 , 10

Representative Results

कई प्रोटोकॉल के लिए मशीन मध्यम तैयार करने के लिए एक विशेष डिहाइड्रोजनेज की गतिविधि की जांच दिखाए जाते हैं । प्रत्येक डिहाइड्रोजनेज के लिए, एक तापमान को बनाए रखते हुए PVA समाधान में सूचीबद्ध रिएजेंट भंग ३७ ° c । पुनर्अभिकर्ताओं को सारणी में सूचीबद्ध क्रम में भंग किया जाना चाहिए, अर्थात nitroBT को हमेशा प्रथम भंग कर दिया जाता है और (एम) पीएमएस हमेशा पिछले भंग हो जाता है. nitroBT के प्रत्येक 5 मिलीग्राम ४० µ एल मिक्स (20 µ एल इथेनॉल + 20 µ एल dimethylformamide) में भंग कर रहा है । सभी मात्रा में 18% PVA समाधान है, जो ~ 2 ऊतक वर्गों या कांच स्लाइड पर ~ 4 सेल की तैयारी दाग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की 1 मिलीलीटर प्रति हैं । NitroBT, णड+, NADP+, ADP और सब्सट्रेट समाधान नए सिरे से बनाया जाना चाहिए । 3, MgCl2 और (एम) पीएमएस समाधान एक महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है । 18% फॉस्फेट बफर में भंग PVA 2 सप्ताह के लिए ६० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है । 18% PVA समाधान के पीएच ०.१ एम पोटेशियम dihydrogen फॉस्फेट (KH2PO4) और ०.१ मीटर disodium हाइड्रोजन फॉस्फेट (ना2HPO4) बफ़र्स की विभिन्न रचनाओं का उपयोग कर सेट किया जा सकता है । दिखाया मशीन अवधि अच्छा प्रारंभिक अंक प्रदान करते हैं, लेकिन इष्टतम मशीन अवधि प्रजातियों पर निर्भर करता है, ऊतक के प्रकार और ऊतक के संरक्षण । सामांय में, सेल की तैयारी ऊतक वर्गों की तुलना में अब formazan उत्पादन के एक समान स्तर प्राप्त करने के लिए तैयार किया जाना चाहिए ।

वंय-प्रकार isocitrate डिहाइड्रोजनेज 1 और 2 (IDH1/उत्प्रेरित isocitrate के α-ketoglutarate (αKG) के सहवर्ती कमी के साथ NADP के लिए NADPH+ , क्रमशः कोशिका द्रव्य और mitochondria । इन एंजाइमों हाल ही में ब्याज आकर्षित किया है क्योंकि IDH1/ उत्परिवर्तनों मानव कैंसर के विभिंन प्रकार में होते हैं, प्राथमिक मस्तिष्क कैंसर (ग्लियोब्लास्टोमा) और कोलोरेक्टल कैंसर सहित, और एक अनूठा अवसर की संभावनाओं का प्रदर्शन करने के लिए प्रस्ताव चयापचय मानचित्रण । IDH1 उत्परिवर्तनों IDH1 जंगली प्रकार एंजाइम गतिविधि को निष्क्रिय और भी एक नव एंजाइमी गतिविधि है कि उत्पादन और oncometabolite डी-2-hydroxyglutarate (डी-2HG),11 जो है के बाद के संचय की ओर जाता है प्रेरित विस्तार से कहीं पर चर्चा की । 12 चयापचय मानचित्रण प्रयोगों से पता चला कि NADP+-निर्भर IDH1/2 गतिविधि काफी कोलोरेक्टल कार्सिनोमा कोशिकाओं में एक खटखटाया-heterozygous IDH1 उत्परिवर्तन के साथ कोलोरेक्टल कार्सिनोमा कोशिकाओं में कम था कि IDH1 वाइल्ड-टाइप (फिगर 1a). यह अंतर रंग लाइट photomicrographs (figure 1b) के इमेज एनालिसिस द्वारा quantified गया । 12

चयापचय मानचित्रण प्रयोगों का एक और उदाहरण देकर स्पष्ट करना चित्रा 2, जो माउस मस्तिष्क कि मानव ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन था की एक cryostat अनुभाग की एक छवि है में दिखाया गया है । IDH1/2 मानव मस्तिष्क में सबसे महत्वपूर्ण NADPH प्रदाता है और उसकी गतिविधि जंगली में विनियमित है-प्रकार IDH1/2 ग्लियोब्लास्टोमा, जबकि NADPH की उत्पादन क्षमता/2 कुतर के दिमाग में बहुत कम है । 11 चित्र 2a उच्च NADP+-निर्भर IDH1/2 गतिविधि में मानव ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं और कम NADP+-निर्भर IDH1/2 गतिविधि में स्वस्थ माउस मस्तिष्क में अंतर दिखाता है । IDH1/2 गतिविधि के रूप में µmol NADPH उत्पादन प्रति मिनट की आकृति में बी6 प्रति मिलीलीटर quantified है ।

IDH1/2 की एंजाइमी प्रतिक्रिया अपेक्षाकृत सरल है, लेकिन स्तनपान डिहाइड्रोजनेज (LDH) एक और अधिक जटिल एंजाइम जटिल है । LDH णड के सहवर्ती कमी के साथ पाइरूवेट को स्तनपान से प्रतिवर्ती रूपांतरण में धर्मांतरित+ नध या इसके विपरीत । स्तनपान और पाइरूवेट की उपलब्धता और LDH एंजाइम जटिल की संरचना तय करती है कि क्या स्तनपान मुख्यतः पाइरूवेट में परिवर्तित हो जाता है (जो LDH-बी और पैदावार नध द्वारा catalyzed है) या कि क्या पाइरूवेट मुख्य रूप से स्तनपान करने के लिए परिवर्तित किया गया है (जो catalyzed द्वारा LDH-ए और भस्म नध). 13 चयापचय मानचित्रण प्रयोगों LDH बी प्रतिक्रिया की गतिविधि कल्पना करने में सक्षम हैं, लेकिन वे LDH की गतिविधि के लिए "अंधा" कर रहे हैं-एक प्रतिक्रिया है क्योंकि नध उत्पादन उत्पन्न नहीं होता है और एक परिणाम के रूप में nitroBT formazan करने के लिए कम नहीं है. चित्रा 3 से पता चलता है णड+-निर्भर LDH गतिविधि (यानी पाइरूवेट में स्तनपान के रूपांतरण) सब्सट्रेट के अभाव में मानव मस्तिष्क वर्गों में (आंकड़ा 3), स्तनपान के एक उच्च एकाग्रता की उपस्थिति में (चित्र बी ), 6 मिमी स्तनपान (चित्रा 3सी) की उपस्थिति में और स्तनपान और पाइरूवेट के एक उच्च एकाग्रता की एक कम एकाग्रता की उपस्थिति में (चित्रा 3 डी). इन प्रयोगों के परिणाम चयापचय मानचित्रण वर्णन पर्याप्त रूप से कब्जा है कि ऊतक वर्गों में णड+-निर्भर LDH गतिविधि प्रतिक्रिया माध्यम में स्तनपान और पाइरूवेट की उपलब्धता पर निर्भर करता है.

Figure 1

चित्र 1 . NADP+-आश्रित IDH1/2 मानव कोलोरेक्टल कार्सिनोमा कोशिकाओं की गतिविधि । (क) प्रतिनिधि रंग प्रकाश photomicrographs के लिए दाग के बाद HCT116 मानव कोलोरेक्टल कार्सिनोमा कोशिकाओं के NADP+-निर्भर IDH1/2 1-10 mm isocitrate और ०.८ mm NADP के खिलाफ गतिविधि+। स्केल पट्टियां = ५० µm. (B) NADP द्वारा nitroBT से उत्पादित नीले formazan के अवशोषण का एक ठहराव+-निर्भर IDH1/2 गतिविधि प्रति कक्ष (A) और छवि विश्लेषण में रंग लाइट के उपयोग के साथ दिखाया गया है । संक्षिप्त: IDH1WT/WT, isocitrate डिहाइड्रोजनेज 1 जंगली-प्रकार; IDH1WT/MUT, isocitrate डिहाइड्रोजनेज 1 रूपांतरित. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2

चित्र 2 . NADP+-आश्रित IDH1/2 मानव ग्लियोब्लास्टोमा नमूनों की गतिविधि । (क) के प्रतिनिधि photomicrograph एक चूहे मस्तिष्क खंड स्वस्थ माउस मस्तिष्क (एच) और एक मानव ग्लियोब्लास्टोमा ट्यूमर xenograft (टी) के लिए दाग के बाद NADP+-निर्भर IDH1 की उपस्थिति में/ मिमी NADP+ और 2 मिमी isocitrate. स्केल बार = २०० µm (B) माउस मस्तिष्क के क्षेत्रों की एंजाइम गतिविधि ठहराव (h) और ह्यूमन ग्लियोब्लास्टोमा xenograft (t) में दिखाया गया (A) Lambert-बियर के क़ानून का उपयोग कर रहा है । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3

चित्र 3 . णड+-निर्भर स्तनपान डिहाइड्रोजनेज (LDH) मानव मस्तिष्क के नमूनों की गतिविधि । णड के लिए दाग के बाद मानव मस्तिष्क के नमूनों के धारावाहिक वर्गों के प्रतिनिधि photomicrographs+-निर्भर LDH गतिविधि (नियंत्रण शर्तों के खिलाफएक) (अभाव सब्सट्रेट और पाइरूवेट में, 3 मिमी णड+ केवल) (बी) के खिलाफ १५० मिमी स्तनपान पाइरूवेट के अभाव में (ग) के खिलाफ 6 मिमी पाइरूवेट के अभाव में स्तनपान और (डी) के खिलाफ 6 मिमी स्तनपान के खिलाफ 18 मिमी पाइरूवेट, प्रतिस्पर्धी उत्पाद अवरोधक के स्तनपान कराने वाली-पाइरूवेट प्रतिक्रिया. स्केल बार = २०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

एंजाइम: G6PDH LDH Sdh MDH IDH1 IDH2 IDH3 6PGD GDH
१०० mM फास्फेट बफर में PVA 18% 1 मिलीलीटर; pH = ७.४ 1 मिलीलीटर;  pH = ७.४ 1 मिलीलीटर;  pH = ८.० 1 मिलीलीटर; pH = ७.४ 1 मिलीलीटर; pH = ७.४ 1 मिलीलीटर; pH = ७.४ 1 मिलीलीटर; pH = ७.४ 1 मिलीलीटर; pH = ८.० 1 मिलीलीटर; pH = ८.०
5 मिमी NitroBT 5 mg/40 µ l मिश्रण 5 mg/40 µ l मिश्रण 5 mg/40 µ l मिश्रण 5 mg/40 µ l मिश्रण 5 mg/40 µ l मिश्रण 5 mg/40 µ l मिश्रण 5 mg/40 µ l मिश्रण 5 mg/40 µ l मिश्रण 5 mg/40 µ l मिश्रण
5 एमएम नण य3  10 µ l 10 µ l 10 µ l 10 µ l 10 µ l 10 µ l 10 µ l 10 µ l
5 मिमी MgCl2 10 µ l 10 µ l 10 µ l 10 µ l 10 µ l 10 µ l
3 मिमी णड+ 10 µ l 10 µ l 10 µ l
०.८ मिमी NADP 10 µ l 10 µ l 10 µ l 10 µ l 10 µ l
2 मिमी ADP 10 µ l
सब्सट्रेट 10 मिमी ग्लूकोज-6-फॉस्फेट १५० मिमी स्तनपान ५० मिमी succinate १०० एमएम मैलिक एसिड 2 मिमी isocitrate 2 मिमी isocitrate 2 मिमी isocitrate 10 मिमी 6-phospho-galactonate 10 एमएम glutamic एसिड
०.३२ मिमी mPMS 10 µ l 10 µ l 10 µ l 10 µ l 10 µ l
०.२ mM पीएमएस 10 µ l 10 µ l 10 µ l 10 µ l
मशीन अवधि 5 min 30 min ६० मिनट ६० मिनट 30 min 30 min 30 min 10 min 30 min

तालिका 1. योजनाबद्ध dehydrogenases के लिए चयापचय मानचित्रण प्रोटोकॉल का अवलोकन । संक्षिप्त नाम: ADP, adenosine diphosphate; मी पीएमएस (methoxy) -5-methylphenazinium मिथाइल सल्फेट; nitroBT, नाइट्रो tetrazolium नीला क्लोराइड; G6PDH, ग्लूकोज-6-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज; LDH, स्तनपान डिहाइड्रोजनेज; SDH, succinate डिहाइड्रोजनेज; MDH, malate डिहाइड्रोजनेज; इध, isocitrate डिहाइड्रोजनेज; 6PGD, 6-phosphogluconate डिहाइड्रोजनेज; GDH, ग्लूटामेट डिहाइड्रोजनेज ।

Discussion

सेलुलर चयापचय पर अनुसंधान वर्तमान में एक पुनर्जागरण का अनुभव है क्योंकि शोधकर्ताओं का एहसास है कि अब चयापचय प्रभाव रोगजनन और कई रोगों के उपचार के लिए महत्वपूर्ण हैं । 1 इसके अलावा, चयापचय अनुसंधान की तकनीक है कि पहले से कहीं अधिक उपकरण के साथ अनुसंधान के इस क्षेत्र प्रदान करते हैं, मास स्पेक्ट्रोमेट्री, radioisotopic लेबलिंग और परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोमेट्री सहित की बढ़ती उपलब्धता से सहायता प्राप्त है । चयापचय मानचित्रण कोई एक उपंयास तकनीक का मतलब है, लेकिन इसकी क्षमता एक लगभग सच करने वाली प्रकृति स्थिति में एंजाइमों की गतिविधि पर एकीकृत जानकारी देने के लिए इस तकनीक को पहले से कहीं अधिक प्रासंगिक बना देता है । 2

cofactors णड+ और NADP+ सभी जीवित कोशिकाओं में पाया जाता है, जो इंगित करता है कि dehydrogenases विकास के दौरान बहुत जल्दी उठी और सेलुलर चयापचय में महत्वपूर्ण भूमिका है । 14 , 15 वर्तमान में, वहां रहे है ५२३ एंजाइम-catalyzed प्रतिक्रियाओं कि dehydrogenases के रूप में वर्गीकृत कर रहे है और सभी प्रजातियों में होते हैं । 16 सैद्धांतिक रूप से, सभी अलग डिहाइड्रोजनेज प्रतिक्रियाओं की गतिविधि अलग से यहां वर्णित चयापचय मानचित्रण प्रोटोकॉल tweaking द्वारा जांच की जा सकती है । हर एंजाइमी प्रतिक्रिया सब्सट्रेट और cofactors कि अपनी गतिविधि के लिए आवश्यक हैं के माध्यम से अद्वितीय है । इसलिए, प्रत्येक एंजाइमी प्रतिक्रिया की गतिविधि पर्याप्त सब्सट्रेट और प्रतिक्रिया माध्यम में cofactors के साथ एक चयापचय मानचित्रण प्रयोग का उपयोग कर निर्धारित किया जा सकता है । हालांकि, कुछ एंजाइम isoforms अपने सेलुलर स्थानीयकरण में अलग, उदाहरण के लिए एक isoform catalyzes में एक प्रतिक्रिया कोशिका द्रव्य में एक और isoform कार्यों जबकि mitochondria. एक उल्लेखनीय उदाहरण है IDH1 और IDH2, जिनमें से पूर्व cytoplasmic है और बाद mitochondrial है और जो दो अलग प्रोटीन दो अलग जीन द्वारा इनकोडिंग हैं । 11 1-methoxy-5-methylphenazinium methylsulfate (methoxy-पीएमएस) और 5-methylphenazinium methylsulfate (पीएमएस) इन प्रयोगों के लिए इलेक्ट्रॉन वाहक के रूप में दोनों का इस्तेमाल किया जा सकता है । पूर्व mitochondrial झिल्ली पारित नहीं करता है, बाद में करता है । इसलिए, mitochondrial एंजाइमों (जैसे IDH2) पर जांच cytosolic एंजाइमों (जैसे IDH1) पर जांच जबकि पीएमएस का उपयोग करना चाहिए mPMS का उपयोग करना चाहिए ।

कई तकनीकों के साथ के रूप में, इस प्रोटोकॉल के रूपांतरों, tetrazolium लवण के विभिंन प्रकार का उपयोग कर के रूप में, पीएमएस और सोडियम azide के अलावा को छोड़कर, एक जलीय बढ़ते माध्यम का उपयोग कर, और अलग मशीन और धोने बार, मौजूद है और समान रूप से अच्छी तरह से काम कर सकते हैं । tetrazolium लवण के साथ चयापचय मानचित्रण के आवेदन dehydrogenases तक ही सीमित नहीं है । प्रोटोकॉल के लिए छोटे संशोधनों के साथ, यह भी एंजाइमों की गतिविधि के आकलन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि सीधे एक चयापचय मार्ग में एक डिहाइड्रोजनेज के ऊपर समारोह । हम पहले glutaminase एंजाइम,17 जो glutaminolysis मार्ग में ग्लूटामेट डिहाइड्रोजनेज के सीधे ऊपर कार्य के लिए इस सिद्धांत का वर्णन किया है । 18 सिद्धांत में, एक ही सिद्धांत अंय एंजाइमों के लिए लागू किया जा सकता है कि सीधे बहाव या एक डिहाइड्रोजनेज उदा aconitase, जो tricarboxylic एसिड (टीसीए) चक्र में IDH2 और IDH3 के ऊपर सीधे ऊपर है के नदी के ऊपर है । 1 तालिका में वर्णित सांद्रता का एक और सरल परिवर्तन सब्सट्रेट, cofactor और/या अवरोधक के विभिन्न सांद्रता के साथ गर्मी के माध्यम शीशियों बनाने के माध्यम से है । यह खुराक की पीढ़ी की अनुमति देता है, सब्सट्रेट, cofactor और/या अवरोध एकाग्रता के एक समारोह के रूप में गतिविधि घटता ।

तकनीकी रूप से बोलते हुए, चयापचय मानचित्रण प्रयोगों सीटू एंजाइम गतिविधि में निष्पक्ष टिप्पणियों की सुविधा नहीं है, क्योंकि शोधकर्ताओं के लिए एक सब्सट्रेट और cofactor एकाग्रता है कि सब्सट्रेट और cofactor स्तर को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं चुनना है जो सीटू मेंमौजूद हैं । इसके अलावा, प्रतिक्रिया माध्यम में चिपचिपा 18% PVA का उपयोग करने के लिए अणुओं बरकरार रखने के लिए, जगह में और अनुरूप में कार्य करता है, लेकिन प्रतिक्रिया माध्यम के माध्यम से कम आणविक वजन रिएजेंट के प्रभावी प्रसार पर प्रतिबंध लगाता है । 3 , 5 इसलिए, प्रयोगों में निर्धारित एंजाइम गतिविधियों का उपयोग supraphysiological सब्सट्रेट सांद्रता vivo स्थिति में एक दिया सब्सट्रेट एकाग्रता पर प्रतिबिंबित नहीं करते हैं, लेकिन के लिए उपयुक्त हैं अंतर प्रयोगात्मक तुलना । इस प्रकार, चयापचय मानचित्रण प्रयोगों का परिणाम है कि सीटू मेंमौजूद हैं सब्सट्रेट और cofactor स्तर के संदर्भ में एक एंजाइमी प्रतिक्रिया की उत्पादन क्षमता (अधिकतम गतिविधि) है. इसके अलावा, सब्सट्रेट और/या cofactors और कई नमूनों की विभिंन सांद्रता के उपयोग की अनुमति देता है अधिकतम उत्पादन क्षमता के निष्पक्ष तुलना (Vmax) और एक सब्सट्रेट के लिए एक एंजाइम के संबध (Km) सेल की तैयारी में cofactor/ , ऊतकों या ऊतक क्षेत्रों । इन मापदंडों एंजाइम प्रोटीन अभिव्यक्ति की राशि का परिणाम है, के बाद अनुवाद संशोधनों और एंजाइमों की गतिविधि पर एक भीड़ microenvironment के प्रभाव । इसलिए, चयापचय मानचित्रण अभी भी प्रयोगों से एंजाइम गतिविधि का एक बेहतर प्रतिबिंब है कि प्रोटीन अभिव्यक्ति या इन विट्रो मेंशुद्ध एंजाइम गतिविधि का निर्धारण है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

R.J.M. ए एम सी पीएचडी छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित है । इस शोध को डच कैंसर सोसाइटी (KWF ग्रांट UVA 2014-6839) ने समर्थन दिया था । लेखकों ने प्रोटोकॉल के लेखन के साथ उनकी मदद के लिए डॉ ए. Jonker का शुक्रिया अदा किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt Sigma-Aldrich A2754
D-Glucose 6-phosphate sodium salt Sigma-Aldrich G7879
Disodium hydrogen phosphate (NA2HPO4) Merck Millipore 106559
di-Sodium succinate Sigma-Aldrich W327700
DL-Isocitric acid trisodium salt hydrate Sigma-Aldrich I1252 
D-Malic acid Sigma-Aldrich 2300
Glycerol Gelatin Sigma-Aldrich GG1
L-Glutamic acid Sigma-Aldrich G1251
Lithium 6-phospho-D-galactonate Sigma-Aldrich 55962
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
methoxy-Phenazine methosulfate Serva 28966.01
Nicotinamide adenine dinucleotide Sigma-Aldrich N0505 
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate Sigma-Aldrich NADP-RO
Nitrotetrazolium Blue chloride Sigma-Aldrich N6876
Phenazine methosulfate Serva 32030.01
Polyvinyl alcohol, fully hydrolyzed Sigma-Aldrich P1763
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Merck Millipore 104873
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002
Sodium L-lactate Sigma-Aldrich L7022
Bandpass filter Edmund optics https://www.edmundoptics.de/optics/optical-filters/bandpass-filters/Hard-Coated-OD-4-10nm-Bandpass-Filters/
Grey-step wedge Stouffer Industries http://www.stouffer.net/TransPage.htm

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १३५ मात्रात्मक एंजाइम गतिविधि histochemistry cytochemistry डिहाइड्रोजनेज णड+ NADP+ नध NADPH
चयापचय मानचित्रण: मात्रात्मक एंजाइम Cytochemistry और Histochemistry कोशिकाओं और ऊतकों में Dehydrogenases की गतिविधि निर्धारित करने के लिए
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Molenaar, R. J., Khurshed, M., Hira, V. V. V., Van Noorden, C. J. F. Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues. J. Vis. Exp. (135), e56843, doi:10.3791/56843 (2018).

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