Begeleide Protocol voor fecale microbiële karakterisering door 16S rRNA-Amplicon Sequencing
Summary
Dit manuscript beschrijft een gedetailleerde gestandaardiseerde protocol voor high-throughput 16S rRNA-amplicon sequencing. Het protocol introduceert een protocol van het geïntegreerde, geüniformeerde haalbaar en goedkoop vanaf fecale sample collectie door middel van data-analyses. Dit protocol maakt analyse van grote aantallen monsters met strenge normen en diverse besturingselementen.
Abstract
De menselijke intestinale microbiome speelt een centrale rol bij de bescherming van cellen tegen verwonding, bij de verwerking van energie en voedingsstoffen en bij de bevordering van immuniteit. Afwijkingen van wat wordt beschouwd als een gezonde microbiota samenstelling (dysbiosis) kunnen de vitale functies leidt tot pathologische voorwaarden schaden. De karakterisatie van associaties tussen microbiële samenstelling en de menselijke gezondheid en ziekte hebben recente en aanhoudende onderzoeksinspanningen is gericht.
Voorschotten in high-throughput sequencing technologieën inschakelen karakterisering van de microbiële samenstelling van gut. Deze methoden omvatten 16S rRNA-amplicon sequencing en shotgun sequencing. 16S rRNA-amplicon sequencing wordt gebruikt om het profiel van taxonomische samenstelling, terwijl geweer sequencing aanvullende informatie over gene voorspellingen en functionele annotatie bevat. Een voordeel bij het gebruik van een methode gerichte sequentiebepaling van het 16S rRNA gene variabele regio is de aanzienlijk lagere kosten in vergelijking met jachtgeweer sequencing. Reeks verschillen in het 16S rRNA gen worden gebruikt als een microbiële vingerafdruk te identificeren en kwantificeren van de verschillende taxa binnen een afzonderlijke monster.
Grote internationale inspanningen hebben normen voor 16S rRNA-amplicon sequencing ingeroepen. Verschillende studies verslag echter een gemeenschappelijke bron van variatie, veroorzaakt door batch effect. Om te minimaliseren van dit effect, geüniformeerde protocollen voor sample collectie, moeten verwerking, en volgorde worden uitgevoerd. Dit protocol stelt de integratie van algemeen gebruikte protocollen fecale sample collectie vanaf tot data-analyses. Dit protocol bevat een kolom-vrij, direct-PCR aanpak waarmee gelijktijdige behandeling en DNA-extractie van grote aantallen fecale monsters, samen met PCR versterking van de V4-regio. Bovendien, het protocol beschrijft de analyse-pijpleiding en bevat een script met behulp van de nieuwste versie van QIIME (QIIME 2 versie 2017.7.0 en DADA2). Dit stapsgewijze protocol is gericht op diegenen die geïnteresseerd zijn in het gebruik van het 16S rRNA-amplicon sequencing starten in een robuuste, reproductieve, makkelijk te gebruiken en gedetailleerde manier begeleiden.
Introduction
Geconcentreerde inspanningen hebben gedaan om microbiome diversiteit en abundantie, als een ander aspect van het vastleggen van verschil en overeenkomsten tussen particulieren in gezonde en pathologische omstandigheden beter te begrijpen. Leeftijd2,3, geografie4, levensstijl5,6en ziekte5 werden getoond kunnen worden betrokken bij de samenstelling van de microbiome van de darm hebben, maar veel voorwaarden en populaties nog niet volledig gekenmerkt. Er werd onlangs gemeld dat de microbiome kan worden gewijzigd voor therapeutische toepassingen7,8,9. Daarom, meer inzicht in de relatie tussen verschillende fysiologische omstandigheden en de microbiële samenstelling is de eerste stap naar optimalisatie van de potentiële toekomstige wijzigingen.
De traditionele microbiële cultuur worden beperkt door lage opbrengst10,11, methodenen worden geconceptualiseerd als een binaire staat waar een bacterie is ofwel presenteren in de darm, of niet. High-throughput DNA gebaseerde sequencing heeft een revolutie teweeggebracht in microbiële ecologie, toelatend de vang van alle leden van de microbiële Gemeenschap. Nochtans, Las volgorde lengte en kwaliteit blijven belangrijke belemmeringen voor nauwkeurige taxonomie toewijzing12. High-throughput gebaseerde experimenten kunnen bovendien lijden van batch-effecten, waar metingen worden beïnvloed door niet-biologische of niet-wetenschappelijke variabelen13. In de afgelopen jaren zijn verschillende programma’s vastgesteld om te bestuderen van de menselijke microbiome, met inbegrip van het Amerikaanse Gut-project, de menselijke Microbiome-Project van Verenigde Staten (VS) en het Verenigd Koninkrijk (UK)-MetaHIT-project. Deze initiatieven hebben gegenereerd grote hoeveelheden gegevens die niet gemakkelijk vergelijkbaar te wijten aan een gebrek aan samenhang in hun aanpak. Een scala aan internationale projecten zoals de International menselijke Microbiome Consortium, het project van de standaarden voor de menselijke Microbiome, en de National Institute of Standards and Technology (NIST) geprobeerd om enkele van deze kwesties14 , en de normen voor metingen van de microbiome waarmee de verwezenlijking van betrouwbare reproductieve resultaten moeten ontwikkeld. Hier wordt beschreven, is een geïntegreerde protocol verschillende algemeen gebruikte methoden15,16 voor het 16S rRNA high-throughput sequencing (16S-seq) vanaf fecale sample collectie door middel van data-analyses. Het protocol beschrijft een kolom-vrije PCR-aanpak, oorspronkelijk ontworpen voor directe extractie van plantaardige DNA16, zodat de gelijktijdige behandeling van grote aantallen fecale monsters in een relatief korte tijd met hoge kwaliteit versterkt DNA voor gerichte rangschikking van de microbiële variabele V4 regio op een gemeenschappelijk platform van de sequencing. Dit protocol is gericht op het begeleiden van de wetenschappers ook geïnteresseerd in de inleiding van het gebruik van het 16S rRNA-amplicon sequencing in een robuuste, reproductieve, makkelijk te gebruiken en gedetailleerde manier, belangrijke besturingselementen gebruiken. Na een begeleide en gedetailleerde stap-by stap protocol batch effect kan minimaliseren en dus meer vergelijkbare rangschikkend resultaten tussen labs zal toestaan.
Protocol
Representative Results
Discussion
16S rRNA-amplicon en metagenomics jachtgeweer sequencing hebben opgedaan populariteit in klinische microbiologie toepassingen21,22,23. Deze technieken zijn voordelig in hun toegenomen capaciteit om te vangen culturable en niet-culturable taxa, verstrekken van gegevens over de relatieve abundantie van de pathogene entmateriaal en hun vermogen om te identificeren nauwkeuriger een besmettelijke polymicrobial vingerafdruk24. De vooruitgang op …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het programma van de ik-CORE (verleent nr. 41/11), de Israël Science Foundation (grant nr. 908/15), en de Europese ziekte van Crohn en Colitis organisatie (ECCO).
Materials
| Primers | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Extraction solution | Sigma-Aldrich | E7526 | |
| Dilution solution | Sigma-Aldrich | D5688 | |
| Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit | KAPABIOSYSTEMS | KK2601 | PCR Master mix |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent kit | Invitrogen | P7589 | dsDNA quantify reagent |
| MinElute Gel extraction kit | Qiagen | 28606 | |
| Agarose | Amresco | 0710-250G | |
| Ultra Pure Water Dnase and Rnase Free | Biological Industries | 01-866-1A | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Molecular probes | Q32854 | dsDNA detecting kit |
| High Sensitivity D1000 | Agilent Technologies | Screen Tape 5067-5582 | separation and analysis |
| Screen Tape Assay | Agilent Technologies | Reagents 5067-5583 | for DNA libraries |
| PhiX Control v3 | Illumina | 15017666 | control library |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | E406-10mL-TAM | |
| 2 mL collection tubes | SARSTEDT | 72.695.400 | Safe Seal collection tubes |
| Plastic stick swab in PP test tube | STERILE INTERIOR | 23117 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR Machine | Applied Biosystems | 2720 Thermal Cycler | |
| Sequncing Machine | Illumina | Miseq | |
| PCR workstation | Biosan | UV-cleaner | |
| scissors | |||
| vortexer | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 |
References
- Braun, T., et al. Fecal microbial characterization of hospitalized patients with suspected infectious diarrhea shows significant dysbiosis. Scientific Reports. 7, 1088 (2017).
- De Filippo, C., et al. Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 14691-14696 (2010).
- Yatsunenko, T., et al. Human gut microbiome viewed across age and geography. Nature. 486, 222-227 (2012).
- Rodriguez, J. M., et al. The composition of the gut microbiota throughout life, with an emphasis on early life. Microbial Ecology in Health and Disease. 26, 26050 (2015).
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444, 1027-1031 (2006).
- McDonald, D., et al. An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea. The ISME Journal. 6, 610-618 (2012).
- Bakken, J. S., et al. Treating Clostridium difficile infection with fecal microbiota transplantation. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 9, 1044-1049 (2011).
- Khoruts, A., Dicksved, J., Jansson, J. K., Sadowsky, M. J. Changes in the composition of the human fecal microbiome after bacteriotherapy for recurrent Clostridium difficile-associated diarrhea. Journal of Clinical Gastroenterology. 44, 354-360 (2010).
- Nood, E. V., et al. Duodenal infusion of donor feces for recurrent Clostridium difficile. The New England Journal of Medicine. 368, 407-415 (2013).
- Koplan, J. P., Benfari Ferraro, M. J., Fineberg, H. V., Rosenberg, M. L. Value of stool cultures. The Lancet. 316, 413-416 (1980).
- Platts-Mills, J. A., Liu, J., Houpt, E. R. New concepts in diagnostics for infectious diarrhea. Mucosal Immunology. 6, 876-885 (2013).
- Bokulich, N. A., et al. Quality-filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing. Nature Methods. 10, 57-59 (2013).
- Leek, J. T., et al. Tackling the widespread and critical impact of batch effects in high-throughput data. Nature Reviews Genetics. 11, (2010).
- Dubilier, N., McFall-Ngai, M., Zhao, L. Create a global microbiome effort. Nature. 526, 631-634 (2015).
- Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. PNAS. 108, 4516-4522 (2011).
- Flores, G. E., Henley, J. B., Fierer, N. A direct PCR approach to accelerate analyses of human-associated microbial communities. PloS One. 7, (2012).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
- Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13, 581-583 (2016).
- Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: A new phylogenetic method for comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 71, 8228-8235 (2005).
- Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: An effective distance metric for microbial community comparison. The ISME Journal. 5, 169-172 (2011).
- Srinivasan, R., et al. Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens. PloS One. 10, e0117617 (2015).
- Hiergeist, A., Gläsner, J., Reischl, U., Gessner, A. Analyses of intestinal microbiota: culture versus sequencing. ILAR Journal. 56, 228-240 (2015).
- Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nature Reviews Genetics. 13, 601-612 (2012).
- Salipante, S. J., et al. Rapid 16S rRNA next-generation sequencing of polymicrobial clinical samples for diagnosis of complex bacterial infections. PloS One. 8, e65226 (2013).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME Journal. 6, 1621-1624 (2012).
