Geführte Protokoll für fäkale mikrobielle Charakterisierung von 16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung
Summary
Dieses Manuskript beschreibt ein detaillierte standardisierte Protokoll von Hochdurchsatz-16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung. Das Protokoll stellt eine integrierte, uniformierte Machbare und preiswerte Protokoll Kotprobe Sammlung durch Datenanalysen ab. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse einer großen Anzahl von Proben mit strengen Standards und mehrere Steuerelemente.
Abstract
Der menschliche Darm Microbiome spielt eine zentrale Rolle beim Schutz der Zellen vor Verletzungen, bei der Verarbeitung von Energie und Nährstoffen und bei der Förderung der Immunität. Abweichungen von was als eine gesunde Mikrobiota Komposition (Dysbiose gilt) können lebenswichtige Funktionen führt zu pathologischen Bedingungen beeinträchtigen. Bisherigen und laufenden Forschung Bemühungen haben auf die Charakterisierung der Zusammenhänge zwischen mikrobiellen Zusammensetzung und menschliche Gesundheit und Krankheit.
Fortschritte in der Sequenzierung von Hochdurchsatz-Technologien ermöglichen Charakterisierung der mikrobiellen Zusammensetzung Darm. Diese Methoden umfassen 16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung und Schrotflinte Sequenzierung. 16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung wird verwendet, um taxonomische Zusammensetzung Profil während Schrotflinte Sequenzierung zusätzliche Informationen über Gene Vorhersagen und funktionellen Annotation bietet. In einer gezielte Sequenzierung Methode der 16 s rRNA Gens Variable Region von Vorteil ist die wesentlich geringeren Kosten im Vergleich zu Schrotflinte Sequenzierung. Sequenzunterschiede in der 16 s rRNA-Gen dienen als mikrobieller Fingerabdruck zur Identifikation und Quantifizierung von verschiedenen Taxa innerhalb einer einzelnen Probe.
Große internationale Anstrengungen haben Standards für die 16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung eingetragen. Mehrere Studien berichten jedoch eine Sourceschaltung der Variation von Batch-Effekt verursacht. Zur Minimierung dieser Effekt, uniformierten Protokolle für die Probenentnahme, müssen Verarbeitung und Sequenzierung umgesetzt werden. Dieses Protokoll schlägt die Integration von allgemein verwendeten Protokolle ab Kotprobe Sammlung auf Datenanalysen. Dieses Protokoll beinhaltet einen stützenfreie, direkt-PCR Ansatz, der gleichzeitige Handling und DNA-Extraktion einer großen Zahl von Stuhlproben, zusammen mit PCR Verstärkung der V4 Region ermöglicht. Darüber hinaus wird das Protokoll beschreibt die Analyse Pipeline und liefert ein Skript mit der neuesten Version des QIIME (QIIME-2-Version 2017.7.0 und DADA2). Dieses schrittweise Protokoll zielt darauf ab, die Interessenten bei der Einleitung der Verwendungdes der 16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung in einer robusten, reproduktive, einfach zu bedienen, detaillierte Weise zu führen.
Introduction
Konzentrierte Anstrengungen wurden unternommen, Microbiome Vielfalt und Fülle, als ein weiterer Aspekt für den Fang von Unterschiede und Ähnlichkeiten zwischen den Individuen in gesunden und pathologischen Bedingungen besser zu verstehen. Alter2,3, Geographie4, Lebensstil5,6, und Krankheit5 zeigten sich die Zusammensetzung der Darm Microbiome zugeordnet werden, aber viele Bedingungen und Populationen wurden noch nicht vollständig gekennzeichnet. Vor kurzem wurde berichtet, dass das Mikrobiom für therapeutische Anwendungen7,8,9geändert werden kann. Daher ist zusätzliche Einblicke in die Beziehung zwischen verschiedenen physiologischen Bedingungen und der mikrobiellen Zusammensetzung der erste Schritt zur Optimierung der potenzielle zukünftige Änderungen.
Die traditionelle mikrobielle Kultur-Methoden sind durch niedrige Erträge10,11begrenzt und sind konzipiert als einen binären Zustand, wo ein Bakterium ist entweder, im Darm zu präsentieren, oder nicht. Hochdurchsatz-DNA-basierte Sequenzierung hat mikrobielle Ökologie, ermöglichen die Erfassung aller Mitglieder der mikrobiellen Gemeinschaft revolutioniert. Länge und Qualität bleiben erhebliche Hindernisse für genaue Taxonomie Zuordnung12lesen Sequenz jedoch. Darüber hinaus können Batch-Effekte, Hochdurchsatz-basierte Experimente leiden an denen Messungen von nicht-biologischen oder nichtwissenschaftlichen Variablen13betroffen sind. In den letzten Jahren haben mehrere Programme eingerichtet, um der menschlichen Mikrobiom, einschließlich der amerikanischen Darm-Projekt, die Vereinigten Staaten (US) Human Microbiome Project und das Vereinigte Königreich (UK) MetaHIT Projekt zu studieren. Diese Initiativen haben Unmengen an Daten generiert, die nicht aufgrund mangelnder Konsistenz in ihren Ansätzen leicht vergleichbar sind. Eine Vielzahl von internationalen Projekten wie International Human Microbiome Consortium, das Projekt International Human Microbiome Standards und der National Institute of Standards and Technology (NIST) versucht, einige dieser Probleme14-Adresse , und entwickelt Standards für Microbiome Messungen, die das Erreichen der reproduktiven Ergebnisse ermöglichen sollte. Hier beschriebene ist ein integriertes Protokoll mehrere allgemein verwendeten Methoden15,16 für die 16 s rRNA Hochdurchsatz-Sequenzierung (16 s-Seq) ab Kotprobe Sammlung durch Datenanalysen. Das Protokoll beschreibt einen stützenfreien PCR-Ansatz, ursprünglich für direkte Extraktion von pflanzlichen DNA16, ermöglichen das gleichzeitige Handling einer großen Zahl von fäkalen Proben in relativ kurzer Zeit mit hoher Qualität verstärkt DNA für eine gezielte Sequenzierung der mikrobiellen Variable V4 Region auf einer gemeinsamen Plattform der Sequenzierung. Dieses Protokoll soll Wissenschaftler, die Verwendung der 16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung gewissermaßen robuste, reproduktive, einfach zu bedienen, ausführliche Einleitung mit wichtigen Kontrollen führen. Eine geführte und detaillierte Schritt-für-Schritt-Protokoll kann Batch-Effekt minimieren und so wird mehr vergleichbare Ergebnisse der Sequenzierung zwischen Labors zulassen.
Protocol
Representative Results
Discussion
16 s rRNA-Amplifikate und Metagenomik Shotgun Sequencing haben Popularität in klinischer Mikrobiologie Anwendungen21,22,23gewonnen. Diese Techniken sind vorteilhaft in ihre erhöhte Fähigkeit, kultivierbare und nicht-kultivierbare Taxa, die Bereitstellung von Daten über die relative Häufigkeit der pathogenen Inokulum und ihre Fähigkeit, genauer gesagt eine infektiöse Biofilm zu identifizieren zu erfassen Fingerabdruck-24. Die Fortsch…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde zum Teil unterstützt von Programms-CORE (Zuschüsse Nr. 41/11), Israel Science Foundation (Grant Nr. 908/15), und die europäischen Morbus Crohn und Colitis Organisation (ECCO).
Materials
| Primers | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Extraction solution | Sigma-Aldrich | E7526 | |
| Dilution solution | Sigma-Aldrich | D5688 | |
| Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit | KAPABIOSYSTEMS | KK2601 | PCR Master mix |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent kit | Invitrogen | P7589 | dsDNA quantify reagent |
| MinElute Gel extraction kit | Qiagen | 28606 | |
| Agarose | Amresco | 0710-250G | |
| Ultra Pure Water Dnase and Rnase Free | Biological Industries | 01-866-1A | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Molecular probes | Q32854 | dsDNA detecting kit |
| High Sensitivity D1000 | Agilent Technologies | Screen Tape 5067-5582 | separation and analysis |
| Screen Tape Assay | Agilent Technologies | Reagents 5067-5583 | for DNA libraries |
| PhiX Control v3 | Illumina | 15017666 | control library |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | E406-10mL-TAM | |
| 2 mL collection tubes | SARSTEDT | 72.695.400 | Safe Seal collection tubes |
| Plastic stick swab in PP test tube | STERILE INTERIOR | 23117 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR Machine | Applied Biosystems | 2720 Thermal Cycler | |
| Sequncing Machine | Illumina | Miseq | |
| PCR workstation | Biosan | UV-cleaner | |
| scissors | |||
| vortexer | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 |
References
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