Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Vastleggen van de kinetiek van de interactie van een ionkanaal eiwit met kleine moleculen door de Bio-laag interferometrie Assay

Published: March 7, 2018 doi: 10.3791/56846
Automatic Translation
1, 2, 1, 3
1Department of General Surgery, Tongren Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Key Laboratory of Systems Biomedicine (Ministry of Education), Institute of Systems Biomedicine, Shanghai Jiao Tong University, 3Hongqiao International Institute of Medicine, Tongren Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

Summary

Het protocol hier beschrijft de interacties van gezuiverde hEAG1 ion kanaal eiwit met de kleine molecuul lipide ligand phosphatidylinositol 4, 5-difosfaat (PIP2). De meting toont aan dat BLI zou een mogelijke methode voor nieuwe kleine-molecuul ion kanaal ligand screening.

Abstract

De bio-laag interferometrie (BLI) bepaling is een waardevol instrument voor het meten van de eiwit-eiwit en eiwit-kleine molecule interacties. Hier beschrijven we eerst de toepassing van dit nieuwe etiket-vrije techniek op de studie van de interactie tussen menselijke EAG1 (hEAG1) kanaal eiwitten met de kleine molecuul PIP2. hEAG1 kanaal is erkend als potentieel therapeutisch doel vanwege zijn afwijkende overexpressie in kanker en enkele winst-van-functie mutaties die betrokken zijn bij sommige soorten neurologische ziekten. We gezuiverd hEAG1 kanaal eiwitten uit een zoogdieren stabiele expressie-systeem en de interactie met PIP2 door BLI gemeten. De succesvolle meting van de kinetiek van de binding tussen hEAG1 eiwit en PIP2 toont aan dat de bepaling BLI een potentiële hoge gegevensdoorvoer aanpak gebruikt voor nieuwe kleine-molecuul ligand screening in ion kanaal farmacologie is.

Introduction

Gericht op de cel met kleine moleculen aan de oppervlak-toegankelijk ion kanaal eiwitten biedt een enorm potentieel voor de ligand screening en biologische drug discovery1,2,3. Zo nodig een passend instrument is voor de studie van de interactie tussen ionkanaal en kleine moleculen en hun corresponderende functies. De patch-clamp-opname heeft aangetoond een uniek en onvervangbaar techniek in ion kanaal functionele assay. Bepalen of de kleine molecules rechtstreeks richten ionenkanalen echter andere technologieën. Traditioneel, werd de radioactieve ligand bindende bepaling gebruikt voor het observeren van de kinetiek van de binding tussen klein molecuul en haar doel ion kanaal eiwit. Het gebruik van deze techniek is echter beperkt vanwege haar eis in radioactieve labeling en detectie. Bovendien, voorkomt de vereiste stap naar het label van de kleine ligand in de studie zijn gebruikt in vele soorten ionenkanalen zonder bekende specifieke ligand. Sommige label-vrije technieken zoals NMR spectroscopie, X-ray diffractie, microscale thermophoresis (MST)4 en oppervlakte plasmon resonantie (SPR) werden gebruikt voor het meten van de eiwit-kleine molecule interacties. Maar dit soort tests meestal niet voldoende informatie kunt verstrekken vanwege de moeilijkheid om de full-length eiwit, lage resolutie van dynamiek, lage doorvoersnelheid en hoge kosten5. In tegenstelling tot deze technieken, bio-laag Interferometry (BLI) ontpopt zich als een nieuwe label-vrije methodologie te overwinnen deze nadelen voor het opsporen van eiwit-kleine molecule interacties door immobilizing van een kleine hoeveelheid eiwitSteekproef op de oppervlakken van biosensor en het meten van de optische veranderende signalen6,7. Als een veelbelovende biosensor platform, BLI techniek is al uitgevoerd om te zien hoe de interactie van kleine moleculen met natuurlijke water oplosbare eiwitten zoals een menselijke monoklonale antistof CR80208 en de gedetailleerde bepaling procedure heeft gemeld in een vorige artikel9. Hoewel de belangrijke rol van ion kanaal eiwitten voor nieuwe therapeutische doelen ontdekking heeft erkend, is de ion kanaal eiwit-kleine molecule interactie bepaling op basis van BLI niet beschreven.

De mens Ether à go-go kanalen (hEAG1) worden uitgedrukt in verschillende types van kankercellen en centrale zenuwstelsel, waardoor het kanaal a potentiële therapeutische doel van veel kankers en neuronale stoornissen10,11, 12,13,14. Het elektrofysiologische studie in ons lab heeft bevestigd dat de remmende werking van phosphatidylinositol 4, 5-difosfaat (PIP2) op hEAG1 kanaal15. Op basis van onze resultaten, PIP2 testen direct interactie met de hEAG1 met behulp van BLI techniek kan worden als een model voor andere soorten ion kanaal eiwit-kleine molecule samengestelde interactie met name voor die kanalen ontbreken van specifieke liganden. Volgens de instructies van BLI assay, wij bereid biotinyleerd hEAG1 eiwitten en geïmmobiliseerd hen op het oppervlak van daar (SA) biosensor tips gevolgd door interactie hen naar PIP2 oplossingen voor het observeren van hun directe binding tussen de eiwitten en de lipide. Na het aanbrengen van PIP2 op het gecoate oppervlak van hEAG1 eiwit, de dikte van de laag aan de oppervlakte toeneemt, die direct correleert de spectrale verschuiving en kan worden gemeten in real-time16. De bindende kinetiek kan worden bepaald als gevolg van een positieve verschuiving in vereniging stap en een negatieve verschuiving in dissociatie stap. Volgens dit principe, we gezuiverd van het functionele hEAG1 ion kanaal eiwit van HEK-239T stabiele expressie systeem met behulp van affiniteit zuivering methode de functionele toestand in vitro te handhaven, dan de kinetiek van de binding van gemeten verschillende concentratie PIP2, en leverde een semblable kinetische gegevens zoals waargenomen in elektrofysiologische metingen15. De nauwe correspondentie tussen de resultaten van de BLI en elektrofysiologische metingen tonen voor het eerst de geschiktheid van BLI als een passende analytische tool voor ion kanaal membraan eiwit-kleine molecule interactie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Opmerking: De HEK-293T-cellijn voortdurend uiting van vlag-gelabeld hEAG1 kanaal eiwit is gebouwd door transfecting een pCDH lentivirale plasmide met de opeenvolging van DNA van hEAG1 met een vlag in de distale C-terminus in HEK-293T cellen, gevolgd door de puromycin-resistente selectie15zoals hiervoor is beschreven.

1. affiniteit zuivering van vlag-gelabeld hEAG1 kanaal eiwit uit HEK-293T cellen

  1. Ontdooi cellen stabiel hEAG1 kanalen van vloeibare stikstof te uiten in het warme water (37 ° C) snel. Beënt de cellen (ongeveer 5 x 106 bevroren cellen) in een 10 cm schotel. Groeien de cel overnachting in Dulbecco van bewerkt Eagle's (DMEM) medium aangevuld met 8 mL 10% foetale runderserum (FBS) 100 eenheden/mL penicilline, 100 μg/mL streptomycine, 4 mM L-glutamine en veranderde het medium de volgende dag.
  2. Controleer de GFP fluorescentie van deze cellen HEK-293T met behulp van een fluorescente microscoop om ervoor te zorgen dat het hoge percentage cellen express stabiel hEAG1 kanalen in het kweken systeem. Trypsinize exponentieel groeiende cellen met 1 mL van 0,25% trypsine voor 1 minuut bij kamertemperatuur en thenadd 2 mL serum-bevattende cultuur vloeistof te beëindigen van de spijsvertering. 400 μL van celsuspensie overbrengen in een 15 cm schotel met 15 mL van volledige DMEM medium. Bereidt gerechten, vier 15 cm in totaal.
  3. Oogsten van deze cellen na 2-3 dagen cultuur wanneer de cellen op ongeveer 90 bereiken % confluentie.
    1. Verwijder het groeimedium uit de cellen en was ze twee keer met 4 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (1 x PBS, pH = 7.4).
    2. Gooi PBS na het wassen.
    3. Schraap de cellen in 2 mL 1 x PBS voor elk gerecht met behulp van cel schrapen en overdracht de geschraapt cellen met 1 mL Pipetteer in een tube van 15 mL.
    4. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 420 x g bij 4 ° C.
    5. Decanteren en verwijder het supernatant.
    6. Resuspendeer de pellet cel in totaal 4 mL lysisbuffermengsel (10 mM HEPES, 1.5 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 1% NP-40, pH 7.0, ingeperkt volledige proteaseinhibitor) gedurende 30 minuten op ijs en vortex grondig de lysate elke 10 min.
    7. Centrifugeer de cel lysate gedurende 10 minuten bij 12.000 x g bij 4 ° C.
    8. Het supernatant overbrengen in een tube van 5 mL en bewaar deze op ijs voor onmiddellijk gebruik.
  4. De hars Dizzee RASCAL M2 affiniteit voor te bereiden.
    1. Grondig schorten de hars (geleverd als een 50%-suspensie in winkel buffer) door zachte inversie om ervoor te zorgen dat de fles van Dizzee RASCAL M2 affiniteit gel is een uniforme opschorting van gel kralen.
    2. Onmiddellijk overdracht 400 μL van schorsing tot een gekoeld 1,5 mL koker.
    3. Centrifugeren van de suspensie voor 30 s bij 8, 000 x g bij 4 ° C en verwijder het supernatant zorgvuldig te wassen de buffer van de winkel.
    4. 500 μL 1 x PBS toevoegen aan de hars en de pellet met 1 mL pipet op te schorten. Vervolgens het centrifugeren van de suspensie voor 30 s bij 8, 000 x g bij 4 ° C en gooi het supernatant PBS zorgvuldig. Herhaal deze wassen stap naar de opgeslagen buffer leeg.
  5. Voeg toe 500 μL eiwit extract supernatant bereid bij stap 1.3.8 tot de hars pellet op te schorten de pellet en spoel de suspensie tot een nieuwe gekoeld 5 mL koker. Herhaal deze stap opnieuw om ervoor te zorgen dat geen gel kralen links. Voeg de linker eiwit-extract aan het mengsel.
  6. Incubeer het mengsel 's nachts in een roteerapparaat bij 8 omwentelingen per minuut bij 4 ° C tot de vlag fusieproteïne te vangen.
  7. Centrifugeer het mengsel na 12u incubatie gedurende 10 min bij 1, 000 x g bij 4 ° C.
  8. Verwijder het supernatant en wassen van de pellet driemaal met 500 μL van 1 x PBS. Houd het op ijs voor onmiddellijk gebruik.
  9. De vlag hEAG1 elutie eiwit met 3 x vlag peptide.
    1. 3 X FLAG elutie oplossing voor te bereiden. Los op 3 X FLAG peptide in 500 μL stockoplossing (0.5 M Tris-HCl, 1 M NaCl, pH = 7,5) met een concentratie van 8 μg/μL.
    2. Voeg toe 10 μL 3 x vlag elutie oplossing aan 390 μL van PBS een 200 ng/μL eindconcentratie oplossing.
    3. 400 μL van 3 x vlag elutie oplossing aan de gel kralen voorbereid op stap 1.8 toevoegen.
    4. Incubeer het monster in het roteerapparaat bij 8 omwentelingen per minuut gedurende 2 uur bij 4 ° C.
    5. Centrifugeer de hars voor 30 s bij 8, 000 x g.
    6. Het supernatant overbrengen in een verse 1,5 mL-buis en sla het bij 4 ° C voor onmiddellijk gebruik.

2. concentratie Assay en bevestiging van gezuiverd vlag Fusion hEAG1 door BCA eiwit Assay Kit en het westelijke bevlekken

  1. Bepaal de concentratie van gezuiverde eiwit met de BCA eiwit assay kit volgens de vervaardiging's instructie.
  2. Gebruik 30 μL steekproeven voor westelijke analyse om te bevestigen dat de proteïne van belang had gezuiverd met behulp van een antilichaam Anti-Flag als eerder beschreven15.

3. het labelen van de gezuiverde kanaal eiwit met biotine voor de BLI Assay

  1. Bereiden van 5 mg/mL stockoplossing van Biotine in PBS. Toevoegen voor elke test (twee biosensoren), een 3-voudig molaire overmaat van biotine op 20 μg gezuiverde proteïne te bereiken van een beter biotinylation van de N-terminal van de gezuiverde proteïne in PBS.
  2. Incubeer het monster in het donker in de ijskast voor minstens 30 min.
  3. Voorbereiding van de steekproef verdunning (SD)-buffer: PBS met 0,02% Polysorbaat 20 en 0,1% bovien serumalbumine (BSA, pH 7.4).
  4. Ultrafiltratie als u wilt wijzigen de buffer van de gezuiverde kanaal proteïne aan SD buffer uitvoeren De niet-afhankelijke Biotine verwijderen met behulp van ultrafiltratie apparaat met molecuulgewicht cutoff van 30 kDa, het toevoegen van de SD-buffer en centrifugeren van het monster van 12.000 x g, voor 10 min bij 4 ° C.
  5. Verwijder de ultrafiltrate uit de centrifugebuis van ultrafiltratie apparaat, 200 μl SD buffer in het filter apparaat toevoegen en centrifugeren het monster 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4° C. Herhaal deze handeling ten minste driemaal.
  6. Voor het verzamelen van de buffer uitgewisseld monster, omgekeerd invoegen het filter apparaat in een tube van 1,5 mL en centrifugeren hen bij 2.000 x g, gedurende 5 min bij 4 ° C. Houd het monster op het ijs voor onmiddellijk gebruik.

4. bereiding van PIP2 oplossing Assay

  1. De stockoplossing van PIP2 (1 mM) in gedeïoniseerd H2O bereiden door gedurende 30 minuten op ijs als eerder beschreven17sonicating. Bewaar de oplossing in glazen flesjes op-20 ° C en het verdund om de eindconcentraties onmiddellijk vóór experimenten door krachtige vortexing.

5. BLI Assay

  1. Schakel de apparatuur en controleren van het "instrument" statusvenster om te controleren of dat de machine is "ready" staat de apparatuur ten minste prewarm gedurende 30 minuten vóór de BLI-studie.
  2. Zorg ervoor dat de deur van het instrument is afgesloten alvorens de Data-acquisitie software te openen en kies de "nieuwe kinetiek Experiment" in de Experiment-Wizard.
  3. Definieer de putjes op de 96-wells-plaat door rechts te klikken om te kiezen van de buffer, belasting en monster worden gebruikt. Voor monster putten, de eenheid voor concentratie van biotinyleerd vlag hEAG1 fusieproteïne moet worden ingevoerd als molar (10 μg, 0.09 μM).
  4. Definieer de assay stappen, met inbegrip van de basislijn, laden, associatie en dissociatie. Kies een stap assay en tweevoudig tikken voort naar de desbetreffende kolom. Een duplicaat van assay definitie is ingesteld voor controle sensoren. Stel de rpm als 1.000. Kies 1 min voor basislijn stap en 5 – 10 min voor laden, associatie en dissociatie, respectievelijk. Het uitvoeren van de test bij kamertemperatuur (ongeveer 24 ° C).
    Opmerking: Er zijn twee belangrijke procedures: laden van het biotinyleerd kanaal eiwitten aan de sensoren en keuring van de interactie met klein molecuul verbindingen. Ze kunnen voortdurend worden overgegaan (basislijn, laden, basislijn, associatie en dissociatie). Als alternatief, ze kunnen worden overgegaan afzonderlijk om te voorkomen verspillen van de test-verbindingen als de eerste laden mislukt deel.
  5. Klik op de kolommen die de sensoren bevatten en klik op de "opvulling" om aan te geven van de locaties van sensoren in de lade van de sensor.
  6. Bekijk alle geplande stappen om te controleren op fouten en ga terug naar het corrigeren.
  7. Stel de locatie van gegevensbestanden en klik op "Go" om te beginnen met de test.
    Opmerking: De sensoren nodig prewetted gedurende ten minste 10 min. in SD buffer, als deze stap heeft gedaan, dan de instelling 'Uitgestelde start van het experiment' moet worden overgeslagen. Als dat niet het geval is, een 600 s vertraging instellen voordat de prewetting van de sensoren.
  8. Zet een zwarte 96-wells-plaat in de bodem van de lade en de hoek van de A1 van de plaat in de uitsparing in de lade legt de plaat plaats invoegen. Voor de putten voor het laden van de sensoren, voeg 200 μL van assay buffer per putje in 2 putten in rij A en 2 wells in rij B van de 96-wells-plaat.
  9. Bereiden een andere zwarte 96-wells-plaat als de monster-plaat en de putjes vullen met 200 μl SD buffer in rij B als besturingselement of biotinyleerd hEAG1 eiwit oplossing (10 μg) in rij A zoals tijdens de programmering in stap 5.3 toegewezen.
    Opmerking: Vermijd invoering van bubbels.
  10. Open het deurtje van het instrument en schuif de lade van de sensor en proef van de plaat in de linker en rechter plaat houder, respectievelijk. Controleer dat de sensor lade en monster plaat staan juist gebaseerd op de vorm van links plaat houder en "A1" markering op de hoogste juiste hoek van de juiste plaat houder. Sluit de deur en start van de test.

6. de gegevensanalyse

  1. Open de Data-analyse software en laadt u de map met de gegevens van de bepaling. Klik op "Verwerking" te krijgen in de menu-interface van de verwerking en zien we de kleurrijke rauwe kinetische bochten.
  2. Onder stap 1: "Gegevensselectie", klik op "Sensor selectie". Op de "Sensor lade #1", klik op de sensor putten alleen bevochtigd met SD buffer en klik met de rechtermuisknop op "Verandering Sensor Type" op "Reference Sensor". Op de ' Sample plaat kaart ", wijzen de alle de aspecifieke bindende putjes en klik met de rechtermuisknop op"Verandering goed Type"te"Goed referentie".
  3. Tik in het vak vóór "Aftrekken" van stap 2 en wijs 'Dubbele Reference'.
  4. In stap 3: "Align Y-as", selecteer "Baseline" als de uitlijning stap. Voer bij "tijdsbereik", de laatste 10 s van dat basislijn (d.w.z. uit: 0.1 tot: 59,8).
  5. In stap 4: "Inter stap Correction", selecteer "uitlijning op basislijn" om te minimaliseren van signaal verschuivingen tussen de associatie en dissociatie stappen.
  6. In stap 5: "Proces", selecteer Savitzky-Golay filter functie in de meeste gevallen en ga door "Procesgegevens".
  7. Ruwe gegevens worden opgeslagen voor verdere gegevensanalyse gebruikmaken van andere software in stap 7: "Resultaten opslaan".
  8. Klik op "analyse | Curve-Fitting".
    1. Kies voor "Stap te analyseren", "vereniging | Dissociatie". Voor "Model", selecteert u 1:1.
      Opmerking: we kiezen voor 1:1 model omdat het goed op onze oorspronkelijke gegevens voorzien en de mogelijkheid van vermeden over montage onder 1:2 of 2:1 model te wijten aan hun grote vrijheid. Maar andere opties hier beschikbaar zijn en naar behoren kunnen worden gekozen voor de analyse van andere montage voor verschillende bindende modellen van de analyt.
    2. Kies voor "Montage", Global (volledig). Selecteer voor "Groeperen op", "Kleur". Selecteer "Rmax ontkoppeld door Sensor" dat onafhankelijke montage van maximale signaal reactie (Rmax).
    3. Klik op "Fit Curves!" om te beginnen met de niet-lineaire regressie-analyse. Vergelijking van de heuvel en enkele exponentiële functie werden gebruikt in onze studie.
    4. Klik op "gegevens exporteren | Rapport opslaan"om op te slaan resultaten passend. Of klik op "gegevens exporteren | Montage resultaten exporteren"om op te slaan van de ruwe gegevens voor verdere grafieken en gegevensanalyse met andere software.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

We de vlag hEAG1 kanaal fusieproteïne van HEK-293T cellen stabiel overexpressie hEAG1 gezuiverd. De functie van deze fusieproteïne is aangetoond met behulp van de patch-clamp-methode en de kwaliteit en de specificiteit van gezuiverde eiwit worden bevestigd door westelijke vlek (Figuur 1). De gezuiverde kanaal eiwit is biotinyleerd voor het uitvoeren van een bepaling van de interactie met de lipiden (PIP2) met behulp van de real-time BLI assay. De BLI bindende assay configuratie is afgebeeld in Figuur 2. Een typische bindende curve tussen hEAG1 en PIP2 is afgebeeld in Figuur 3. In dit geval 3 μM PIP2 wordt opgelost in PBS buffer (de configuratie van PIP2 is weergegeven in aanvullende figuur 1), en het signaal wordt geanalyseerd met behulp van een dubbele verwijzing aftrekken protocol aftrekken van de niet-specifieke binding (de bindingen tussen de sensor en PIP2), (de interactie tussen biotinyleerd hEAG1 eiwit en PBS) achtergrond en drift (de binding tussen de sensor en PBS) veroorzaakt door de variabiliteit van de sensor signaal. En de bindende trace is wereldwijd passen en komt te staan van een goed passend overlay (aanvullende figuur 2). Ook, meten we de kinetiek van de binding van PIP2 naar het gezuiverde hEAG1 kanaal complex door de eiwitten in verschillende concentraties van PIP2aan het broeden. Na analyse krijgen we een constante waarde (Kd) van de dissociatie van 0.35 ±0.04 μM, die lijkt op de IC50 waarde uit het elektrofysiologische metingen15. Deze resultaten aangetoond dat de bepaling BLI afhankelijk van de ion kanaal membraan eiwit- en lipiden interactie analyse is.

Figure 1
Figuur 1: identificatie van de expressie, de functie en de specificiteit van recombinante hEAG1 eiwit uit HEK-293T cellen door GFP imaging, klem, en westelijke vlek, respectievelijk patch. (A) het systeem van stabiele expressie hEAG1 HEK-293T is gebracht door monoclonal puromycin-resistente selectie na transfectie met hEAG1-pCDH lentivirus systeem blijkens GFP expressie in bijna alle cellen. (B) Pulse protocol (boven) en bovenop de huidige sporen van een representatieve geheel-cel patch-clamp opname uit hEAG1 kanalen in een stabiele cel in A. De stroom wordt opgewekt door het depolarizing van de spanningen van de spanning van het bedrijf van -80 mV tot 70 mV met de stap van 10 mV gevolgd door repolarisatie tot -80 mV. De cellen worden geïncubeerd in het normale K+ kanaal opnemen oplossingen zoals eerder beschreven15. De voltage-afhankelijke uiterlijke kalium stromingen suggereren dat er zeer functionele hEAG1 kanalen worden uitgedrukt in HEK293T cellen. (C) westelijke vlek van hEAG1 kanaal eiwit uit gezuiverde EiwitSteekproeven. Het antilichaam Dizzee RASCAL herkent een één eiwit band van ~ 110 kDa, aan te tonen een gemiddelde lengte van de vlag-gelabeld hEAG1 kanaal expressie. Deze Figuur 1 c is van Han et al. gewijzigd 15. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: een schematisch diagram toont de BLI-koppelingsprotocol assay. Vier sensoren worden gebruikt in parallel in biotinyleerd-kanaal proteïnen of hun opgeloste SD buffer voor het laden van de eiwitten van het kanaal en de verwijzingen. Na dat worden deze vier sensoren doorgegeven assay fase om de vereniging en de scheiding met fosfolipiden of haar oplossing buffer te detecteren. De posities van de proteïnen van de channel, fosfolipiden en buffer zijn gekleurd zoals aangegeven. De horizontale rode stippellijn geeft aan de twee hoofdstappen van BLI studie: fase en interactie assay fase laden. Deze Figuur 2 is van Han et al. gewijzigd 15. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Screen captures de ruwe gegevens en verwerkte gegevens in een typische BLI studie tonen. (A) typisch laden en evenwichtsinstelling curven weergegeven: de evenwichtsinstelling stap (60 s) met SD-buffer (basislijn), de stap van de laden met hEAG1 eiwitten (laden) en de referentie-curve geëquilibreerd en vol met hEAG1 eiwitten (laden), gelijktijdige meting van twee afzonderlijke sensor tips. (B) de verticale rode lijnen geven het overbrengen van sensoren van de lipide-oplossing naar de bufferoplossing assay tijdens. (C) het origineel optische signalen op associatie en dissociatie fasen na het verwerken van de dubbele referentie aftrekken aftrekken van de niet-specifieke binding signalen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Resultaten van BLI assay tonen hEAG1 kanaal eiwit directe wisselwerking met PIP2. (A) Screen capture waarin de ruwe data van hEAG1 binding aan eiwitten met PIP2 op concentratie-afhankelijkheid wijze (0.03-3 μM). De geaccumuleerde concentraties van PIP2 aangeduid overeenkomt met de biosensoren gegevens sporen. (B) de verwerking van raw gegevens tonen de veranderingen in optische interferentie in verschillende concentraties voor PIP2 in een representatieve test. (C) Curve passen bij Hill vergelijking verkregen van de piekwaarde van de optische interferentie-signaal gemeten bij verschillende PIP2 concentraties voor bepaling van het evenwicht dissociatieconstanten (Kd) van de interactie tussen de hEAG1 kanaal eiwit en PIP2 (n = 3). De figuur 4B en 4 C zijn van Han et al. gewijzigd 15. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Aanvullende figuur 1: de configuratie van lange-keten phosphatidylinositol 4, 5-difosfaat (PIP2). Klik hier voor het downloaden van dit cijfer.

Aanvullende figuur 2: Screen capture van de ingerichte overlay van de BLI bepaling van figuur 3. De gegevens worden verwerkt en uitgerust en alleen weergegeven associatie en dissociatie fasen. De curve van de verwerkte gegevens is blauw en de curve van de niet-lineaire montage is rood. Goedheid van fit: R2 = 0.984789, X2 = 0.019109. De maximale bindende parameter (Rmax) = 0.2875 nm (± 0.0006). Klik hier voor het downloaden van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ionenkanalen van de membraan zijn geverifieerd als de primaire therapeutische doelen van meer dan 13% van de op dit moment bekende medicijnen voor de behandeling van een verscheidenheid van ziekten bij de mens, met inbegrip van cardiovasculaire en neurologische stoornissen18. Patch-clamp opnemen, is de gouden standaard voor het meten van de functionele van ionenkanalen met kleine molecules, wijd verbeid gebruikt voor ion kanaal liganden screening. Echter niet kunnen dergelijke elektrofysiologische benaderingen aantonen of de kleine molecules zich bindt aan de zender rechtstreeks of niet19, omdat het kleine molecuul op andere eiwitten of intercellulaire paden die met het kanaal samenwerken konden reageren. In vergelijking met de gebruikte radioactieve ligand bindende bepaling en andere veelgebruikte label-vrije biosensor methoden, heeft BLI belangrijke voordelen in termen van relatieve eenvoudige regeling, de onbeperkte vereniging fase, hoog in de gehele, assay ontwerp dichter tot het systeem van in-vivo en behoefte aan een kleine hoeveelheid van geïmmobiliseerdet proteïne (een paar μg), en het kunnen bieden gedetailleerde inzichten in kinetische gegevens5,6,20.

Om maximaal simuleren de in vivo situatie, we gezuiverd de functionele hEAG1 kanaal eiwitten van de zoogdieren stabiel expressie systeem. Een gemakkelijke en efficiënte protocol voor zowel de zuivering en de identificatie van het eiwit kanaal overexpressie ion van aanhangend zoogdiercellen wordt gepresenteerd. Enkele belangrijke tips voor succesvolle zuivering van de membraaneiwitten zijn: 1) het zuiveringsproces kunnen verkleinde of geschaald-up volgens de overvloed van de expressie van belang eiwitten in zoogdieren expressiesystemen; 2) wij gesmolten een vlag tag op de C-terminus van hEAG1 kanaal ter vergemakkelijking van de reiniging van dit proteïne met Anti-Flag affiniteit kralen met het commerciële kit en zuivering protocol. Een elektrofysiologische meting blijkt dat de fusie vlag geen invloed op de functie van dit kanaal15 heeft; 3) incubatie van het mengsel van Dizzee RASCAL kralen en eiwit extract's nachts bij 4° C met voorzichtig schudden is nuttig voor het vastleggen van de vlag fusieproteïne; 4) met behulp van de zuivering van de affiniteit, kunnen we voldoende hEAG1 ion kanaal eiwit uit vier gerechten van 15 cm met boven 90% cel confluency voor eenmaal assay proces.

Het gezuiverde hEAG1 kanaal eiwitten zijn biotinyleerd met behulp van overtollige Biotine (3-10 vouwen) en uitwisselen van de buffer oplossing met SD buffer voor de verdere BLI assay. De overtollige Biotine kan maximaal wijzigen het membraan kanaal eiwit te vergroten de gecoate doelmatigheid op het oppervlak van biosensor tips en de SD assay buffer met lage concentraties van BSA en Polysorbaat 20 niet-specifieke binding9kunt minimaliseren. Ondanks deze belangrijke operaties verlopen, de niet-ideale interacties nog zou bestaan vooral bij het uitvoeren van een bindende studie met een hoge concentratie van kleine molecule, die niet-specifiek aan het oppervlak van SA sensoren en resultaat gebonden kon de vals-positieve interactie als de cyanine curve in figuur 4Aweergegeven. Dus, een dubbele verwijzing aftrekken protocol is nog steeds noodzakelijk om de betrouwbare resultaten door af te trekken van de aspecifieke bindingen met inbegrip van de interacties tussen de sensor en een klein molecuul, biotinyleerd hEAG1 eiwit met klein molecuul oplossing, en sensoren met een klein molecuul oplossing. Deze dubbele verwijzing aftrekken bewerking moet vier biosensoren voor één keer assay. Twee biosensoren zal worden bekleed met biotinyleerd membraaneiwitten en procedure de interactie assay met klein molecuul en de buffer. De andere twee sensoren zullen wordt bevochtigd met SD buffer en interactie met klein molecuul en de buffer. Alleen de interactie van membraan eiwit geïmmobiliseerd biosensor en klein molecuul toont het positieve signaal en de rest van drie interactie signalen werk als de besturingselementen (Figuur 2). Met behulp van deze procedure, zoals in Figuur 3 en 4 van de figuur, onze resultaten duidelijk aantonen dat de sterke interactie tussen hEAG1 kanaal eiwitten en PIP2 en een concentratie-afhankelijkheid profiel weergeven. Moet opgemerkt worden dat er enkele beperkingen in onze meting zijn. Bijvoorbeeld, zijn er sommige andere lipiden membraan die aan de gezuiverde kanaal proteïne binden kunnen. Ook, het is nog niet duidelijk dat of de verankerde gezuiverde proteïne hun originele bevleesdheid en activiteit houden. Het is heel moeilijk om te meten de echte configuraties van klein molecuul lipiden wanneer ze met het eiwit interageren. Hoewel de gedetailleerde processen zijn onbekend, onze studie blijkt dat de bindende kinetiek door BLI consistent zijn met de afgeleid door elektrofysiologische opname, waardoor de roman BLI toepassing voor ion kanaal eiwit-kleine molecule interactie in een aanvullende wijze.

Kortom bevestigt onze studie dat er een betrouwbare strategie door het zuiveren van de functionele membraan eiwitten van zoogdieren expressie systeem om te ontdekken de directe interactie met haar liganden. De succesvolle toepassing van BLI voor membraan eiwit-kleine molecule interactie zal de kleine molecuul screening en mechanisme exploratie in ion kanaal drugontdekking vergemakkelijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door de Bio-ID Center en SJTU Cross-disciplinair onderzoeksfonds in geneeskunde en Engineering (YG2016QN66), National Natural Science Foundation of China (31271217), en nationale Basic Research programma van China (2014CB910304).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/High Glucose Medium HyClone SH30243.01
Phosphate Buffered Saline (1x) HyClone SH30256.01
Fetal Bovine Serum Gibco 10270
Penicillin/Streptomycin Gibco 1697550
Cell Culture Dish Corning 430599 150 mm X 25 mm
Nonidet P-40 Substitute Amresco E109
Sodium chloride BBI Life Sciences A610476
Potassium chloride BBI Life Sciences A610440
Bovine Serum Albumin BBI Life Sciences A600332
Polyoxyethylene-20-Sorbitan Monolaurate BBI Life Sciences A600560
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel Sigma A2220
3x FLAG peptide Sigma F4799
Octet-RED96 Pall/FortéBio 30-5048
Data Acquisition software Pall/FortéBio Version 7.1
Data Analysis software Pall/FortéBio Version 7.1
Biosensor/Streptavidin Pall/FortéBio 18-5019
Microtiter plate Greiner Bio-one 655209
Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin ThermoFisher 21338
Centrifugal Machine ThermoFisher 75004250
PageRuler Prestained Protein Ladder ThermoScientific 318120
Ultrafiltration device MILLIPORE UFC503008 NMWL of 30 kDa
phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) Sigma P9763
Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody Sigma F1804 1:2000 dilution
goat anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody Santa Cruz Biotechnology sc-2005 1:5000 dilution
Enhanced BCA Protein Assay Kit Beyotime P0010
Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche 04693159001
Amersham Imager 600 Imaging System GE Healthcare Bio-Sciences
Western blot system BIO-RAD

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. Biophysical Interactions with Model Lipid Membranes: Applications in Drug Discovery and Drug Delivery. Mol. Pharm. 6 (5), 1264-1276 (2009).
  2. van de Waterbeemd, H., Smith, D. A., Beaumont, K., Walker, D. K. Property-based design: Optimization of drug absorption and pharmacokinetics. J. Med. Chem. 44 (9), 1313-1333 (2001).
  3. Papo, N., Shai, Y. Exploring peptide membrane interaction using surface plasmon resonance: Differentiation between pore formation versus membrane disruption by lytic peptides. Biochemistry. 42 (2), 458-466 (2003).
  4. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nat. Commun. 1, 100-106 (2010).
  5. Fechner, P., et al. Size does matter! Label-free detection of small molecule-protein interaction. Anal. Bioanal. Chem. 406 (17), 4033-4051 (2014).
  6. Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of Bio-Layer Interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. J. Pharm. Biomed. Anal. 72, 150-154 (2013).
  7. Wartchow, C. A., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. J. Comput. Aided Mol. Des. 25 (7), 669-676 (2011).
  8. Ekiert, D. C., et al. A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses. Science. 333 (6044), 843-850 (2011).
  9. Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects. J. Vis. Exp. (84), e51383 (2014).
  10. Occhiodoro, T., et al. Cloning of a human ether-a-go-go potassium channel expressed in myoblasts at the onset of fusion. Febs Lett. 434 (1-2), 177-182 (1988).
  11. Pardo, L. A., Stuhmer, W. Eag1: An emerging oncological target. Cancer. Res. 68 (6), 1611-1613 (2008).
  12. Simons, C., et al. Mutations in the voltage-gated potassium channel gene KCNH1 cause Temple-Baraitser syndrome and epilepsy. Nat. Genet. 47 (1), 73-77 (2015).
  13. Kortum, F., et al. Mutations in KCNH1 and ATP6V1B2 cause Zimmermann-Laband syndrome. Nat. Genet. 47 (6), 661-667 (2015).
  14. Han, B., Tokay, T., Zhang, G. M., Sun, P., Hou, S. Eag1 K+ Channel: Endogenous Regulation and Functions in Nervous System. Oxid. Med. Cell. Longev. 2017, (2017).
  15. Han, B., et al. Human EAG channels are directly modulated by PIP2 as revealed by electrophysiological and optical interference investigations. Sci. Rep. 6, (2016).
  16. Do, T., et al. A rapid method for determining dynamic binding capacity of resins for the purification of proteins. PREP. 60 (2), 147-150 (2008).
  17. Rohacs, T., Chen, J., Prestwich, G. D., Logothetis, D. E. Distinct specificities of inwardly rectifying K+ channels for phosphoinositides. J. Biol. Chem. 274 (51), 36065-36072 (1999).
  18. Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there? Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).
  19. Suh, B. C., Hille, B. PIP2 is a necessary cofactor for ion channel function: How and why? Annu. Rev. Biophys. 37, 175-195 (2008).
  20. Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms. J. Vis. Exp. (122), e55659 (2017).

Tags

Biochemie kwestie 133 Bio-laag Interferometry (BLI) ion kanaal eiwit klein molecuul EiwitReiniging affiniteit zoogdieren stabiele expressie systeem menselijke EAG1 (hEAG1) kanaal Geneesmiddelenontwikkeling therapeutische doelen ligand screening
Vastleggen van de kinetiek van de interactie van een ionkanaal eiwit met kleine moleculen door de Bio-laag interferometrie Assay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Han, B., Zhang, M., Sun, P., Hou, S. … More

Han, B., Zhang, M., Sun, P., Hou, S. Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay. J. Vis. Exp. (133), e56846, doi:10.3791/56846 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter