Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Захват кинетика взаимодействия ионного канала белка с малых молекул в Assay интерферометрии био слоя

Published: March 7, 2018 doi: 10.3791/56846
Automatic Translation
1, 2, 1, 3
1Department of General Surgery, Tongren Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Key Laboratory of Systems Biomedicine (Ministry of Education), Institute of Systems Biomedicine, Shanghai Jiao Tong University, 3Hongqiao International Institute of Medicine, Tongren Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

Summary

Протокол описывает взаимодействие очищенный hEAG1 ионный канал белка с маленькой молекулы липидов лигандом фосфатидилинозитол 4, 5-Бисфосфат (пункт2). Измерения демонстрирует, что BLI может быть потенциальным методом для Роман мелкомолекулярных ионного канала лигандом скрининга.

Abstract

Био слоя пробирного интерферометрии (BLI) является ценным инструментом для измерения протеин протеина и молекулы белка маленький взаимодействий. Здесь, мы сначала описать применение этот роман метки бесплатно технику для изучения взаимодействия человеческого EAG1 (hEAG1) белки канал с маленькой молекулы PIP2. hEAG1 канал был признан потенциальных терапевтических цели из-за его аномальным гиперэкспрессия в несколько мутаций усиления функции участвуют в некоторых видах неврологических заболеваний и рака. Мы очищенной hEAG1 канал белки от системы млекопитающих стабильной выражение и измерить взаимодействие с2 PIP, BLI. Успешного измерения кинетики привязки между hEAG1 белка и ПУМ2 показывает, что BLI assay потенциал высок объём подход, используемый для Роман малые молекулы лиганда скрининга в фармакологии ионного канала.

Introduction

Ориентация клеток поверхности доступные ионного канала белков с малых молекул предлагает огромный потенциал для скрининга лиганда и биологических наркотиков открытие1,2,3. Таким образом соответствующий инструмент необходим для изучения взаимодействия между ионного канала и малых молекул и их соответствующие функции. Патч зажим запись была продемонстрирована быть уникальной и незаменимой техники в ионных каналов функциональных assay. Однако, определение ли малые молекулы предназначены непосредственно для ионных каналов требуют других технологий. Традиционно радиоактивных лигандом привязки был использован соблюдать кинетика привязки между малые молекулы и его целевого белка ионного канала. Однако использование этой техники является ограниченным из-за его требование радиоактивных маркировки и обнаружения. Кроме того предварительные шаг для обозначения мелких лиганд в исследовании предотвращает его использование во многих типах ионных каналов без известных конкретных лиганда. Некоторые метки бесплатные методы, такие как ЯМР спектроскопии, рентгеновской дифракции, микромасштабной thermophoresis (MST)4 и поверхностного плазмон резонанса (СРП) были использованы для оценки взаимодействия молекулы белка маленький. Но эти виды анализов обычно не может предоставить достаточно информации из-за трудности, чтобы получить полноценный белок, низкое разрешение, динамики, низкой пропускной способности и высокой стоимостью5. В отличие от этих методов био слоя интерферометрии (BLI) формируется как Роман метки бесплатно методология для преодоления этих недостатков для обнаружения взаимодействия молекулы белка маленький иммобилизирующие небольшое количество белка образца на поверхностях Биосенсор и измерительные оптические изменения сигналов6,7. Как перспективной платформой биосенсор, BLI техника уже выполняется наблюдать взаимодействие малых молекул с природной водой растворимые белки такие человеческие моноклональные антитела CR80208 и подробного анализа процедуры уже сообщалось в предыдущие статьи9. Хотя была признана ключевая роль ионного канала белка для обнаружения новых терапевтических целей, ионного канала молекулы белка маленький взаимодействия assay основанный на BLI не были описаны.

Человека эфира меню go-go каналов (hEAG1), выраженные в различных типов раковых клеток и центральной нервной системы, что делает канал a потенциальных терапевтических цели многих раковых заболеваний и нейрональных расстройств10,11, 12,,1314. Электрофизиологическое исследование в нашей лаборатории подтвердил тормозящий эффект фосфатидилинозитол 4, 5-Бисфосфат (пункт2) на hEAG1 канал15. На основе наших результатов, тестирование PIP2 непосредственное взаимодействие с hEAG1 с помощью BLI техника может быть как модель для других типов ионного канала молекулы белка маленький составные взаимодействия специально для этих каналов не хватает конкретных лигандами. Согласно указаниям BLI пробирного, мы подготовили биотинилированным hEAG1 белков и иммобилизованные их на поверхности стрептавидина (SA) биосенсор советы следуют взаимодействия их пункта2 решения соблюдать их прямую привязку между белков и липидов. После вложения PIP2 hEAG1 белка с покрытием поверхности, толщина слоя на поверхности увеличивается, который напрямую коррелирует сдвиг спектральных и может быть измерена в режиме реального времени16. Кинетика привязки может быть определен из-за позитивный сдвиг в ассоциации шаг и отрицательный сдвиг в диссоциации шаг. Согласно этому принципу мы очищенный белок канала Ион функциональные hEAG1 ГЭС 239T выражение стабильной системы, используя метод очищения сродства для поддержания в vitro функционального состояния, а затем Измеренная кинетика привязки различные концентрации пункта2и принесли semblable кинетических данных, как отмечено в электрофизиологические измерения15. Тесная связь между результатами от BLI и электрофизиологические измерения в первый раз продемонстрировать пригодность BLI как соответствующий аналитический инструмент для ионного канала мембраны молекулы белка маленький взаимодействия.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание: Линия клетки ГЭС 293T, непрерывно выражая с тегами Флаг hEAG1 белок канала строится путем transfecting pCDH лентивирусные плазмида, содержащий последовательность ДНК hEAG1 с флагом в дистальной части C-terminus в клетки ГЭС 293T, за которым следует puromycin устойчивостью выбор как описано15.

1. близость Очистка флага тегами белка hEAG1 канал от ГЭС 293T клеток

  1. Оттепель клетки, стабильно выражая hEAG1 каналы из жидкого азота в теплую воду (37 ° C) быстро. Заполнить клетки (около 5 х 106 замороженные клетки) в 10 см блюдо. Расти ячейки на ночь в Дульбекко изменение орла (DMEM) средних дополнена 8 мл 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 100 единиц/мл пенициллин, 100 мкг/мл стрептомицина, 4 мм L-глютамина и изменил средней следующий день.
  2. Проверьте GFP флуоресценции этих ГЭС 293T клеток с помощью флуоресцентный Микроскоп, чтобы убедиться, что высокий процент клеток стабильно Экспресс hEAG1 каналов в системе культивирования. Trypsinize экспоненциально растущей клетки с 1 мл раствора трипсин 0.25% за 1 мин при комнатной температуре и thenadd 2 мл сыворотки содержащие жидкости культуры прекратить пищеварение. Передать 15 см блюдо, содержащих 15 мл полного среднего DMEM 400 мкл суспензии клеток. Подготовьте четыре блюда 15 см в общей сложности.
  3. Урожай этих клеток после 2-3 дней культуры когда клетки достигает около 90% confluency.
    1. Удалите средство роста из клеток и мыть их дважды с 4 мл фосфата буфер солевой (ПБС, pH = 7,4).
    2. Выбросите PBS после стирки.
    3. Скрип клетки в PBS 1 x 2 мл для каждого блюдо с использованием клеток лом и передачи царапины клетки с 1 мл Пипетка в 15 мл трубку.
    4. Центрифуга суспензию клеток для 5 мин при 420 x g при 4 ° C.
    5. Декантируют и удалить супернатант.
    6. Ресуспензируйте Пелле клетки в целом 4 мл буфера lysis (10 мм HEPES, 1,5 мм2MgCl 10 NaCl, 1% NP-40, pH 7.0, ингибитор протеазы содержится полный) для 30 минут на льду и вихрь тщательно lysate каждые 10 мин.
    7. Центрифуга для ячейки lysate 10 мин на 12000 x g при 4 ° C.
    8. Передача супернатант в 5 мл трубку и держать его на льду для немедленного использования.
  4. Подготовьте анти флаг м2 сродство смолы.
    1. Тщательно приостановите смолы (поставляется как подвеска 50% в магазине буфера), нежный инверсии, чтобы убедиться, что бутылка анти флаг м2 близость геля является единой подвеска гель бусинки.
    2. Немедленно перевести 400 мкл суспензии в охлажденной 1,5 мл.
    3. Центрифуга подвеска для 30 s 8, 000 x g при 4 ° C и удалить супернатант тщательно, чтобы промыть в магазине буфер.
    4. Добавьте 500 мкл ПБС смолы и приостановить лепешка с Пипетка 1 мл. Затем центрифуга подвеска для 30 s 8, 000 x g при 4 ° C и тщательно удалить супернатант PBS. Повторите эти мыть шаг, чтобы очистить сохраненные буфер.
  5. Добавьте 500 мкл белков экстракта супернатант подготовлен на шаге 1.3.8 смолы Пелле приостановить гранулы и передать новой охлажденной 5 мл трубки подвеска. Повторите этот шаг еще раз, чтобы убедиться, что не гель бусинки слева. Добавьте экстракт левой белка в смеси.
  6. Инкубируйте смесь на ночь на шейкер на 8 об/мин при 4 ° C для захвата флага синтез белка.
  7. Центрифуга смесь после инкубации 12 ч 10 мин на 1, 000 x g при 4 ° C.
  8. Отменить супернатант и помыть лепешка три раза с 500 мкл ПБС. Держите его на льду для немедленного использования.
  9. Элюирующий флаг hEAG1 белок с 3 x флаг пептид.
    1. Подготовка 3 X флаг Элюирующий раствор. Растворите 3 X флаг пептида в 500 мкл Стоковый раствор (0,5 М трис-HCl, 1 M NaCl, рН = 7,5) в концентрации 8 мкг/мкл.
    2. Добавьте 10 мкл 3 x флаг Элюирующий раствор 390 мкл PBS решением конечной концентрации 200 нг/мкл.
    3. Добавьте 400 мкл 3 x флаг Элюирующий раствор гель бусинки, подготовленный на этапе 1.8.
    4. Проинкубируйте образцы в шейкер на 8 об/мин на 2 ч при 4 ° C.
    5. Центрифуга смолы для 30 s на 8 000 x g.
    6. Супернатант передать свежие 1,5 мл и хранить его на 4 ° C для немедленного использования.

2. концентрация пробы и подтверждения очищается флаг Fusion hEAG1 комплект Assay протеина BCA и западный Blotting

  1. Определите концентрацию очищенный протеин с помощью комплекта пробирного белка BCA, согласно инструкции изготовителя.
  2. Для подтверждения, что протеин интереса были очищены используя антитело против флага как описано15используйте 30 мкл пример для западного анализа.

3. Маркировка очищенный канала белка с биотина для BLI Assay

  1. Подготовьте 5 мг/мл Стоковый раствор биотина в PBS. Для каждого теста (два биосенсоры) добавьте вывозимому Молярная избыток биотина 20 мкг очищенный белок для достижения предпочтительнее biotinylation N-терминальный очищенный белка в PBS.
  2. Проинкубируйте образцы в темноте на льду, по крайней мере 30 минут.
  3. Подготовить буфером для разбавления проб (SD) пример: PBS с 0,02% Полисорбат 20 и 0.1% бычьим сывороточным альбумином (БСА, рН 7,4).
  4. Выполните ультрафильтрации для изменения буфера белка очищенного канала SD буфер. Удаление несвязанных биотина, используя ультрафильтрации устройство с молекулярной массой отсечки 30 кДа, добавив SD буфера и центрифугирование образца в 12000 x g, 10 мин при 4 ° C.
  5. Удаление ультрафильтрацией из пластиковых пробирок ультрафильтрации устройство, добавить 200 мкл буфера SD в устройство фильтра и центрифугирование образца на 12000 x g, 10 мин при 4° C. Повторите эту операцию по крайней мере три раза.
  6. Для сбора в буфер обмена образца, вспять вставьте устройство фильтра в 1,5 мл трубки и центрифугирование их на 2000 x g, за 5 мин при 4 ° C. Держите образец на льду для немедленного использования.

4. Подготовка пункта2 решения для Assay

  1. Подготовьте Стоковый раствор пункта2 (1 мм) в дейонизированной H2O, sonicating за 30 минут на льду, как описано выше17. Сохранить решение в стеклянные флаконы по при-20 ° C и разбавить его окончательный концентрации непосредственно перед эксперименты с энергичной vortexing.

5. BLI Assay

  1. Включите оборудование и проверьте окна «статус документа» для подтверждения, что машина находится в состоянии «готово» для prewarm оборудование по крайней мере, за 30 мин до BLI исследования.
  2. Убедитесь, что дверь инструмента закрыт перед открытием программного обеспечения сбора данных и выберите «Новый эксперимент кинетика» в мастере эксперимент.
  3. Определите скважин для использования на пластину 96-луночных щелкните правой кнопкой мыши выбрать буфер, нагрузки и образца. Для образца скважин, единица концентрации биотинилированным флаг синтез белка hEAG1 следует ввод как моляра (10 мкг, 0.09 мкм).
  4. Определите шаги анализа, включая базовые, загрузки, ассоциации и диссоциации. Выберите шаг пробирного и дважды щелкните на соответствующем столбце. Копию определения пробирного устанавливается для датчиков контроля. Задайте скорость вращения 1000. Выбор 1 мин для базовых шага и 5 – 10 мин для загрузки, ассоциации и диссоциации, соответственно. Выполните тест при комнатной температуре (около 24 ° C).
    Примечание: Существует две основные процедуры: Загрузка биотинилированным канал белка для датчиков и assaying взаимодействия с маленькой молекулы соединений. Они могут быть продолженным непрерывно (базовый, загрузки, базовый, ассоциации и диссоциации). Кроме того они могут быть продолженным отдельно чтобы избежать напрасной траты испытаний соединений при первой загрузке часть неудачного.
  5. Выберите столбцы, которые содержат датчики и нажмите кнопку «Заливка», чтобы указать расположение датчиков на панели датчиков.
  6. Обзор всех запланированных шаги для проверки ошибок и вернуться к их исправить.
  7. Задание расположения файлов данных и нажмите кнопку «Go», чтобы начать анализ.
    Примечание: Датчики нужно prewetted по крайней мере 10 минут в буфере SD, если был сделан этот шаг, а затем параметр «Отложено начало эксперимента» должна быть пропущена. Если нет, то установить 600 s задержку перед prewetting датчиков.
  8. Положить черный 96-луночных пластину в нижней части лотка и вставьте А1 угол пластины в паз на лоток на место пластину. Для скважин для загрузки датчики 200 мкл аналитического буфера за хорошо добавить в 2 скважины в строке A и 2 скважины в строке B 96-луночных пластины.
  9. Подготовить еще один черный 96-луночных пластины как образец пластины и заполнить скважин с 200 мкл буфера SD в строке B как управления или биотинилированным hEAG1 белка раствора (10 мкг) в строке как назначена во время программирования на шаге 5.3.
    Примечание: Избегайте, представляя пузыри.
  10. Открыть дверь документа и вставьте датчик лоток и образца пластины в левой и правой плиты держатель, соответственно. Проверьте что пластину датчика лоток и образец расположены правильно основанные на форму слева пластины держателя и маркер «А1» в верхнем правом углу правой пластина держателя. Закройте дверь и начать пробу.

6. анализ данных

  1. Откройте программное обеспечение для анализа данных и загрузить в папку, содержащую данные анализа. Нажмите кнопку «Обработка», чтобы попасть в меню интерфейс обработки, и мы можем увидеть красочные сырой кинетических кривых.
  2. Согласно Step1: «Выбор данных», нажмите кнопку «Выбор датчика». На «датчик лоток #1», щелкните датчик скважин только увлажненный с SD буфера и щелкните правой кнопкой мыши «Изменить датчик тип» для «Ведения датчик». На ' карта пластины образца», назначить все скважины без конкретной привязки и щелкните правой кнопкой мыши «Хорошо тип изменения» до «Хорошо ссылки».
  3. Поставьте галочку в поле перед «Вычитание» шаг 2 и пункт «Двойная ссылка».
  4. Шаг3: «Выровнять оси Y», выберите «Базовый» в качестве шага выравнивания. Для «Интервал», введите последние 10 s этой базовой (т.е. от: 0.1 до: 59,8).
  5. Шаг4: «Интер шаг коррекции», выберите «Выровнять по базовой линии» для сведения к минимуму изменения сигнала между Ассоциацией и диссоциации шаги.
  6. Шаг5: «Процесс», выберите функции фильтрации Савицкий Голея в большинстве случаев и продолжить «Данные процесса».
  7. Сохраните исходные данные для дальнейшего анализа данных с помощью другого программного обеспечения в действии 7: «Сохранить результаты».
  8. Нажмите кнопку «анализ | Кривой».
    1. «Шаг для анализа», выберите «Ассоциация | Диссоциация». «Модель» выберите 1:1.
      Примечание: мы выбираем модель 1:1, потому что он хорошо на наших исходных данных и избежать возможности за установку под 1:2 или 2:1 модель из-за их высокой свободы. Но другие варианты доступны здесь и может быть надлежащим образом выбран для анализа других установку для различных привязки модели исследуемое вещество.
    2. Для «Установки», выберите Глобальная (полный). Для «Group By» выберите «Цвет». Выберите «Rmax несвязанный, датчик» для независимой установки максимальный сигнал ответа (Rmax).
    3. Нажмите кнопку «Fit Curves!» чтобы начать анализ нелинейной регрессии. В нашем исследовании использовались уравнения Хилл и одной экспоненциальной функции.
    4. Нажмите кнопку «Экспорт данных | Сохранить отчет» сохранить установку результаты. Или нажмите кнопку «Экспорт данных | Экспортировать результаты установки» для сохранения необработанные данные для дальнейшего анализа данных и с другим программным обеспечением.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы очищены флаг синтез белка hEAG1 канал от ГЭС 293T клетки стабильно гиперэкспрессия hEAG1. Функция этой синтез белка была продемонстрирована с помощью метода патча зажим и качество и специфику очищенный протеин подтверждаются Вестерн-блот (рис. 1). Очищенный канал белок является биотинилированным выполнять assay взаимодействия с липидами (пункт2) с использованием реального времени BLI assay. BLI привязки пробирного конфигурация показана на рисунке 2. Кривой типичные привязки между hEAG1 и ПУМ2 показан на рисунке 3. В этом случае 3 мкм PIP2 растворяется в PBS буфера (Настройки PIP2 показан дополнительный рисунок1), и сигнал анализируется с использованием протокола двойная ссылка вычитания для вычитания неспецифической привязки ( привязка между датчиком и ПУМ2), фон (взаимодействие между биотинилированным hEAG1 белка и PBS) и сигнал дрейфа (привязка между датчиком и PBS) вызванные датчик изменчивости. И привязки трассировки глобально подходят и показано наложение хорошо пригнанными (дополнительный рисунок 2). Кроме того мы измеряем кинетика привязки2 PIP канал очищенный hEAG1 комплекс инкубации белков в различных концентрациях, пункт2. После анализа мы получаем (dK) значение константы диссоциации 0,35 мкм ±0.04, который похож на полученное от электрофизиологические измерения15значение50 IC. Эти результаты показали, что BLI assay подходит для ионного канала мембранных белков и липидов взаимодействия анализа.

Figure 1
Рисунок 1: определение выражения, функции и специфичность белка рекомбинантных hEAG1 от ГЭС 293T клеток, GFP изображений, патч зажим и Западная помарка, соответственно. (A) стабильная выражение hEAG1 ГЭС 293T системы успешно устанавливается моноклональных puromycin устойчивостью выделения после трансфекции с hEAG1-pCDH Лентивирусы системы как подтверждается экспрессия гена GFP в почти всех клеток. (B) пульс протокол (вверху) и накладываются текущие следы от представителя поклеточного патч зажим записи из hEAG1 каналов в стабильной камере A. Текущий вызвал, расшатывания напряжения от напряжения Холдинг -80 мВ до 70 mV с шагом 10 mV следуют реполяризации в -80 МВ. Клетки инкубируют в обычный канал K+ , записывать решения, как было описано ранее15. Наружу-зависимых калиевых токов предполагают, что функциональные hEAG1 каналы очень выражены в HEK293T клетки. (C) Западная помарка hEAG1 канал белка из образцов очищенный протеин. Антитела против флага признает одного белка полоса ~ 110 кДа, демонстрируя полнометражного выражения канал помеченный флагом hEAG1. Этот Рисунок 1 c был изменен с Хань и др. 15. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Схематическая диаграмма, показывающая протокол assay привязки BLI. Четырех датчиков используются параллельно в биотинилированным канал белки или их растворяют буфера SD для загрузки канала белков и ссылки. После этого эти четыре датчики передаются пробирного этап для выявления ассоциации и дизассоциация с фосфолипидами или его раствор буфера. Позиции канала белки, фосфолипиды и буфера окрашены как указано. Горизонтальной красная пунктирная линия показывает два основных этапа исследования BLI: Загрузка фаза и фаза анализа взаимодействия. Этот Рисунок 2 был изменен с Хань и др. 15. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: снимки экрана показаны исходные данные и обработанные данные в типичном исследовании BLI. (A) типичная загрузка и уравновешивания кривые, характеризующие уравновешивания шаг (60 s) с SD-буфера (базовый уровень), шаг загрузки с hEAG1 белками (Загрузка) и кривая ссылка достижение равновесного уровня и загружен с hEAG1 белками (загрузки), одновременно измерение двух отдельных датчика советы. (B) Вертикальные красные линии показывают передачи датчиков из липидов решения для буферного раствора во время операции анализа. (C) оригинал оптических сигналов в ассоциации и диссоциации фазы после обработки двойная ссылка вычитания для вычитания сигналов без конкретной привязки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: Результаты от BLI пробирного показаны hEAG1 канал белка, непосредственно взаимодействующих с PIP2. (A) экран захвата указанием исходных данных связывания белков hEAG1 с PIP2 в манере концентрационная зависимость (0,03-3 мкм). Накопленная концентрация PIP2 обозначается как соответствующий биодатчики данных трассировки. (B) сырье обработки данных показаны изменения в интерференция в различных концентрациях2 PIP в представительные пробы. (C) кривая вписывается Хилл уравнения, полученные от пикового значения оптических помех сигнала измеряется в различных концентрациях2 ПУМ для определения констант равновесия диссоциации (dK) взаимодействия между hEAG1 канале белком и ПУМ2 (n = 3). От Han et al. изменили Рисунок 4B и 4 C 15. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительный рисунок 1: Конфигурация длинноцепочечных фосфатидилинозитол 4, 5-Бисфосфат (пункт2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот показатель.

Дополнительные рис: экран захвата установлены оверлей из BLI пробу на рисунке 3. Данные обрабатываются и установлены и только показаны стадии ассоциацию и диссоциации. Обработанные данные кривой синий и нелинейного монтажа кривая красный. Добра подходят: R2 = 0.984789 X2 = 0.019109. Параметр Максимальная привязки (Rmax) = 0.2875 Нм (± 0,0006). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот показатель.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Как основной терапевтических целей более чем на 13% в настоящее время известные препараты для лечения различных заболеваний человека, в том числе сердечно-сосудистой системы и неврологических расстройств18были проверены мембранных ионных каналов. Патч зажим записи, золотой стандарт для измерения функциональных ионных каналов с малых молекул, широко используется для ионного канала лигандов скрининга. Однако такие электрофизиологических подходы не могут продемонстрировать ли малые молекулы привязывается к каналу напрямую или не19, потому что малые молекулы могут действовать другие белки или межклеточных пути, которые взаимодействуют с каналом. По сравнению с широко используются радиоактивные лигандом привязки пробирного и другие часто используемые метки бесплатно биосенсор методы, BLI имеет значительные преимущества с точки зрения относительной простой механизм, неограниченный ассоциации фазы, высокая повсюду, пробирного дизайн ближе к в vivo системы и необходимости небольшое количество подвижности белков (несколько мкг) и он может обеспечить подробное понимание кинетических данных5,6,20.

Для того, чтобы максимально смоделировать ситуацию в естественных условиях , мы очищены функциональные hEAG1 канал белки от млекопитающих стабильно выражение системы. Простой и эффективный протокол для очищения и идентификации гиперэкспрессия ионного канала белка от адэрентных клеток млекопитающих представлен. Некоторые важные советы для успешной очистки мембранных белков являются: 1) процесс очистки может быть уменьшенным или увеличенных согласно выражение обилие протеинов интереса в системах млекопитающих выражения; 2) мы сплавили тег флаг на C конечной hEAG1 канала для облегчения очистки этого белка с бисером анти флаг сродство с использованием коммерческих комплект для очистки и протокола. Электрофизиологические измерения показали, что сплавливание флаг не оказывает влияния на функции этого канала15; 3) инкубации смесь анти флаг бусины и экстракт белка на ночь при 4° C с нежно тряска полезно для захвата флага синтез белка; 4) с использованием очищение сродства, мы можем получить достаточно hEAG1 ионный канал белка из четырех блюд 15 см выше 90% клеток confluency после анализа процесса.

Белки очищенные hEAG1 канала являются биотинилированным с использованием избыточного биотин (3-10 раз) и обмена решения буфер с SD буфер для дальнейшего анализа BLI. Избыток биотина максимально можно изменить мембранный белок канала для увеличения эффективности покрытием на поверхности биосенсор советы, и SD Пробирной буфер, содержащий низкие концентрации BSA и Полисорбат 20 можно свести к минимуму неспецифического связывания9. Несмотря на исходя этих ключевых операций, неидеальной взаимодействия по-прежнему может существовать особенно при выполнении привязки исследование с высокой концентрацией малые молекулы, которая может специально не привязан к поверхности SA датчики и результат ложно положительных взаимодействия как цианиновые кривой показано на рисунке 4A. Таким образом, протокол вычитание двойная ссылка все еще необходимо получить достоверные результаты путем вычитания неспецифической привязок, включая взаимодействие между датчиком и малые молекулы, биотинилированным hEAG1 белка с решением малые молекулы, и датчики с маленькой молекулы решения. Эта двойная ссылка операции вычитания потребностей четырех биосенсоров на этот раз assay. Два биодатчики будет покрытием с биотинилированным мембранных белков и разбирательства assay взаимодействия с малые молекулы и его буфер. Другие два датчика будет увлажненный с SD буфера и взаимодействующих с малые молекулы и его буфер. Только взаимодействие мембранных белков иммобилизованных биосенсор и малые молекулы показывает положительный сигнал и остальные три взаимодействия сигналы работы как элементы управления (рис. 2). С помощью этой процедуры, как показано на рис. 3 и рис. 4, наши результаты ясно продемонстрировать сильное взаимодействие между hEAG1 канал белков и ПУМ2 и Показать профиль концентрационная зависимость. Необходимо отметить, что существуют некоторые ограничения в нашем измерении. К примеру есть некоторые другие липиды мембран, которые можно привязать к очищенной канала белка. Кроме того, это еще не ясно что ли якорь очищенный протеин держать их оригинального конформации и деятельности. Это очень трудно измерить реальную конфигураций малых молекул липидов, когда они взаимодействуют с белками. Хотя подробные процессы неизвестны, наши исследования показывают, что кинетика привязки, BLI согласуется с теми получаемых электрофизиологических записи, который делает Роман BLI приложение для ионного канала молекулы белка маленький взаимодействия в Дополнительные манере.

В целом наше исследование подтверждает, что надежная стратегия очищая функциональные мембранный белок из млекопитающих выражение системы для обнаружения прямого взаимодействия с ее лигандами. Успешное применение BLI для мембранных белков малые молекулы взаимодействия облегчит малые молекулы отбора и механизм разведки в ионных каналов лекарственных препаратов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана центр био-ID и SJTU кросс-дисциплинарной Фонд исследований в области медицины и техники (YG2016QN66), Национальный фонд естественных наук Китая (31271217) и национальных базовых исследований программа Китая (2014CB910304).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/High Glucose Medium HyClone SH30243.01
Phosphate Buffered Saline (1x) HyClone SH30256.01
Fetal Bovine Serum Gibco 10270
Penicillin/Streptomycin Gibco 1697550
Cell Culture Dish Corning 430599 150 mm X 25 mm
Nonidet P-40 Substitute Amresco E109
Sodium chloride BBI Life Sciences A610476
Potassium chloride BBI Life Sciences A610440
Bovine Serum Albumin BBI Life Sciences A600332
Polyoxyethylene-20-Sorbitan Monolaurate BBI Life Sciences A600560
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel Sigma A2220
3x FLAG peptide Sigma F4799
Octet-RED96 Pall/FortéBio 30-5048
Data Acquisition software Pall/FortéBio Version 7.1
Data Analysis software Pall/FortéBio Version 7.1
Biosensor/Streptavidin Pall/FortéBio 18-5019
Microtiter plate Greiner Bio-one 655209
Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin ThermoFisher 21338
Centrifugal Machine ThermoFisher 75004250
PageRuler Prestained Protein Ladder ThermoScientific 318120
Ultrafiltration device MILLIPORE UFC503008 NMWL of 30 kDa
phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) Sigma P9763
Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody Sigma F1804 1:2000 dilution
goat anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody Santa Cruz Biotechnology sc-2005 1:5000 dilution
Enhanced BCA Protein Assay Kit Beyotime P0010
Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche 04693159001
Amersham Imager 600 Imaging System GE Healthcare Bio-Sciences
Western blot system BIO-RAD

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. Biophysical Interactions with Model Lipid Membranes: Applications in Drug Discovery and Drug Delivery. Mol. Pharm. 6 (5), 1264-1276 (2009).
  2. van de Waterbeemd, H., Smith, D. A., Beaumont, K., Walker, D. K. Property-based design: Optimization of drug absorption and pharmacokinetics. J. Med. Chem. 44 (9), 1313-1333 (2001).
  3. Papo, N., Shai, Y. Exploring peptide membrane interaction using surface plasmon resonance: Differentiation between pore formation versus membrane disruption by lytic peptides. Biochemistry. 42 (2), 458-466 (2003).
  4. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nat. Commun. 1, 100-106 (2010).
  5. Fechner, P., et al. Size does matter! Label-free detection of small molecule-protein interaction. Anal. Bioanal. Chem. 406 (17), 4033-4051 (2014).
  6. Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of Bio-Layer Interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. J. Pharm. Biomed. Anal. 72, 150-154 (2013).
  7. Wartchow, C. A., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. J. Comput. Aided Mol. Des. 25 (7), 669-676 (2011).
  8. Ekiert, D. C., et al. A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses. Science. 333 (6044), 843-850 (2011).
  9. Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects. J. Vis. Exp. (84), e51383 (2014).
  10. Occhiodoro, T., et al. Cloning of a human ether-a-go-go potassium channel expressed in myoblasts at the onset of fusion. Febs Lett. 434 (1-2), 177-182 (1988).
  11. Pardo, L. A., Stuhmer, W. Eag1: An emerging oncological target. Cancer. Res. 68 (6), 1611-1613 (2008).
  12. Simons, C., et al. Mutations in the voltage-gated potassium channel gene KCNH1 cause Temple-Baraitser syndrome and epilepsy. Nat. Genet. 47 (1), 73-77 (2015).
  13. Kortum, F., et al. Mutations in KCNH1 and ATP6V1B2 cause Zimmermann-Laband syndrome. Nat. Genet. 47 (6), 661-667 (2015).
  14. Han, B., Tokay, T., Zhang, G. M., Sun, P., Hou, S. Eag1 K+ Channel: Endogenous Regulation and Functions in Nervous System. Oxid. Med. Cell. Longev. 2017, (2017).
  15. Han, B., et al. Human EAG channels are directly modulated by PIP2 as revealed by electrophysiological and optical interference investigations. Sci. Rep. 6, (2016).
  16. Do, T., et al. A rapid method for determining dynamic binding capacity of resins for the purification of proteins. PREP. 60 (2), 147-150 (2008).
  17. Rohacs, T., Chen, J., Prestwich, G. D., Logothetis, D. E. Distinct specificities of inwardly rectifying K+ channels for phosphoinositides. J. Biol. Chem. 274 (51), 36065-36072 (1999).
  18. Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there? Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).
  19. Suh, B. C., Hille, B. PIP2 is a necessary cofactor for ion channel function: How and why? Annu. Rev. Biophys. 37, 175-195 (2008).
  20. Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms. J. Vis. Exp. (122), e55659 (2017).

Tags

Биохимия выпуск 133 био-слоя интерферометрии (BLI) ионного канала белка малые молекулы очищение сродства белка млекопитающих стабильной выражение системы человеческого EAG1 (hEAG1) канал лекарственных препаратов терапевтических целей лигандом скрининг
Захват кинетика взаимодействия ионного канала белка с малых молекул в Assay интерферометрии био слоя
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Han, B., Zhang, M., Sun, P., Hou, S. … More

Han, B., Zhang, M., Sun, P., Hou, S. Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay. J. Vis. Exp. (133), e56846, doi:10.3791/56846 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter