Summary
Hier das Protokoll beschreibt die Wechselwirkungen von gereinigten hEAG1 Ionen-Kanal-Protein mit niedermolekularer Lipid Liganden Phosphatidylinositol 4, 5-Bisphosphate (PIP-2). Die Messung zeigt, dass BLI eine mögliche Methode für neue kleine Molekül-Ion Channel Liganden Screening werden könnte.
Abstract
Die Bio-Layer-Interferometrie (BLI)-Assay ist ein wertvolles Instrument zur Messung von Protein-Protein und Protein-kleine Molekül Interaktionen. Hier beschreiben wir zunächst die Anwendung dieser neuartigen markierungsfreie Technik auf der Wechselwirkung des menschlichen EAG1 Kanalproteine (hEAG1) mit dem kleinen Molekül-PIP-2. hEAG1 Kanal ist wegen seiner abweichenden Überexpression in Krebs und ein paar Gain-of-Function-Mutationen in einigen Arten von neurologischen Erkrankungen beteiligt als mögliche therapeutische Ziel anerkannt. Wir hEAG1 Kanal-Proteine von einem Säugetier stabile Expressionssystem gereinigt und die Interaktion mit PIP2 von BLI gemessen. Die erfolgreiche Messung der Kinetik der Bindung zwischen hEAG1 Protein und PIP2 zeigt, dass die BLI-Assay eine potenzielle Hochdurchsatz-Ansatz für neuartige Small-Molecule-Liganden Screening in der Ionen-Kanal Pharmakologie ist.
Introduction
Ausrichtung der Zelle Oberfläche zugänglich Ion Kanalproteinen mit kleinen Molekülen, bietet ein enormes Potenzial für die Liganden Screening und biologische Drug Discovery1,2,3. Somit ist ein geeignetes Instrument für die Untersuchung der Interaktion zwischen Ionenkanal und kleine Moleküle und ihre entsprechende Funktion erforderlich. Die Patch-Clamp-Aufnahme wurde zu einer einzigartigen und unersetzlichen Technik in Ionen-Kanal funktionelle Assay nachgewiesen. Feststellung, ob die kleinen Moleküle direkt Ionenkanäle Ziel erfordern jedoch andere Technologien. Traditionell wurde radioaktives Ligand-Bindung-Assay verwendet, die Kinetik der Bindung zwischen niedermolekularer und seine Zielprotein Ionen-Kanal zu beobachten. Allerdings beschränkt sich die Nutzung dieser Technik wegen seiner Anforderung in radioaktiven Markierung und Erkennung. Darüber hinaus verhindert, dass der erforderliche Schritt, den kleinen Liganden in der Studie zu kennzeichnen seine Verwendung in vielen Arten von Ionenkanälen ohne bekannte spezifische Liganden. Einige markierungsfreie Techniken wie NMR-Spektroskopie, x-ray Diffraction, Microscale Thermophorese (MST)4 und Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) wurden verwendet, um die Protein-kleine Molekül-Interaktionen zu messen. Aber diese Art von Tests in der Regel können nicht wegen der Schwierigkeit, in voller Länge Protein, niedrige Auflösung von Dynamik, niedriger Durchsatz und hohe Kosten5zu erhalten ausreichenden Informationen zur Verfügung stellen. Im Gegensatz zu diesen Techniken taucht Bio-Schicht Interferometrie (BLI) als eine neuartige markierungsfreie Methodik zur Überwindung dieser Nachteile zum Nachweis von Protein-kleine Molekül Interaktionen durch eine winzige Mengen des Proteins Probe auf den Oberflächen der Immobilisierung Biosensor und Messung der optischen Veränderung signalisiert6,7. Als eine vielversprechende Biosensor-Plattform BLI Technik wird bereits durchgeführt, um die Interaktion von kleinen Molekülen mit natürlichem Wasser lösliche Proteine wie ein menschlicher monoklonaler Antikörper CR80208 beobachten und die detaillierte Testverfahren ist berichtet worden, einem vorherige Artikel9. Obwohl die Schlüsselrolle der Ionen-Kanal-Protein für neue therapeutische Targets Entdeckung erkannt wurde, wurde die Ionen-Kanal Protein-kleine Molekül Interaktion Assay anhand BLI nicht beschrieben.
Der Mensch Äther À Gogo- Kanäle (hEAG1) werden in verschiedene Arten von Krebszellen und zentrale Nervensystem, wodurch der Kanal A möglichen therapeutischen Angriffspunkt vieler Krebsarten und neuronalen Erkrankungen10,11, ausgedrückt 12,13,14. Die elektrophysiologische Untersuchung in unserem Labor hat die inhibitorische Wirkung von Phosphatidylinositol 4, 5-Bisphosphate (PIP2) am hEAG1-Kanal15bestätigt. Anhand unserer Ergebnisse, PIP2 Tests, direkt als Modell für andere Arten von Ionen-Kanal Protein-kleine Molekül zusammengesetzte Interaktion vor allem für diese Kanäle fehlen spezifische Liganden Interaktion mit den hEAG1 mit BLI Technik sein kann. Entsprechend den Anweisungen des BLI Assays, wir vorbereitet biotinylierte hEAG1 Proteine und immobilisiert ihnen auf der Oberfläche des Streptavidin (SA) Biosensor Tipps gefolgt von Interaktion sie PIP2 Lösungen zu beobachten, deren direkte Bindung zwischen den Protein und die Lipid. Nach die Befestigung des PIP2 an die hEAG1 Protein beschichtete Oberfläche, die Dicke der Schicht auf der Oberfläche erhöht, die direkt korreliert die spektrale Verschiebung und können in Echtzeit-16gemessen werden. Die verbindliche Kinetik kann durch eine positive Wende im Verein Schritt und eine negative Verschiebung der Dissoziation Schritt ermittelt werden. Nach diesem Prinzip wir gereinigt die funktionale hEAG1 Ionen-Kanal-Protein von HEK-239T stabile Expressionssystem mit Affinität Reinigung Methode, die in-vitro- funktionellen Zustand beizubehalten, dann gemessen die Kinetik der Bindung von unterschiedlicher Konzentration2PIP und ergab eine semblable kinetischen Daten wie Elektrophysiologische Messungen15beobachtet. Die enge Korrespondenz zwischen den Ergebnissen aus den BLI und Elektrophysiologische Messungen zeigen zum ersten Mal die Eignung von BLI als geeignete analytisches Werkzeug für Ionen-Kanal Membran-Protein-kleine Molekül Interaktion.
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Protocol
Hinweis: Die HEK-293T-Zell-Linie kontinuierlich auszudrücken Flagge markiert hEAG1 Kanal-Protein wird erstellt, indem die transfecting ein pCDH Lentivirale Plasmid enthält die DNA-Sequenz des hEAG1 mit einer Flagge am distalen C-Terminus in HEK-293T Zellen, gefolgt von der Puromycin-beständige Auswahl beschrieben wie bisher15.
(1) Affinitätsreinigung der Flagge markiert hEAG1 Kanal-Protein von HEK-293T Zellen
- Tauen Sie Zellen, die stabil mit dem Ausdruck hEAG1 Kanäle von flüssigem Stickstoff in das warme Wasser (37 ° C) schnell auf. Samen der Zellen (etwa 5 x 106 gefrorene Zellen) in einer 10 cm Petrischale. Wachsen die Zelle über Nacht in Dulbeccos geändert Eagle (DMEM) Medium mit 8 mL 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 100 Einheiten/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin, 4 mM L-Glutamin ergänzt und verändert das Medium am nächsten Tag.
- Überprüfen Sie die GFP Fluoreszenz dieser HEK-293T Zellen mit dem Fluoreszenz-Mikroskop um sicherzustellen, dass der hohe Anteil an Zellen stabil express hEAG1 Kanäle in der Kultivierung System. Trypsinize exponentiell wachsenden Zellen mit 1 mL Trypsin 0,25 % für 1 min bei Raumtemperatur und Thenadd 2 mL Serum-haltigen Kultur Flüssigkeit, die Verdauung zu kündigen. Übertragen Sie 400 μl Zellsuspension auf eine 15 cm Schale mit 15 mL des kompletten DMEM Medium. Bereiten Sie vier 15 cm Gerichte insgesamt.
-
Diese Zellen zu ernten, nach 2 – 3 Tage Kultur, wenn die Zellen bei etwa 90 % erreichen Konfluenz.
- Das Wachstumsmedium aus den Zellen zu entfernen und waschen Sie sie zweimal mit 4 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (1 X PBS, pH = 7,4).
- Verwerfen Sie PBS, nach dem Waschen.
- Kratzen Sie die Zellen in 2 mL 1 X PBS für jedes Gericht mit Zelle kratzen und Transfer geschabten Zellen mit 1 mL in einem 15 mL-Tube.
- Zentrifugieren der Zellsuspension für 5 min bei 420 X g bei 4 ° C.
- Dekantieren und den Überstand verwerfen.
- Aufschwemmen der Zelle Pellet in insgesamt 4 mL Lyse-Puffer (10 mM HEPES, 1,5 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 1 % NP-40, pH 7.0 enthalten komplette Protease-Hemmer) für 30 min auf Eis und Vortex gründlich die lysate alle 10 Minuten.
- Zentrifugieren der Zelle lysate für 10 min bei 12.000 x g bei 4 ° C.
- Übertragen Sie den Überstand auf eine 5 mL-Tube und halten sie auf dem Eis für den sofortigen Einsatz.
-
Bereiten Sie das Anti-FLAG M2 Affinität Harz.
- Gründlich aussetzen des Harzes (im Lieferumfang enthalten 50 % Suspension in Speicher-Puffer) durch sanfte Umkehrung um sicherzustellen, dass die Flasche von Anti-FLAG M2 Affinität Gel ist eine homogene Suspension Gel Perlen.
- Sofortüberweisung 400 μl der Aussetzung zu einem gekühlten 1,5 mL-Tube.
- Die Aufhängung für 30 s bei 8, 000 X g bei 4 ° C zentrifugiert und den Überstand vorsichtig zum Auswaschen des Speicher-Puffers entsorgen.
- Das Harz 500 μl 1 X PBS hinzu und unterbrechen Sie das Pellet mit 1 mL-Pipette. Zentrifugieren Sie die Suspension für 30 s bei 8, 000 X g bei 4 ° C und entsorgen Sie der Überstand PBS sorgfältig zu. Wiederholen Sie diese Waschschritt gespeicherte Puffer löschen.
- Fügen Sie 500 μl Protein Extrakt überstand am Schritt 1.3.8 zum Harz Pellet Pellet auszusetzen und übertragen die Aussetzung zu einem neuen gekühlten 5 mL Schlauch. Wiederholen Sie diesen Schritt erneut, um sicherzustellen, dass keine Gel Perlen links. Die Mischung der linken Proteinextrakt hinzufügen.
- Inkubieren Sie die Mischung über Nacht auf einem Boston-Shaker mit 8 u/min bei 4 ° C, die Flagge Schmelzverfahren Protein zu erfassen.
- Zentrifugieren Sie die Mischung nach 12 h Inkubation für 10 min bei 1, 000 X g bei 4 ° C.
- Den Überstand verwerfen und das Pellet dreimal mit 500 μl 1 X PBS waschen. Halten Sie es auf dem Eis für den sofortigen Einsatz.
-
Elution der Flagge hEAG1 Protein mit 3 x Flagge Peptid.
- 3 X Fahne Elution Lösung ansetzen. 3 X Fahne Peptid in 500 μl Stammlösung auflösen (0,5 M Tris-HCl, 1 M NaCl, pH = 7.5) in einer Konzentration von 8 μg/μL.
- 390 μl PBS als 200 ng/μl Endkonzentration Lösung fügen Sie 10 μL 3 x Flagge Elution Lösung hinzu.
- Die Gel-Perlen im Schritt 1,8 vorbereitet fügen Sie 400 μl 3 X Flagge Elution Lösung hinzu.
- Inkubieren Sie die Probe in den Shaker mit 8 u/min für 2 h bei 4 ° c
- Zentrifugieren Sie das Harz für 30 s bei 8, 000 X g.
- Den Überstand auf eine frische 1,5 mL-Tube übertragen und bei 4 ° C für den sofortigen Gebrauch zu speichern.
2. Konzentration Assay und Bestätigung der gereinigte Fahne Fusion hEAG1 von BCA Protein Assay Kit und Western Blotting
- Bestimmen Sie die Konzentration des gereinigten Proteins mit dem BCA Protein Assay Kit nach Anweisung des Herstellers.
- Verwenden Sie 30 μl Probe zur westlichen Analyse um zu bestätigen, dass das Interesse Protein mithilfe eines Antikörpers Anti-FLAG als zuvor beschriebenen15gereinigt hatte.
3. Kennzeichnung der gereinigten Kanal-Protein mit Biotin für die BLI-Assay
- Bereiten Sie 5 mg/mL Biotin-Stammlösung mit PBS-Puffer. Für jeden Test (zwei Biosensoren) hinzufügen einer 3-fold Molaren Überschuss an Biotin 20 μg gereinigtes Protein, ein bevorzugt N-terminalen Biotinylierungen des gereinigten Proteins in PBS zu erreichen.
- Inkubation der Probe in der Dunkelheit für mindestens 30 min auf Eis.
- Vorbereitung der Proben-Verdünnungspuffer (SD): PBS mit 0,02 % Polysorbat 20 und 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA, pH 7.4).
- Führen Sie durch Ultrafiltration um den Puffer des gereinigten Kanal Proteins in SD Puffer zu ändern. Entfernen Sie die ungebundene Biotin durch Ultrafiltration Gerät mit Molekulargewicht Cutoff von 30 kDa verwenden, Hinzufügen von der SD-Puffer und Zentrifugieren der Probe bei 12.000 x g für 10 min bei 4 ° C.
- Die Ultrafiltrate von Zentrifugenröhrchen Ultrafiltration Gerät entfernen 200 μL SD Puffer in das Filter-Gerät hinzufügen und Zentrifugieren der Probe bei 12.000 x g für 10 min bei 4° C. Wiederholen Sie diesen Vorgang mindestens dreimal.
- Um den Puffer ausgetauscht zu sammeln Beispiel umgekehrt einfügen die Filtereinrichtung eine 1,5 mL-Tube und Zentrifugieren sie 2.000 x g, für 5 min bei 4 ° c Halten Sie die Probe auf dem Eis für den sofortigen Einsatz.
4. Vorbereitung der PIP2 Lösung für Assay
- Bereiten Sie Vorratslösung PIP2 (1 mM) in entionisiertem H2O, indem für 30 min auf Eis als zuvor beschriebenen17beschallen. Speichern Sie die Lösung in Glasfläschchen bei-20 ° C und verdünnen Sie es an die Endkonzentrationen unmittelbar vor Experimenten durch kräftig aufschütteln.
(5) BLI Assay
- Schliessen Sie das Gerät und überprüfen Sie das Fenster "Gerätestatus" um zu bestätigen, dass die Maschine auf "bereit" Zustand, das Gerät mindestens 30 Minuten vor der BLI-Studie prewarm ist.
- Stellen Sie sicher, dass die Tür des Gerätes geschlossen ist, bevor Sie die Datenerfassung Software öffnen und wählen Sie "Neue Kinetik Experiment" im Eingabeassistenten.
- Definieren Sie die Brunnen durch Rechtsklick auf die 96-Well-Platte verwendet werden, um Puffer, Last und Probe zu wählen. Für Probe-Brunnen, sollte die Einheit der Konzentration der biotinylierte Flagge Fusionsproteins hEAG1 eingegeben werden, als Molar (10 μg, 0,09 μm).
- Definieren der Assay-Schritte einschließlich der Grundlinie, Verladung, Assoziation und Dissoziation. Wählen Sie einen Assay Schritt und klicken Sie doppelt auf die entsprechende Spalte. Ein Duplikat der Assay-Definition ist für Sensoren festgelegt. Die u/min als 1.000 festgelegt. Wählen Sie 1 min für Grundlinie Schritt und 5 – 10 min laden, Assoziation und Dissoziation, beziehungsweise. Führen Sie den Test bei Raumtemperatur (ca. 24 ° C).
Hinweis: Es gibt zwei Hauptanwendungen: be-biotinylierte Kanal-Protein an den Sensoren und die Interaktion mit niedermolekularer Verbindungen prüfen. Sie können kontinuierlich fort (Grundlinie, laden, Grundlinie, Assoziation und Dissoziation). Alternativ können sie zur Vermeidung von Verschwendung Testverbindungen, wenn das erste Laden Teil erfolglos getrennt vorgegangen werden. - Klicken Sie auf die Spalten enthalten die Sensoren und klicken Sie auf die "Füllung" um die Positionen der Sensoren in der Sensor-Leiste anzuzeigen.
- Überprüfen Sie alle geplanten Schritte aus, um auf Fehler zu überprüfen und wieder um zu korrigieren.
- Legen Sie den Speicherort der Datendateien und klicken Sie auf "Go", um den Test zu starten.
Hinweis: Die Sensoren müssen prewetted für mindestens 10 min in SD Puffer, wenn dieser Schritt getan hat, dann die "Startverzögerung Experiment" Einstellung übersprungen werden sollen. Wenn dies nicht der Fall ist, stellen eine 600 s Verzögerung vor Vorbefeuchten der Sensoren. - Legen Sie eine schwarze 96-Well-Platte in den Boden der Schale und legen Sie die A1-Ecke der Platte in die Kerbe auf dem Tablett, die Platte zu setzen. Für die Brunnen, die Sensoren zu laden fügen Sie 200 μL der Testpuffer pro Bohrloch in 2 Brunnen in Reihe A und 2 Brunnen in Zeile B der 96-Well-Platte.
- Bereiten Sie einer anderen schwarz 96-Well-Platte als Probenteller vor und füllen Sie die Brunnen mit 200 μL SD Puffer in Reihe B als Kontrolle oder biotinylierte hEAG1 Proteinlösung (10 μg) in Zeile A wie bei der Programmierung im Schritt 5.3 zugewiesen.
Hinweis: Vermeiden Sie Luftblasen einzuführen. - Öffnen Sie die Tür des Gerätes und setzen Sie die Sensor-Schale und probieren Sie Platte in der linken und rechten Kennzeichenhalter bzw.. Prüfen Sie, ob die Sensorplatte Tablett und Probe liegen korrekt anhand der Form des linken Kennzeichenhalter und der "A1"-Marker auf der oberen rechten Ecke des rechten Kennzeichenhalter. Schließen Sie die Tür und starten Sie den Test zu.
(6) Datenanalyse
- Die Datenanalyse-Software öffnen und den Ordner mit den Test-Daten zu laden. Klicken Sie auf "Verarbeitung" um in der Verarbeitung-Menü-Oberfläche zu bekommen und wir sehen die bunten rohe kinetischen Kurven.
- Unter Schritt 1: "Die Datenauswahl", klicken Sie auf "Sensor-Auswahl". Auf "Sensor Schacht #1", klicken Sie auf die Sensor-Brunnen, nur mit SD-Puffer benetzt und Rechtsklick auf "Change Sensor Type" auf "Referenz-Sensor". Auf der "Platte Beispielkarte", die alle unspezifischen Bindung Brunnen zu benennen und einen Rechtsklick auf "Gut Typ ändern", "Referenz gut".
- Kreuzen Sie das Kästchen vor "Subtraktion" von Schritt2 und zeigen Sie "Doppelte Referenz".
- In Schritt 3: "Y-Achse ausrichten", "Baseline" als die Achse Schritt auswählen. "Zeitbereich", geben Sie in den letzten 10 s die Baseline (d. h. aus: 0,1 bis: 59,8).
- In Schritt 4: "Inter Schritt Korrektur", wählen Sie "ausrichten an Grundlinie" Signal Verschiebungen zwischen den Schritten Assoziation und Dissoziation zu minimieren.
- In Schritt 5: "Prozess", Savitzky-Golay Filter Funktion in den meisten Fällen auswählen und fortfahren "Prozessdaten".
- Raw-Daten für weitere Datenanalyse mit einer anderen Software in Step 7 zu retten: "Ergebnisse speichern".
-
Klicken Sie auf "Analyse | Kurvenanpassung".
- Wählen Sie für "Schritt zu analysieren", "Verein | Dissoziation". Wählen Sie für "Model" 1:1.
Hinweis: Wir wählen 1:1-Modell, weil es gut auf unseren ursprünglichen Daten passte und die Möglichkeit, über Fitting unter verhindert 1:2 oder 2:1-Modell aufgrund ihrer hohen Freiheit. Aber andere Optionen stehen hier zur Verfügung und können für andere passende Analyse für verschiedene Bindungsmodelle des Analyten entsprechend gewählt werden. - Wählen Sie für die "Montage" Global (voll). Wählen Sie für "Group By" "Farbe". Wählen Sie "Rmax unverknüpfte durch Sensor" unabhängige Montage der maximalen Signalantwort (Rmax) zu ermöglichen.
- Klicken Sie auf "Fit Kurven!" um die nicht-lineare Regressionsanalyse zu starten. In unserer Studie wurden Hill-Gleichung und einzelne exponential-Funktion verwendet.
- Klicken Sie auf "Daten exportieren | Bericht speichern"um passende Ergebnisse zu speichern. Oder klicken Sie auf "Daten exportieren | Passende Ergebnisse exportieren", die unformatierten Daten für weitere grafische Darstellung und Analyse der Daten mit anderer Software zu speichern.
- Wählen Sie für "Schritt zu analysieren", "Verein | Dissoziation". Wählen Sie für "Model" 1:1.
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Representative Results
Wir reinigen das FLAG hEAG1 Kanal Fusionsproteins von HEK-293T Zellen stabil überexprimieren hEAG1. Die Funktion dieses Schmelzverfahren Protein nachgewiesen mithilfe der Patch-Clamp-Methode und die Qualität und Besonderheit des gereinigten Protein von Western-Blot (Abbildung 1) bestätigt werden. Die gereinigten Kanal-Protein ist biotinylierte einen Interaktion Assay mit Lipiden (PIP2) ausführen mithilfe von Echtzeit-BLI-Assay. Die Bindungskonfiguration Assay BLI ist in Abbildung 2dargestellt. Eine typische Bindung Kurve zwischen hEAG1 und PIP2 ist in Abbildung 3dargestellt. In diesem Fall 3 μM PIP2 in PBS-Puffer ( ergänzende Abbildung1zeigt die Konfiguration der EVP2 ) gelöst, und das Signal wird analysiert mit einem doppelten Referenz Subtraktion Protokoll der unspezifischen Bindung (die subtrahieren Bindung zwischen Sensor und PIP-2), Hintergrund (die Interaktion zwischen biotinylierte hEAG1 Protein und PBS) und Drift (die Bindung zwischen Sensor und PBS) verursacht durch Sensor Variabilität zu signalisieren. Und die Bindung-Ablaufverfolgung ist Global passen und eine gut sitzende Overlay (ergänzende Abbildung2) gezeigt. Außerdem messen wir die Kinetik der Bindung von PIP2 auf den gereinigten hEAG1 Kanal komplexe durch Inkubation der Proteine in unterschiedlichen Konzentrationen von PIP2. Nach der Analyse erhalten wir einen Dissoziation konstanten (Kd) Wert von 0,35 ±0.04 μM, ähnlich der IC50 Wert aus der elektrophysiologischen Messungen15. Diese Ergebnisse zeigten, dass die BLI-Assay für Ionen-Kanal Membran Proteine und Lipide Interaktionsanalyse geeignet ist.
Abbildung 1: Identifikation des Ausdrucks, Funktion und Besonderheit des rekombinanten hEAG1 Protein von HEK-293T Zellen durch GLP-Bildgebung, patch-Clamp und western-Blot, bzw.. (A) das stabile Expression hEAG1 HEK-293T System ist erfolgreich von monoklonalen Puromycin-beständige Auswahl nach Transfektion mit hEAG1-pCDH Lentivirus System etabliert, wie GFP Ausdruck in fast allen Zellen belegt. (B) Puls Protokoll (oben) und aktuellen Spuren von einer repräsentativen ganze Zelle Patch-Clamp Aufnahme vom hEAG1 Kanäle in einer stabilen Zelle in A. überlagert Der Strom wird hervorgerufen durch depolarisierende Spannungen aus der Betriebs-Spannung von-80 mV bis 70 mV mit dem Schritt von 10 mV gefolgt von Repolarisation bis-80 mV. Die Zellen sind in der normalen K+ -Kanal Aufnahme Lösungen wie zuvor beschrieben15inkubiert. Die äußere spannungsabhängige Kalium Ströme legen nahe, dass funktionelle hEAG1 Kanäle hoch in HEK293T Zellen exprimiert werden. (C) Western-Blot der hEAG1-Kanal-Protein aus gereinigtes Proteinproben. Der Anti-FLAG Antikörper erkennt eine einziges Protein-Band von ~ 110 kDa, demonstriert eine in voller Länge der Flagge markiert hEAG1 Kanal Ausdruck. Diese Abbildung 1 wurde von Han Et Al. modifiziert 15. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: ein schematisches Diagramm zeigt das BLI Bindung Assay Protokoll. Vier Sensoren werden parallel in biotinylierte Kanalproteinen oder ihre gelösten SD-Puffer verwendet, laden die Kanalproteine und die Referenzen. Danach werden diese vier Sensoren übertragen, um Phase zu erkennen, Assoziation und Dissoziation mit Phospholipiden oder seine Lösung Puffer assay. Die Positionen von Kanalproteinen, Phospholipide und Puffer sind farbig, wie angegeben. Die horizontale rote gepunktete Linie zeigt die zwei wichtigsten Schritte der BLI-Studie: Laden und Interaktion Test Phase. Diese Abbildung 2 wurde von Han Et Al. modifiziert 15. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Screenshots zeigen die Rohdaten und verarbeiteten Daten in einer typischen BLI-Studie. (A) typische be- und Gleichgewichtherstellung Kurven zeigen die Gleichgewichtherstellung Schritt (60 s) mit SD-Puffer (Baseline), die Belastung Schritt mit hEAG1 Proteinen (Laden) und der Referenzkurve equilibriert und geladen mit hEAG1 Proteinen (Laden), gleichzeitige Messung von zwei einzelnen Sensor-Tipps. (B) die vertikale rote Linien zeigen die Übertragung von Sensoren von der Lipid-Lösung auf der Pufferlösung im Test-Betrieb. (C) das Original optische Signale an Assoziation und Dissoziation Phasen nach der Verarbeitung der doppelte Referenz Subtraktion der unspezifischen Bindung Signale zu subtrahieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Ergibt sich aus BLI-Test zeigt hEAG1 Kanal-Protein, die direkte Interaktion mit PIP2. (A) Bildschirmaufnahme zeigt die Rohdaten der hEAG1 Proteinbindung mit PIP2 bei Konzentration Abhängigkeit Manner (0,03 – 3 μM). Die gesammelten Konzentrationen von PIP2 bezeichnet, entsprechend der Biosensoren Datenspuren. (B) der Rohdatenverarbeitung mit den Änderungen im optischen Störungen in unterschiedlichen Konzentrationen von PIP2 in einer repräsentativen Probe. (C) Kurve passen mit Hill-Gleichung aus der Spitzenwert des optischen Interferenzen Signals gemessen an verschiedenen PIP2 Konzentrationen zur Bestimmung der Dissoziation konstanten Gleichgewicht (Kd) der Interaktion gewonnen zwischen den hEAG1-Kanal-Protein und PIP2 (n = 3). Abbildung 4 b und 4 C wurden von Han Et Al. modifiziert 15. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Ergänzende Abbildung1: die Konfiguration von langkettigen Phosphatidylinositol 4, 5-Bisphosphate (PIP-2). Klicken Sie bitte hier, um diese Zahl zu downloaden.
Ergänzende Abbildung2: Screenshot des montierten Overlays aus BLI-Assay von Abbildung 3. Die Daten verarbeitet und montiert und nur angezeigt, Assoziation und Dissoziation Phasen. Die verarbeiteten Daten-Kurve ist blau und die nichtlineare passende Kurve ist rot. Bestimmtheitsmaß: R2 = 0.984789, X2 = 0.019109. Die maximale bindenden Parameter (Rmax) = 0.2875 nm (± 0,0006). Klicken Sie bitte hier, um diese Zahl zu downloaden.
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Discussion
Membran-Ionenkanäle sind als die primäre therapeutische Ziele von über 13 % der derzeit bekannten Medikamente zur Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten, einschließlich Herz-Kreislauf- und neurologischen Störungen18überprüft worden. Patch-Clamp-Aufnahme, der goldene Standard zur Messung der funktionellen Ionenkanäle mit kleinen Molekülen, hat wurde am meisten benutzt für Ionen-Kanal Liganden screening. Jedoch können nicht solche elektrophysiologische Ansätze zeigen, ob die kleinen Moleküle bindet an den Kanal direkt oder nicht19, weil das kleine Molekül auf andere Proteine oder interzelluläre Signalwege, die Interaktion mit den Kanal handeln könnte. Im Vergleich zu radioaktiven Ligand-Bindung-Assay und andere häufig verwendete markierungsfreie Biosensor-Methoden weit verbreitet, hat BLI erhebliche Vorteile in Bezug auf die relative einfache Anordnung, die uneingeschränkte Verein Phase, hoch im gesamten Test Design näher die in-Vivo-System und ein Bedürfnis nach wenig immobilisierte Protein (ein paar μg), und es können detaillierte Einblicke in kinetische Daten5,6,20geben.
Wir gereinigt um maximal die in-Vivo -Situation zu simulieren, die funktionale hEAG1 Kanalproteine aus den Säugetieren stabil Expressionssystems. Eine einfache und effiziente Protokoll zur Reinigung und Identifizierung von überexprimieren Ionen-Kanal-Protein von anhaftenden Säugerzellen wird vorgestellt. Einige wichtige Tipps für die erfolgreiche Reinigung der Membranproteine sind: 1) der Reinigungsprozess kann entweder verkleinerte oder skaliert-Up nach der Ausdruck Fülle von Interesse Proteine in Säugetieren Expressionssysteme; (2) wir verschmolzen einen FLAG-Tag auf dem C-Terminus des hEAG1 Kanals auf die Reinigung dieses Proteins mit Anti-FLAG-Affinität Perlen über das kommerzielle Kit und Reinigung-Protokoll zu erleichtern. Eine elektrophysiologische Messung zeigte, dass die Fusion Fahne keinen Einfluss auf die Funktion von diesem Kanal15 hat; (3) Inkubation der Mischung von Anti-FLAG-Perlen und Proteinextrakt über Nacht bei 4° C mit sanft schütteln ist hilfreich für die Erfassung der Flagge Schmelzverfahren Protein; (4) mit der Affinitätsreinigung können bekommen wir genug hEAG1 Ionen-Kanal-Protein aus vier 15 cm Gerichte mit über 90 % Zelle confluency für einmal Test-Prozess.
Die gereinigten hEAG1 Kanal-Proteine sind biotinylierte durch überschüssiges Biotin (3-10 fach) und den Austausch des Lösung-Puffers mit SD-Puffer für die weitere BLI-Assay. Überschüssiges Biotin kann maximal das Membranprotein Kanal zur beschichteten Effizienzsteigerung auf der Oberfläche der Biosensor Tipps ändern und der SD-Assay-Puffer mit niedrige Konzentrationen von BSA und Polysorbat 20 kann unspezifische Bindung9minimieren. Trotz Sie fortfahren, diese wichtige Vorgänge, die nicht idealen Wechselwirkungen könnte bestehen vor allem bei einer Bindung-Studie mit einer hohen Konzentration von niedermolekularer, die unspezifisch an der Oberfläche des SA-Sensoren und Ergebnis gebunden konnte die falsch-Positive Interaktion als die Cyanin-Kurve in Abbildung 4Agezeigt. Somit eine doppelte Referenz Subtraktion Protokoll ist noch erforderlich, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten, durch Subtraktion die unspezifische Bindungen einschließlich der Interaktionen zwischen dem Sensor und niedermolekularer, Biotinylierte hEAG1 Protein mit kleinen Molekül-Lösung und Sensoren mit kleiner Moleküle Lösung. Diese doppelte Referenz Subtraktion benötigt vier Biosensoren für einmal assay. Zwei Biosensoren werden mit biotinylierte Membranproteine und Verfahren der Interaktion assay mit kleiner Moleküle und seinen Puffer beschichtet werden. Die anderen zwei Sensoren werden mit SD-Puffer und Interaktion mit kleiner Moleküle und seinen Puffer benetzt. Erst das Zusammenspiel von Membranprotein immobilisiert Biosensor und niedermolekularer zeigt das positive Signal und dem Rest der drei Interaktion Signale Arbeit wie die Steuerelemente (Abbildung 2). Mithilfe dieses Verfahrens wie in Abbildung 3 und Abbildung 4, unsere Ergebnisse deutlich zeigen die starke Wechselwirkung zwischen hEAG1 Kanalproteine und PIP2 und zeigen eine Konzentration-Abhängigkeit-Profil. Es ist darauf hinzuweisen gibt es mehrere Einschränkungen in unserer Messung. Zum Beispiel gibt es einige andere Membranlipide die gereinigten Kanal-Protein binden konnte. Außerdem ist es immer noch nicht klar, ob die verankerte gereinigte Protein ihre ursprüngliche Konformation und Aktivität halten. Es ist sehr schwierig, die realen Konfigurationen von niedermolekularer Lipide zu messen, wenn sie mit dem Protein interagieren. Obwohl die detaillierte Prozesse unbekannt sind, unserer Studie zeigen, dass die verbindliche Kinetik von BLI stehen im Einklang mit denen abgeleitet durch elektrophysiologische Aufnahmen, wodurch die neuartige BLI-Anwendung für Ionen-Kanal Protein-kleine Molekül Interaktion in einem Ergänzend.
Zusammenfassend lässt sich sagen bestätigt unsere Studie, dass es eine zuverlässige Strategie durch die Reinigung der funktionalen Membranprotein von Säugetieren Expressionssystems, die direkte Interaktion mit den Liganden zu erkennen. Die erfolgreiche Anwendung von BLI für Membran-Protein-kleine Molekül-Interaktion wird die Erschließung von niedermolekularer Screening und Mechanismus in Ionen-Kanal Wirkstoffforschung erleichtern.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von Bio-ID Center und SJTU Cross-Disciplinary Research Fund in Medizin und Technik (YG2016QN66), National Natural Science Foundation of China (31271217) und National Basic Research Program of China (2014CB910304) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/High Glucose Medium | HyClone | SH30243.01 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | HyClone | SH30256.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 1697550 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430599 | 150 mm X 25 mm |
| Nonidet P-40 Substitute | Amresco | E109 | |
| Sodium chloride | BBI Life Sciences | A610476 | |
| Potassium chloride | BBI Life Sciences | A610440 | |
| Bovine Serum Albumin | BBI Life Sciences | A600332 | |
| Polyoxyethylene-20-Sorbitan Monolaurate | BBI Life Sciences | A600560 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| 3x FLAG peptide | Sigma | F4799 | |
| Octet-RED96 | Pall/FortéBio | 30-5048 | |
| Data Acquisition software | Pall/FortéBio | Version 7.1 | |
| Data Analysis software | Pall/FortéBio | Version 7.1 | |
| Biosensor/Streptavidin | Pall/FortéBio | 18-5019 | |
| Microtiter plate | Greiner Bio-one | 655209 | |
| Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin | ThermoFisher | 21338 | |
| Centrifugal Machine | ThermoFisher | 75004250 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | ThermoScientific | 318120 | |
| Ultrafiltration device | MILLIPORE | UFC503008 | NMWL of 30 kDa |
| phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) | Sigma | P9763 | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody | Sigma | F1804 | 1:2000 dilution |
| goat anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | 1:5000 dilution |
| Enhanced BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0010 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04693159001 | |
| Amersham Imager 600 Imaging System | GE Healthcare Bio-Sciences | ||
| Western blot system | BIO-RAD |
References
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