Summary
ここのプロトコルでは、小分子脂質リガンド ホスファチジルイノシトール 4, 5-ビスリン酸 (PIP2) と精製 hEAG1 イオン チャネル蛋白質の相互作用について説明します。測定は、バリでした小分子イオン チャネル リガンドのスクリーニングのための潜在的な方法であることを示します。
Abstract
バイオ層干渉 (結合) アッセイは、タンパク質とタンパク質・小分子相互作用を測定するための貴重なツールです。ここでは、まず人間の EAG1 の相互作用を研究する新ラベル無料技術のアプリケーションを示す低分子 PIP2(hEAG1) チャネル蛋白質。hEAG1 チャネルは、がんや神経疾患のいくつかの種類に関与するいくつかの機能獲得変異でその異常発現のための潜在的な治療上のターゲットとして認識されています。我々 は哺乳類の安定発現系から hEAG1 チャネル蛋白質を精製し、PIP2バリとの相互作用を測定します。HEAG1 タンパク質と PIP2間のバインドの動態の測定に成功は、バリ アッセイであるイオン チャネルの薬理学の新規低分子リガンドのスクリーニングに使用可能性のある高スループット アプローチについて説明します。
Introduction
ターゲット小分子と細胞表面でアクセス可能なイオン チャネル蛋白質リガンドのスクリーニングと生物学的製剤の発見1,2,3の途方もない可能性を提供しています。したがって、適切なツールは、イオン チャネルおよび小さい分子および彼らの対応する関数との相互作用に必要です。パッチ ・ クランプ記録は、イオン チャネル機能アッセイにユニークでかけがえのない技術実証されています。ただし、他の技術を必要とする小さな分子がイオン チャネルを直接対象かどうかを決定します。伝統的に、放射性リガンド結合アッセイ法はイオン チャネル タンパク質・小分子間結合の動態を観察していました。ただし、この技法の使用法は、限られたその要件を満たすのため放射性分類および検出。また、研究で小さなリガンドのラベルに必須のステップは知られている特定のリガンドなしイオン チャネルの多くの種類で使用できなくなります。NMR 分光法、x 線回折、マイクロ スケール働く (MST)4表面プラズモン共鳴 (SPR) などいくつかの無料のラベルのテクニックは、小さなタンパク質分子間相互作用を測定するために使用されています。しかし、通常の試金のこれらのタイプは、実物大の蛋白質、ダイナミクス、低いスループット、および高コスト5の低解像度を得ることが困難なのため十分な情報を提供できません。これらの手法とは対照的バイオ層干渉 (結合) の表面の小さな蛋白質のサンプル量を固定化した小さなタンパク質分子間相互作用を検出するためのこれらの欠点を克服するための新しいラベル無料方法論として浮上しています。バイオ センサーと光の変化を測定、6、7を通知します。有望なバイオ センサー プラットフォームとしてのバリの方法を既に実行してひと抗体 CR80208などの可溶性タンパク質の天然水で小さな分子の相互作用を観察して、詳細な試金プロシージャで報告されている、前9条。新しい治療上のターゲット発見のためイオン チャネル蛋白質の重要な役割が認識されているがバリに基づくイオン チャネル蛋白質小分子の相互作用アッセイは記載されていません。
人間ゴーゴー エーテル アラカルトチャンネル (hEAG1) は癌細胞および多くのがんや神経疾患10、11、チャネルの潜在的な治療ターゲットとなる中枢神経系の様々 な種類で表されます。 12,13,14。私たちの研究室で電気生理学的調査は、ホスファチジルイノシトール 4, 5 ビスリン酸 (PIP2) hEAG1 チャネル15の抑制効果を確認しました。テスト PIP2バリ手法による hEAG1 との相互作用は特に特定のリガンドを欠けているこれらのチャネルのイオン チャネル蛋白質小分子化合物相互作用の他のタイプのためのモデルとしてすることができます直接私たちの結果に基づいています。バリ アッセイの指示に従って我々 は hEAG1 蛋白質ビオチン化を準備し、それらを固定化したストレプトアビジン (SA) の表面にバイオ センサーのヒント続く相互作用それら PIP2ソリューションとの間の直接結合を観察するために、蛋白質および脂質。HEAG1 タンパク質表面、表面の層の厚さに PIP2の添付ファイルが増加した後直接相関スペクトルのシフトとリアルタイム16で測定することができます。拘束運動は、協会ステップで正のシフトと解離の手順で負のシフトにより決定できます。この原則によると我々 は体外機能的状態を維持するために親和性の浄化法を用いた HEK 239T 安定発現システムから機能的な hEAG1 イオン チャネル蛋白質を精製し、結合の動態を測定濃度の異なる2、ピップし、電気生理学的測定15に見られる semblable 速度論的データが得られました。バリからの結果と電気生理学的測定との間に対応は初めてイオン チャンネル膜蛋白質小分子相互作用の適切な分析ツールとしてのバリの適性を示します。
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Protocol
注: 遠位 C 末端のフラグと hEAG1 続いて HEK 293 t 細胞への DNA 配列を含む pCDH レンチ ウイルス プラスミドを株で継続的にタグ付きのフラグ hEAG1 チャネル蛋白質を表現する HEK 293 t 細胞ラインを構築、ピューロマイシン耐性選択前述15を。
1. 親和性の浄化 HEK 293 t 細胞からの hEAG1 チャネル蛋白質のタグ付きのフラグ
- 暖かい水 (37 ° C) にすぐに液体窒素から hEAG1 チャネルを発現する安定細胞を解凍します。10 cm 皿 (約 5 × 106凍結細胞) の細胞を播きます。セルの成長ダルベッコ変更されたワシの (DMEM) で一晩中 8 mL の 10% 牛胎児血清 (FBS)、100 単位/ml ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシン、4 mM L グルタミンを添加した、次の日に媒体を変更します。
- 細胞の割合が高い安定した養殖システムで hEAG1 チャンネルを表現を確認する蛍光顕微鏡を用いた HEK 293 t 細胞の GFP 蛍光を確認してください。指数関数的に 1 ml 室温と thenadd 消化で終了する血清を含む培養液 2 mL で 1 分の 0.25% トリプシンの成長細胞を trypsinize します。細胞懸濁液の 400 μ L を完全 DMEM 培地 15 mL を含んでいる 15 cm 皿に転送します。合計で 4 つの 15 cm 料理を準備します。
-
2-3 日培養細胞の約 90% に到達した後、これらの細胞を収穫の confluency。
- 細胞から成長培地を外し、生理食塩水リン酸緩衝の 4 mL で 2 回洗浄し (1 x PBS、pH 7.4 を =)。
- 洗浄後に、PBS を破棄します。
- 15 mL チューブにピペットの 1 mL と廃電池セルこすりと転送を使用して各料理の 2 mL の 1x PBS に細胞をこすり取る。
- 4 ° C で 420 x g で 5 分間細胞懸濁液を遠心分離します。
- デカントし、上澄みを廃棄します。
- 氷と渦徹底的にライセート 10 分ごとに 30 分の換散バッファー (10 mM HEPES、1.5 mM MgCl2、10 mM の NaCl、1 NP 40%, pH 7.0 では、含まれている完全なプロテアーゼ阻害剤) の合計 4 mL の細胞ペレットを再懸濁します。
- 細胞ライセートの 4 ° C で 12,000 × g で 10 分間遠心します。
- 5 mL チューブに上清を転送する即時の使用のため氷の上保管してください。
-
反フラグ M2 の親和性の樹脂を準備します。
- 徹底的に反フラグ M2 の親和性のゲルのボトルはゲル粒子の均一懸濁を確認する穏やかな逆転によって (ストア バッファー 50% 懸濁液として供給) 樹脂を中断します。
- すぐに冷えた 1.5 mL チューブに懸濁液の 400 μ L を転送します。
- 30 の 8 s、4 ° C で 000 x g の懸濁液を遠心し、ストア バッファーを洗浄するために慎重に上澄みを廃棄します。
- 樹脂を 500 μ L 1 × PBS を追加し、1 mL ピペットでペレットを中断します。30 の 8 s、4 ° C で 000 x g の懸濁液を遠心分離し、慎重に培養上清中の PBS を破棄します。これらを繰り返し洗浄ステップ格納されたバッファーをクリアします。
- 500 μ L タンパク質抽出上清樹脂ペレット、ペレットを中断し、新しい冷蔵 5 mL チューブに懸濁液を転送するステップ 1.3.8 で準備を追加します。もう一度確認の左ゲルビーズにこの手順を繰り返します。左のタンパク質抽出物を混合物に追加します。
- フラグの融合蛋白質をキャプチャする 4 ° C で 8 回転でシェーカーで一晩の混合物を孵化させなさい。
- 1 で 10 分間、4 ° C で 000 x g 12 時間培養後の混合物を遠心分離します。
- 上澄みを廃棄し、1 × PBS の 500 μ L の 3 回餌を洗浄します。即座の使用のための氷の上におきます。
-
3x フラグ ペプチド溶出フラグ hEAG1 蛋白質。
- 3 X フラグ溶出ソリューションを準備します。500 μ L の原液で 3 X フラグ ペプチドを溶解 (0.5 M トリス-HCl、1 M 塩化ナトリウム、pH = 7.5) 8 μ g/μ L の濃度で。
- 200 ng/μ L の最終的な集中の解決策になるに PBS の 390 μ L に 10 μ L 3 x フラグ溶出液を追加します。
- 1.8 のステップで準備ゲルビーズに 3 x フラグ溶出液の 400 μ L を追加します。
- 4 ° C で 2 h の 8 回転でシェーカーでサンプルをインキュベートします。
- 遠心分離機の 30 用樹脂、8 時 s 000 x g。
- 上清を新しい 1.5 mL チューブに転送、即座の使用のための 4 ° C で保存できます。
2. 集中の試金と浄化確認フラグの融合 hEAG1 BCA タンパク質アッセイ キットと西部にしみが付くことによって
- 製造者の指示によると BCA タンパク質アッセイ キットを使用して浄化された蛋白質の集中を定めます。
- 西部の分析の 30 μ L のサンプルを使用して、確認前述15反フラグ抗体を使用して興味の蛋白質を精製されていた。
3. バリの試金のためビオチンと精製チャネル蛋白質のラベル付け
- PBS で原液をビオチン 5 mg/mL を準備します。各テスト (2 バイオ センサー)、PBS で浄化された蛋白質の望ましい N ターミナル ビオチン化を達成するために 20 μ g 精製蛋白質にビオチンの 3 倍モル超過分を追加します。
- 暗闇の中、少なくとも 30 分間氷の上でサンプルをインキュベートします。
- サンプル希釈 (SD) バッファーを準備: PBS の 0.02% ポリソルベート 20、0.1% ウシ血清アルブミン (BSA、pH 7.4)。
- 限外ろ過 SD バッファーに精製されたチャネル蛋白質のバッファーを変更するを実行します。30 kDa の分子量カットオフと限外濾過装置を使用して、SD バッファーの追加、および 12,000 のサンプルを遠心分離によって非連結のビオチンを削除 4 ° C で 10 分間の g x
- フィルター デバイスに 200 μ L SD バッファーを追加限外ろ過装置、遠心分離機管から、見出されたを削除し、4 ° C で 10 分間、12,000 × g でサンプルを遠心分離少なくとも 3 回、この操作を繰り返します。
- 交換バッファーを収集するには、サンプルでは、逆に 1.5 mL チューブに 4 ° C で 5 分間、2,000 × g で遠心分離それらフィルター デバイスに挿入します。即座の使用のための氷のサンプルを保ちます。
4 PIP2ソリューションの試金のための準備
- 前述の17として氷の上で 30 分間 sonicating 脱イオン H2O の PIP2 (1 mM) の原液を準備します。-20 ° C でガラス瓶でソリューションを格納し、積極的なボルテックス実験の直前に最終濃度に希釈します。
5. バリ アッセイ
- 機器の電源をマシンは、少なくともバリ調査の前に 30 分間、機器を prewarm に「準備完了」の状態を確認する「計測器ステータス」ウィンドウを確認してください。
- 実験ウィザードで「新しい動力学実験」を選択してデータ集録ソフトウェアを開く前に楽器のドアが閉じているかどうかを確認します。
- バッファー、負荷、およびサンプルを選択する右クリックで 96 ウェル プレートで使用する井戸を定義します。サンプル井戸、ビオチン化フラグ融合 hEAG1 タンパク質の濃度の単位として入力する必要があります (10 μ g、0.09 μ M) の臼歯。
- ベースライン、読み込み、離合集散を含む試金のステップを定義します。試金のステップを選択し、それぞれの列をダブルクリックします。アッセイ定義の複製制御センサーを設定されています。1,000 rpm に設定します。基準ステップ 1 分と読み込み、協会、および解離、5-10 分をそれぞれ選択します。室温 (約 24 ° C) でテストを実行します。
注: 2 つの主な手順があります: ロード センサーにビオチン化チャネル蛋白質と低分子化合物との相互作用の試金。彼らが継続的に進むことができる (ベースライン、読み込み、ベースライン、協会および解離)。また、最初の読み込みが失敗したそのとき、試験化合物を無駄にしないように個別に進むことが。 - センサーが含まれておりセンサー トレイにセンサーの位置を示す「塗りつぶし」をクリックして列をクリックします。
- 間違いをチェックし、それらを修正する戻るすべての計画手順を確認します。
- データ ファイルの場所を設定し、アッセイを開始するために"Go"をクリックします。
注: センサー必要 prewetted SD バッファーで少なくとも 10 分のためこの手順が行われている場合、「実験開始遅延」設定をスキップする必要があります。いない場合は、センサーを prewetting 前に 600 秒遅延を設定します。 - トレイの底に黒 96 ウェル プレートを入れて、プレートの A1 コーナーをプレートを座席にトレイの切り込みに挿入します。センサーをロードする井戸、200 μ L/ウェル アッセイバッファーの 2 行 A 井と 2 行 B 96 ウェル プレートの井戸に追加します。
- サンプル プレートとして別の黒 96 ウェル プレートを準備し、B 列に 200 μ L SD を行内のステップ 5.3 でのプログラミング中に割り当てられたコントロールまたはビオチン標識の hEAG1 タンパク質溶液 (10 μ g) として井戸を埋めます。
注: は、気泡を導入することを避けるため。 - 装置のドアを開けるとセンサー トレイを挿入し、それぞれ左と右のプレート ホルダーにプレートのサンプルします。左プレート ホルダーと右のプレート ホルダーの右上隅に"A1"マーカーの形状に基づいて正しくセンサー トレイとサンプル プレートの位置を確認してください。扉を閉じて、分析を開始します。
6. データの分析
- データ分析ソフトウェアを開き、分析データが含まれているフォルダーをロードします。処理メニュー インターフェイスに入るための「処理」をクリックしてと、カラフルな生運動曲線を見ることができます。
- ステップ 1の下で:「データ選択」、「センサーの選択」をクリックします。「センサー トレイ #1」、は、SD バッファーで湿っただけセンサー井戸をクリックしてし、""の参照センサー"へ"センサー タイプを変更するを右クリックします。' サンプル プレート マップ"、すべての非特異的結合井戸を指定し、「よくタイプ変更を""よくを参照"を右しますクリック。
- ステップ 2 の「減算」の前ボックスにチェックして、「二重基準」を指します。
- ステップ3:「Y 軸合わせ」配置のステップとして「ベースライン」を選択します。「時間範囲」、最後の 10 を入力その基準の s (すなわちから: 0.1: 59.8)。
- ステップ4:「間ステップ補正」選択「に揃える基準」協会と解離のステップ間の信号変化を最小限に抑える。
- ステップ5:「プロセス」、ほとんどの場合サビツキー ・ ゴーレイ フィルター処理関数を選択し、「プロセス データ」を進みます。
- 詳細なデータ分析手順 7 でその他のソフトウェアを使用して生データを保存:「保存結果」。
-
クリックして"分析 |カーブ フィット」。
- 選択ステップを「分析」、「協会 |解離」。「モデル」、1:1 を選択します。
注: 我々 は我々 の元のデータにも装着過適合の下での可能性を避けるため 1:1 モデルを選択 1:2 または 2:1 の自由度の高いモデル。その他のオプションです、適当に他のフィッティング解析試料の異なるバインディング モデルを選択できます。 - 「フィット」グローバル (フル) を選択します。「グループ化」、「色」を選択します。「Rmax リンクされていないセンサー」最大信号応答 (Rmax) の独立したフィッティングを許可するを選択します。
- 「フィット カーブ!」をクリックして、非線形回帰分析を開始します。ヒルの式と 1 つの指数関数は、我々 の研究で使用されました。
- クリックして"データのエクスポート |レポートを保存するには"フィッティング結果を保存します。クリックして、または「データ エクスポート |フィッティング結果をエクスポート"他のソフトウェアとさらにグラフ作成とデータ解析の生データを保存します。
- 選択ステップを「分析」、「協会 |解離」。「モデル」、1:1 を選択します。
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Representative Results
HEK 293 t 細胞安定発現 hEAG1 からフラグの融合 hEAG1 チャネル蛋白質を精製しました。この融合タンパク質の機能は、パッチ ・ クランプ法による実証されています、品質と浄化された蛋白質の特異性は西部のしみ (図 1) で確認しました。精製チャネル蛋白質は、リアルタイムのバリ アッセイを用いたビオチン化 (PIP2) 脂質相互作用分析を実行します。バリ バインディング アッセイの構成を図 2に示します。HEAG1 と PIP2間の標準的なバインド曲線を図 3に示します。この例では、3 μ M PIP2 (PIP2の構成は補足の図 1に示すように)、PBS バッファーに溶解しているし、(非特異的結合を減算する二重基準減算プロトコルを使用して信号を解析センサーと PIP2バインディング)、(hEAG1 のビオチン化タンパク質と PBS の相互作用) を背景し、信号ドリフト (センサーと PBS のバインディング) センサーの変動によって引き起こされます。バインディング トレースはグローバルにフィットして、よくフィット オーバーレイ (補足図 2) を表示します。また、PIP2の異なる濃度のタンパク質をインキュベートし PIP2精製 hEAG1 チャネル複合体への結合の速度を測定します。分析の後、電気生理学的測定15から取得した IC50値に似ている 0.35 μ M ±0.04 の解離定数 (Kd) の値を取得します。バリの試金がイオン チャンネル膜蛋白質と脂質の相互作用の解析に適していることが示唆されました。
図 1: 式、関数、および GFP イメージングによる HEK 293 t 細胞から遺伝子組換え hEAG1 蛋白質の特異性の識別パッチ クランプ、および西部のしみ、それぞれします。HEAG1 pCDH レンチ ウイルスを用いた遺伝子導入後モノクローナル ピューロマイシン耐性選択によってほとんどすべての細胞における GFP 発現によって証明されるようで (A) 安定式 hEAG1 HEK 293 t システムが正常に確立されています。(B) パルス プロトコル (上) と A の安定したセルに hEAG1 チャンネルから録画代表全体セル パッチ クランプから現在のトレースを重ね合わせる現在は-80 の保持電圧からの電圧を脱分極によって誘発される 70 mV 10 のステップで mV mV は続いて再分極に-80 mV。通常の K+チャンネルの録音ソリューション15を前述のようにセルに孵化します。機能 hEAG1 チャンネル、HEK293T 細胞で高発現している電位依存性外向きカリウム電流がお勧め。(C) 浄化された蛋白質のサンプルから hEAG1 チャネル蛋白質の西部のしみ。反フラグ抗体は、タグ付きのフラグ hEAG1 チャンネル式のフルの長さを示す 〜 110 kDa の単一蛋白質バンドを認識しています。この図 1は漢らから変更されています。15.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: バリの結合の試金のプロトコルを示す概略図。4 つのセンサーは、チャネル蛋白質および参照を読み込むためビオチン化チャネル蛋白質またはその溶存 SD バッファーに並列で使用されます。その後、これらの 4 つのセンサーは、アッセイの協会およびリン脂質またはそのソリューション バッファー関連付けを検出する位相に転送されます。チャネル蛋白質、リン脂質、およびバッファーの位置は示されているように着色されています。水平方向の赤の点線を示しますバリ研究の 2 つの主要な手順: 相との相互作用アッセイの読み込み。この図 2は、韓らから変更されています。15.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 画面キャプチャ典型的なバリにおける未処理のデータや処理済みのデータを表示します。(A) 代表的な負荷と平衡曲線の平衡化のステップを示す (60 s) (ベースライン) の SD-バッファー、hEAG1 蛋白質 (読み込み) と参照カーブ載荷平衡し、hEAG1 蛋白質 (読み込み中)、同時搭載2 つの個々 のセンサーの先端を測定します。(B) 垂直の赤い線は、転送センサーの脂質ソリューションから緩衝液分析操作中を示します。非特異的結合信号を減算する二重基準減算の処理後の離合集散の段階で元光 (C) 信号。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: PIP2と直接やり取りする hEAG1 チャネル蛋白質を示すバリ アッセイの結果します。(A) 画面キャプチャの濃度依存性の方法で PIP2の hEAG1 蛋白結合の生データを示す (0.03-3 μ M)。バイオ センサーのデータ トレースに対応する PIP2の蓄積濃度が示されます。(B) 代表的なアッセイの PIP2の異なる濃度の光学的干渉の変化を示す raw データ処理。(C) 曲線フィット異なる PIP2濃度平衡解離定数 (Kd) の定量のための相互作用の測定光干渉信号のピーク値から取得したヒルの式hEAG1 チャネル蛋白質と PIP2 (n = 3)。図 4 b 4 Cは漢らから変更されています。15.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 1: 長鎖ホスファチジルイノシトール 4, 5-ビスリン酸 (PIP2) の構成。この図をダウンロードするここをクリックしてください。
補足図 2: 図 3 のバリ アッセイから装備のオーバーレイのスクリーン キャプチャ。データの処理し装着され協会と解離の段階にのみ表示されます。処理済みのデータ曲線は青と非線形当てはめ曲線は赤。フィットの良さ: R2 = 0.984789 ×2 = 0.019109。最大バインド パラメーター (Rmax) = 0.2875 nm (± 0.0006).この図をダウンロードするここをクリックしてください。
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Discussion
膜イオン チャネルは、さまざまな心血管および神経学的疾患18を含む人間の病気の治療のため現在知られている医薬品の 13% 以上の主要な治療上のターゲットとして検証されています。パッチ ・ クランプ記録、小分子とイオン チャネルの機能を測定するため黄金の標準は、広くイオン チャネル リガンドのスクリーニングに使用されています。ただし、小さな分子は他の蛋白質またはチャネルと相互作用する細胞間経路に関する法律でしたので小さな分子に直接チャネルまたはない19、バインドかどうかを示すような電気生理学的アプローチができません。広く放射性リガンド結合アッセイ法そして他の一般的に使用されるラベル無料バイオ センサーの方法と比較して、バリは相対的なシンプルな配置、制限関連づけフェイズに近いアッセイ デザインを通して高の面で重要な利点体内システムの固定された蛋白質 (数 μ g) の少量の必要性は、速度論的データ5,6,20の詳細な洞察を提供できます。
最大限に体内の状況をシミュレートするために、我々 は安定、哺乳類から機能的な hEAG1 チャネル蛋白質を精製式システム。浄化と付着性哺乳類セルから発現イオン チャネル蛋白質の同定のための簡単で効率的なプロトコルが表示されます。膜タンパク質の正常な浄化のためのいくつかの重要なヒント: 1) 浄化プロセスは哺乳類発現システムの興味の蛋白質の表現の豊かさによるとスケール アップまたはスケール ダウンすることができます2) 我々 は商業のキットおよび浄化のプロトコルを使用して反フラグ アフィニティ ビーズでこのタンパク質の精製を容易にする hEAG1 チャンネルの C 末端のフラグの札を融合しました。電気生理学的測定を示したフラグの融合がこのチャネル15の機能に影響を与えません3) 反フラグ ビーズと優しく揺れで 4 ° C で一晩タンパク質抽出物の混合物の孵化はフラグの融合タンパク質を得るために役立ちます4) 親和性の浄化を使用してから得られる十分な hEAG1 イオン チャネル蛋白質 90% セルの上で 4 つの 15 cm 料理合流一度分析プロセスのため。
精製 hEAG1 チャネル蛋白質は、余分なビオチン (3-10 倍) を使用して、ソリューションをバッファーにさらにバリの試金のための SD のバッファーを交換、ビオチン標識です。過剰なビオチンは最大限にバイオ センサー チップの表面にコーティングされた効率を高めるため膜チャネル タンパク質を変更できます、BSA とポリソルベート 20 の低濃度を含有する SD アッセイバッファーは非特異的結合9を最小化できます。これらのキー操作を進んで、にもかかわらず非理想的な相互作用まだ存在する可能性が特に SA センサーおよび結果の表面にもバインドする以外特に小さな分子の高濃度バインディング研究を実行する際、図 4 aのシアニン曲線として偽陽性の相互作用。したがって、二重基準減算プロトコルはまだセンサーと小分子、低分子溶液でベルオキシダーゼ hEAG1 間の相互作用を含む非固有のバインディングを差し引くことによって信頼性の高い結果を得るために必要と小分子のソリューションをセンサー。この二重基準減算演算に 4 バイオ センサーが必要があります、一度試金。2 つのバイオ センサーは、ビオチン化膜タンパク質と進む小分子とそのバッファーの相互作用アッセイでコーティングされます。他の 2 つのセンサーは接液 SD バッファーと小分子とそのバッファーとの相互作用になります。膜タンパク質との相互作用のみがバイオ センサーを固定し、小分子コントロール (図 2) として肯定的な信号と 3 つの相互作用信号の仕事の残りの部分を示しています。この手順を使用して、図 3と図 4に示すように、我々 の結果明らかに hEAG1 チャネル蛋白質と PIP2の間の強い相互作用を示す、濃度依存性のプロフィールを表示します。それは、私たちの測定のいくつかの制限があることを指摘する必要があります。例えば、精製されたチャネル蛋白質に結合できるいくつか他の膜脂質があります。また、それはまだ明確ではないことかどうかアンカーの浄化された蛋白質を保つ元の構造と活動。タンパク質とやり取りするとき、小さな分子の脂質の実際の構成を測定する非常に困難です。我々 の研究がバリでの拘束運動ある小説バリ アプリケーションにおけるイオン チャネル蛋白質小分子相互作用の電気生理学的記録によって派生したものと一貫性のあることを示す詳細なプロセスが知られている、補完的。
要約すると、我々 の研究は、その配位子との直接相互作用を検出する哺乳類発現系から機能性膜蛋白質を浄化することによって信頼性の高い戦略であるを確認します。バリの膜蛋白質小分子の相互作用のための成功のアプリケーションはイオン チャネル創薬における小分子スクリーニングと機構の探査を促進します。
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Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、バイオ ID センターと医学と工学 (YG2016QN66)、国家自然科学基金、中国の (31271217)、および基本的な研究プログラムの中国国家 (2014CB910304) では上海交通大学横断的研究費によって支持されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/High Glucose Medium | HyClone | SH30243.01 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | HyClone | SH30256.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 1697550 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430599 | 150 mm X 25 mm |
| Nonidet P-40 Substitute | Amresco | E109 | |
| Sodium chloride | BBI Life Sciences | A610476 | |
| Potassium chloride | BBI Life Sciences | A610440 | |
| Bovine Serum Albumin | BBI Life Sciences | A600332 | |
| Polyoxyethylene-20-Sorbitan Monolaurate | BBI Life Sciences | A600560 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| 3x FLAG peptide | Sigma | F4799 | |
| Octet-RED96 | Pall/FortéBio | 30-5048 | |
| Data Acquisition software | Pall/FortéBio | Version 7.1 | |
| Data Analysis software | Pall/FortéBio | Version 7.1 | |
| Biosensor/Streptavidin | Pall/FortéBio | 18-5019 | |
| Microtiter plate | Greiner Bio-one | 655209 | |
| Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin | ThermoFisher | 21338 | |
| Centrifugal Machine | ThermoFisher | 75004250 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | ThermoScientific | 318120 | |
| Ultrafiltration device | MILLIPORE | UFC503008 | NMWL of 30 kDa |
| phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) | Sigma | P9763 | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody | Sigma | F1804 | 1:2000 dilution |
| goat anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | 1:5000 dilution |
| Enhanced BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0010 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04693159001 | |
| Amersham Imager 600 Imaging System | GE Healthcare Bio-Sciences | ||
| Western blot system | BIO-RAD |
References
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