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Cancer Research

Identification des OTX1 et OTX2 comme deux marqueurs moléculaires possibles pour les carcinomes Sinonasal et neuroblastomes olfactifs

doi: 10.3791/56880 Published: February 28, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Homeobox gènes sont des gènes régulateurs, souvent associés à des tumeurs chez les organismes adultes. Nous avons étudié leur expression comparative par immunohistochimie et analyse PCR en temps réel, dans la muqueuse nasale normale et inflammatoires et sinonasal néoplasmes afin de les utiliser comme cibles possibles de diagnostiques et thérapeutiques.

Abstract

OTX boîte homéotique (HB) gènes sont exprimés au cours de la morphogenèse embryonnaire et au cours du développement de l’épithélium olfactif chez les organismes adultes. Les mutations qui se produisent dans ces gènes sont souvent associées à tumorigenèse chez l’homme. Aucune donnée n’est actuellement disponible au sujet de la corrélation possible entre gènes OTX et tumeurs des fosses nasales. Le but de ce travail est de comprendre si les OTX1 et OTX2 peuvent être considérés comme des marqueurs moléculaires dans le développement de tumeurs nasales. Nous avons sélectionné des adénocarcinomes voies nasales et des sinus pour étudier l’expression des gènes OTX1 et OTX2 immunohistochimiques et analyses PCR en temps réel. Les deux OTX1 et OTX2 étaient absents dans tous les échantillons de sinonasal Intestinal Type adénocarcinomes (ITACs). OTX1 mRNA fut identifié seulement en Non-Intestinal Type adénocarcinomes (NITACs), alors que OTX2 ARNm a été exprimé que dans les neuroblastomes olfactif (ONs). Nous avons démontré que l’expression différentielle des gènes pour les OTX1 OTX2 gènes et pourrait être un marqueur moléculaire utile pour distinguer les différents types de tumeurs du sinus.

Introduction

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OTX Les gènes de HB sont le vertébrés homologue des gènes orthodenticle Drosophila (otd) et qu’ils codent pour des facteurs de transcription qui sont normalement exprimées au cours de la morphogenèse embryonnaire, mais elles peuvent également être exprimées dans l’organisme adulte avec différentes fonctions . Au cours du développement embryonnaire, ils contrôlent la spécification de l’identité cellulaire, différenciation cellulaire et le positionnement de l’axis¹ du corps. La famille OTX comporte des gènes OTX1 et OTX2 , qui affichent les différentes fonctions. OTX1 est impliqué dans le cerveau et le développement des organes sensoriels. Dans l’organisme adulte, elle s’exprime dans les organes sensoriels et est transcrit en faibles quantités dans le lobe antérieur de l’hypophyse2; Il joue également un rôle dans l’hématopoïèse, étant exprimé en hématopoïétiques pluripotentes et de cellules progénitrices3. OTX2 est impliqué dans le développement de la tête rostral et ses actes de protéine traduite comme une autocatalytiques car il génère un dégradé par l’intermédiaire de quels autres gènes sont activés ou réprimées de manière spatio-temporelle, contribuant ainsi à la cellule prolifération et la différenciation. Dans l’organisme adulte, OTX2 se trouve exclusivement dans le plexus et la glande pinéale choroïde4.

Mutations dans les gènes OTX sont souvent liées à l’apparence humaine défauts congénitaux, somatique ou métabolique. Gain ou perte de mutations dans les gènes OTX pourraient favoriser la tumorigenèse si elles ne sont pas en mesure de contrôler correctement la croissance et/ou la différenciation cellulaire5. Dans les leucémies et les lymphomes ainsi que dans nombreuses tumeurs solides (p. ex., médulloblastomes6, les lymphomes non hodgkiniens agressifs2, de carcinomes mammaires7, cancers colorectaux8et rétinoblastome9), le déréglementés d’expression des gènes de HB OTX est bien documenté10. En outre, des mutations OTX2 ont été démontrées dans les cas d’anophtalmie et microphtalmia11 compte tenu du rôle crucial de ce gène dans le contrôle du développement de le œil.

Dans le cadre des tumeurs solides, la découverte de marqueurs phénotypiques et moléculaires est un défi important pour le diagnostic, la classification et le traitement de plusieurs types de tumeur11, y compris ceux qui sont originaires de la cavité nasale et des sinus de la face sinus. En fait, malgré que ces zones occupent seulement un modeste espace anatomique, épithélium muqueux, glandes, les tissus mous, OS, cartilage ou neural/neuroectodermique et hematolymphoid cellules peuvent être souvent le site pour l’origine du complexe et sur le plan histologique différent groupes de tumeurs. Différents types de tumeurs impliquant le tractus sinonasal présentent une variété de caractéristiques que surmonter ce qu’on voit habituellement dans les voies aérodigestives supérieures ou même tout au long de la plupart des régions du corps12. Sinonasal malignes sont rares et présentent une incidence annuelle de 1/100 000 habitants dans le monde entier, et ainsi vous éviterez des études concernant les voies impliquées dans la tumorigenèse et l’essai des stratégies de traitement alternatif. Malgré cela, les progrès techniques, d’imagerie approches chirurgicales et radiothérapie ont amélioré la prise en charge clinique du cancer des sinus. En outre, le développement de lignées cellulaires comme des modèles animaux et profilage génétique du cancer constituent actuellement la base pour les futures thérapies anticancéreuses ciblées13. A ce jour, il n’y a aucune déclaration au sujet de l’expression OTX1 et/ou OTX2 dans les tumeurs de la cavité nasale et des sinus du rhinopharynx. Puisque nous avons déjà fait observer que OTX1 et OTX2 sont impliqués dans le cancer du sein cancer7, nous nous sommes demandés si ces gènes pourraient être présents non seulement dans la muqueuse nasale normale, mais aussi dans les tumeurs de la cavité nasale. Pour atteindre cet objectif, que nous avons obtenu du département de pathologie de la « Ospedale di Circolo » dans des échantillons de Varese de muqueuse normale et voies nasales et des sinus adénocarcinomes prélevés entre 1985 et 2012 et classés selon l’organisation mondiale de la santé (OMS) classification de la tête et cou tumeurs. Nous choisissons de les analyser grâce à des analyses en temps réel de PCR et l’immunohistochimie et nous avons évalué l’expression OTX1 et OTX2 afin de déterminer si elles peuvent être considérées des marqueurs moléculaires pour ces types de tumeurs.

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Protocol

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Toutes les études ont été effectués conformément à la déclaration d’Helsinki (1975) avec consentement éclairé écrit et approuvé par le Comité d’éthique de l’Université de Insubria à Varèse.

1. collecte des échantillons

  1. Collecter et répartir tous les échantillons humains Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFIP) en différents sous-groupes selon la classification de l’OMS de tête et cou tumeurs14.
    Remarque : Ici, nous avons utilisé les exemples suivants : muqueuse normale sinonasal comme contrôle (10 échantillons) ; Papillome inversé (IP, code ICD-O 8121/1) ; Sinonasal ITAC (CIM-O code 8144/3, 32 échantillons) ; NITAC (CIM-O code 8140/3, 12 échantillons) ; Carcinome adénoïde kystique (ACC, code ICD-O 8200/3) ; Adénome Pléomorphe (PA, code ICD-O 8941/3) ; SUR (CIM-O code 9522/3, 13 échantillons) ; Mal différenciées de carcinome Neuroendocrine (PDNEC, code ICD-O 8041/3, 19 échantillons) ; Tumeurs neuro-endocrines (NET, CIM-O code 8041/3).

2. immunochimie

  1. Déparaffinage et réhydratation des sections
    1. Faites chauffer les diapositives échantillon dans un four à 60 ° C pendant 30 min et réhydrater 3 µm FFIP coupes épaisses à l’aide d’une série d’alcool à l’eau.
    2. Brièvement, laver les lames dans le xylène pendant 10 min et répétez cette étape ; laver les lames pendant 5 min en alcool à 100 % et répétez cette étape avec de l’alcool 95 %, 75 % et 85 % en série. Rincer les lames pendant 5 min dans l’eau distillée.
  2. Bloquant l’activité endogène
    1. Bloquer l’activité endogène en plaçant les diapositives dans aqueux peroxyde d’hydrogène 3 % pendant 12 min.
  3. Recherche d’antigène
    1. Effectuer recherche d’antigène en traitant avec 10 mM tampon Citrate (pH 6) pendant 10 min dans un traitement de micro-ondes.
  4. Incubation avec l’anticorps primaire
    1. Laver les coupes dans le tampon TBS (pH 7,4), puis ajoutez la solution de saturation pendant 10 min.
    2. Laver les coupes dans le tampon TBS (pH 7,4), puis ajouter 0,2 % Triton X.
    3. Incuber une nuit à 4 ° C avec chèvre anti-humain OTX2 anticorps dilué au 1/100.
  5. Incubation avec l’anticorps secondaire
    1. Incuber les sections pendant 1 h à température ambiante avec biotinylé lapin anti-chèvre anticorps secondaire dilué 1 : 200 suivie d’ABC-peroxydase complexe (voir Tableaux des matériaux).
  6. Développer l’immunoreaction
    1. Développer l’immunoreaction à l’aide de 3, 3'-diaminobenzidine tétrahydrochlorure et contre-coloration les noyaux avec Harris hématoxyline.
  7. Montage et imagerie
    1. Déshydrater les sections à l’aide d’alcool à l’échelle du croissant-rouge et expliciter à l’aide d’une substance de compensation d’origine terpéniques (voir Table des matières). Incorporer des sections dans le milieu de montage, placez les sections sur une lame de microscope et observer les sections à travers un microscope optique.

3. RNA Extraction et transcription inverse

  1. Extraction de l’ARN
    1. Extrait les sections RNA en effectuant la première étape du protocole d’immunoprécipitation (voir la section 2.1) et garder la glisse dans l’eau distillée. Se superposer les coupes non colorées à l’hématoxyline-éosine correspondant coupes coloré afin d’identifier les fragments d’intérêt.
    2. Effectuer l’extraction de l’ARN à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN commercial pour échantillons FFPE (voir la Table des matières) et les instructions du fabricant suivant.
  2. Inverse-transcription de l’ARN
    1. Utilisez une trousse commerciale pour rétro-RNA à transcrire en ADNc (voir Table des matières) selon le protocole. Rétro-transcrire au moins 1 000 ng d’ARN total pour effectuer plusieurs analyses.

4. Real-Time PCR et l’analyse des données

  1. PCR en temps réel
    1. Effectuer des analyses PCR en temps réel quantitatives (qRT-PCR) grâce à la technologie basée sur l’analyse (voir Table des matières) et un thermocycleur.
  2. Préparation du mélange de la réaction de PCR
    1. Préparer le mélange de réaction PCR à l’aide de 12,5 µL du mélange maître basée sur sonde, 1,25 ml de chaque OTX1, OTX2 et ACTB sondes (voir Table des matières), 50 ng d’ADNc et exempte de nucléase jusqu'à 25 µL du volume total d’eau.
    2. Effectuer toutes les réactions en trois exemplaires en utilisant le gène ACTB comme le contrôle endogène de normaliser les niveaux d’expression de gène.
    3. Centrifuger la plaque à 1 109 x g pendant 3 min et stocker la plaque à l’abri de la lumière à 4 ° C jusqu'à ce que l’expérience.
  3. Définissant le thermocycleur
    1. Ensemble le profil de thermocycleur avec un premier démarrage à chaud du cycle à 50 ° C pendant 2 min et 95 ° C pendant 10 min, suivi de 40 cycles à 95 ° C pendant 15 s et un dernier cycle à 60 ° C pendant 1 min.
  4. Analyses de niveau expression génique
    1. Normaliser les niveaux d’expression de gène via la méthode du seuil (ΔCt) cycle comparative utilisant le gène ACTB comme le contrôle endogène.
    2. Évaluer les niveaux d’expression de gène à l’aide de la méthode 2-ΔCt et reporter les résultats.
  5. Analyses statistiques
    1. Effectuer des analyses statistiques à l’aide de Student t-Test, compte tenu des résultats statistiquement significatifs avec p < 0,05.

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Representative Results

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Dans la muqueuse normale, nous avons observé une réactivité nucléaire forte et homogène des gènes OTX dans l’épithélium de type respiratoire cilié pseudostratifié et dans les cellules glandulaires sous-muqueux (Figure 1 a). Nous avons trouvé expression nucléaire pour OTX1 dans tous les échantillons de NITACs (Figure 1 b), alors que peu ou absence d’immunoréactivité a été soulignée dans ITACs (Figure 1). Immunoréactivité intense est présente dans tous les ONs (Figure 1) ; parmi PDNECs, expression OTX varie en intensité et pourcentage des cellules positives (Figure 1E). Immunohistochimiques analyse statistique réalisée avec Chi carré ou test exact de Fisher a démontré que l’absence des gènes OTX dans des échantillons de l’acti était statistiquement significative (n = 23, p < 0,01).

Les analyses PCR en temps réel a confirmé l’expression des gènes OTX1 et OTX2 dans des échantillons de contrôle (Figure 2 aB) ; OTX1 mais pas OTX2 a été exprimé dans des échantillons de NITAC et les deux gènes ont été totalement réprimés dans ITACs (Figure 2 aB). SUR des échantillons nous avons ne découvert que l’expression du gène OTX2 tandis que OTX1 a été diminuée, et parmi les échantillons PDNEC l’expression de deux gènes (Figure 2 aB).

Test de t de Student sur PCR en temps réel confirmé les données statistiquement significatives pour OTX1 en contrôles vs ITACs (n = 9, p < 0,05), contrôles vs ONs (n = 6, p < 0,05), contrôles vs PDNECs (n = 8, p < 0,05), et pour OTX2 contrôle vs NITACs (n = 5, p < 0,05), contrôles vs ITACs (n = 9, p < 0,05), contrôles vs ONs (n = 6, p < 0,05) et contrôles vs PDNECs (n = 8, p < 0,05).

Figure 1
Figure 1 : Des images représentatives d’expression immunohistochimique OTX en contrôle et tissus néoplasiques. La réaction développée par l’anticorps secondaire couplé à la peroxydase a révélé que le signal (brun foncé) était visible en 5 sections FFIP de contrôle de la muqueuse des sinus normal (A), 7 cas d’adénocarcinomes Non-intestinal-type (NITACs) (B), 7 cas des neuroblastomes olfactifs (ONs) (D), 11 cas mal différencient carcinomes neuro-endocrines (PDNECs) (E), alors qu’aucune immunoréactivité n’est détectée dans 23 cas d’adénocarcinomes de type Intestinal (ITACs) analysés (C). DAB-hématoxyline ; grossissement original : 200 x, la barre d’échelle = 100 µm.

Figure 2
Figure 2 : Analyse de PCR en temps réel de OTX1 (A) et expression de l’ARNm (B) OTX2 dans les tissus nasaux normales et néoplasiques. Pour les analyses PCR en temps réel, les exemples suivants ont été utilisés : 5 sections de FFIP de muqueuse normale de contrôle, 5 cas d’adénocarcinomes Non-intestinal-type (NITACs), 6 cas de neuroblastomes olfactifs (ONs), 8, 9 cas d’adénocarcinomes de type Intestinal (ITACs) cas de mal différencient des carcinomes neuro-endocrines (PDNEC). Le type d’échantillon est signalé sur l’axe des X, tandis que l’axe Y représente les valeurs deΔCt - 2. Des données statistiquement significatives (p < 0,05) entre le contrôle et les tumeurs ont été obtenues par de Student t-test et sont mises en évidence par des astérisques. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

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Cette étude montre pour la première fois que, selon les niveaux d’ARNm, les gènes de HB OTX1 et OTX2 sont exprimés dans la muqueuse normale sinonasal et glandes sous-muqueuses, polypes inflammatoires, papillomes sinusienne sinonasal et dans les différents épithéliales et neuroectodermique tumeurs, y compris des carcinomes squameux, type non-intestinal sinonasal adénocarcinomes, tumeurs des glandes salivaires-type, tumeurs neuro-endocrines et ONs.

Modifications et dépannage :

Pour éviter la dégradation de l’ARN, nous avons effectué le protocole déparaffinage au laboratoire de pathologie. Après que nous avons rayé les diapositives, tous les échantillons ont été rapidement refroidis et conservés dans la glace sèche jusqu'à la réutilisation. Nous avons effectué toutes les analyses subséquentes sous une hotte à flux laminaire sécurité en utilisant un ensemble dédié des pipettes avec embouts stériles pour maintenir des conditions expérimentales aseptiques et d’éviter des contaminations de RNA.

Limites de la Technique :

La principale limitation de la technique dépend de la disponibilité des échantillons de tumeurs de la cavité du sinus étant souvent rares. Le montant de l’ARN extrait est une autre question importante, parce que l’extraction de l’ARN d’échantillons FFPE se traduit par l’ARN fragmenté qui est difficile à analyser.

Importance en ce qui concerne les méthodes existantes :

Le diagnostic des tumeurs de la cavité nasale se compose généralement des analyses de radiographies, examen endoscopique de la cavité nasale, CT scan, résonance magnétique (RMN) et biopsie. Au cours des dernières années, les progrès de l’instrumentation chirurgicale et les progrès des techniques d’imagerie avaient conduit la chirurgie endoscopique comme la meilleure stratégie pour les tumeurs du sinus. En particulier, cette technique a été signalée si c’est possible pour les différents types de bénignes ou malignes de sinonasal tumeurs15. Notre technique basée sur qRT-PCR permet l’identification de biomarqueurs moléculaires, qui peuvent distinguer différentiellement échantillons de tumeurs différentes : en effet, nous démontrons que l’absence des deux gènes HB dans ITACs peut servir de marqueurs moléculaires pour cela type de tumeur, mais aussi l’absence de OTX2 dans NITACs. En outre, cette technique peut être appliquée immédiatement après la biopsie et peut donner des résultats définitifs en moins de 6 heures en ce qui concerne les jours ou les semaines nécessaires pour le rapport de l’hôpital.

Applications futures :

Nos futures études impliquent l’analyse de gène et des niveaux d’expression de protéines des gènes OTX1 et OTX2 HB en utilisant des analyses PCR en temps réel, Western blot et immunofluorescence avec des anticorps spécifiques de détecter non seulement OTX1 et OTX2, mais aussi les niveaux d’expression famille p53. Étant donné que nous avons précédemment démontré que OTX1 expression est régulée par la p53 dans le cancer du sein cancer du7, il serait intéressant de comprendre si un tel règlement existe aussi dans les tumeurs de la cavité nasale. Un test d’immunofluorescence et un dosage de l’immunoprécipitation de la chromatine (ChiP) peuvent révéler, respectivement, une protéine-protéine et une interaction ADN-protéines entre p53 et OTXs. Si une telle connexion est trouvée, le silence ciblée de p53 (et les membres de la famille, p63 et p73), révélera si la surexpression ou la régulation des gènes OTX est tributaire de la p53.

p53 perte de fonction, par mutation de p53 lui-même ou des perturbations dans les voies de signalisation de p53, est une caractéristique commune à la majorité des cancers humains16. La plus grande partie de l’amas de mutations de p53 dans le domaine de liaison à l’ADN ; activité de liaison à l’ADN est donc la fonction critique qui est altérée, suggérant que les mutations dans les gènes transcriptionnelles pourraient être la clé de l’activité de p53 mutante16. les mutations p53 ont comme caractéristique commune de sinonasal cancer, avec une fréquence globale de 77 %, et ils montrent association adénocarcinome et exposition à la poussière-bois17. Ainsi, dans nos échantillons, il serait intéressant d’évaluer les niveaux d’ARNm et de protéines (par qR-PCR et analyse Western Blot) et d’exécuter la séquence de ce gène, afin d’identifier ou d’exclure la présence de mutations d’activation/désactivation. Enfin, si une mutation récurrente spécifique du type de la tumeur est trouvé, il serait remarquable pour produire des cellules modifiées et souris (avec un allèle mutant) qui abritent cette mutation et examiner si la mutation peut récapituler la maladie.

Étapes essentielles :

Les étapes critiques de cette étude comprennent l’obtention d’échantillons bien stockés, soit en tant que biopsies stockées dans RNA tampon protecteur ou échantillons FFPE d’au moins 8 µm d’épaisseur et l’extraction d’au moins 200 ng d’ARN d’effectuer des analyses qRT-PCR.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par Centro Grandi Strumenti Università Insubria, Fondazione Comunitaria del Varesotto, Fondazione del Monte di Lombardia et Fondazione Anna Villa e Felice Rusconi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Applied Biosystem AM1975
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystem 4368814
TaqMan Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG Applied Biosystem 4326614
ABI Prism 7000  Applied Biosystem 270001857
ACTB probe Applied Biosystem Out of production. Sequence protected by copyright
OTX1 probe Applied Biosystem Out of production. Sequence protected by copyright
OTX2 probe Applied Biosystem Out of production. Sequence protected by copyright
Acqueous Hydrogen Peroxide Merk 1072090250
Citrate Buffer Sigma-Aldrich 20276292
Triton Sigma-Aldrich 101473728
Tris Merk 108382
NaCl Merk 106404
Goat Anti-OTX2 Antibody Vector Laboratories Out of production. Catalog number not available
Rabbit Anti-Goat Antibody Vector Laboratories BA5000
ABC-Peroxidase Complex Vector Laboratories PK6100
3,3'-diaminobenzidine tetrahydrocloride (DAB) Sigma-Aldrich D5905
Harris Hematoxylin Bioptica 0506004/L
Pertek Kaltek SRL 1560
BioClear Bioptica W01030799

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References

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Micheloni, G., Millefanti, G., Conti, A., Pirrone, C., Marando, A., Rainero, A., Tararà, L., Pistochini, A., Lo Curto, F., Pasquali, F., Castelnuovo, P., Acquati, F., Grimaldi, A., Valli, R., Porta, G. Identification of OTX1 and OTX2 As Two Possible Molecular Markers for Sinonasal Carcinomas and Olfactory Neuroblastomas. J. Vis. Exp. (144), e56880, doi:10.3791/56880 (2019).More

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