Summary
本研究的主要目的是规范和测试在彩虹鳟鱼和褐鳟鱼中采集鸡蛋的气动方法 (空气剥离)。这种方法可以有效和简单的收集鸡蛋没有鱼腹部按摩的必要性。
Abstract
卵收集是鲑鱼孵化场鱼类繁殖过程中最关键的过程之一。经典的方法包括使用手按摩的鱼腹部, 以驱逐鸡蛋。另一种方法是使用注入体内腔的气体压力, 从而导致卵的随后释放。认为这种方法对亲鱼的福利和蛋质有较小的负面影响。本文比较了两种鲑鱼鱼、虹鳟 (虹鳟鱼虹鳟鱼) 和褐鳟 (鲑鲑形态石斑鱼) 的一年生存期、卵量和品质的不同的空气和手剥离方法的结果。结果表明, 在彩虹鳟鱼中, 空气剥离使卵质量更好, 一年存活率更高。此外, 空气剥离导致的死亡率低于手剥离组 (25% vs35%)。手剥组的 pH 和孵化率低于剥离组。在褐鳟鱼的情况下, 用手和气剥法获得的卵质量相似;然而, 在空气剥离组中, 鱼的一年损失更高 (15% 与0% 的手剥鱼相比)。尽管空气剥离法在鸡蛋质量方面的优势可能在所有鲑鱼物种中都看不到, 但在孵化场中, 空气剥离过程可能是一个很有希望的选择, 因为它确保了高水平的重现性。和效率。
Introduction
虹鳟 (虹鳟鱼虹鳟鱼) 和褐鳟鱼 (鲑鲑形态石斑鱼) 属于鲑1的 Salmoniformes 家庭。由于商业和娱乐的重要性, 这两个物种在全球水产养殖中的产量得到了快速增长。在波兰, 鲑鱼鱼的产量约为 20 000 吨, 彩虹鳟鱼是主要物种。另一方面, 褐色鳟鱼是欧洲淡水鱼类资源的主要来源, 因为它在水产养殖中具有商业价值, 对钓鱼的重要性。在许多水生生态系统中, 褐鳟鱼种群的存在受到威胁。因此, 人工繁殖已被应用于重新放养本种2的当地人口。
彩虹鳟鱼和褐色鳟鱼通常在三岁时达到性成熟, 男性比女性早一年成熟1。在人工条件下, 彩虹鳟鱼和褐色鳟鱼的卵和精子通常由温和的腹部按摩收集。在实践中, 在小规模上, 采用手剥法采集鸡蛋是具有成本效益的。然而, 在很大程度上, 手剥法可能是劳动密集型和精疲力尽。因此, 由于孵化工人的厌学, 这种技术可能会导致鸡蛋破碎。卵的破损经常导致卵巢液 pH 值降低, 蛋黄释放, 这两种情况对卵3的受精有负面影响。此外, 这种传统的卵子收集方法 (反复按压腹部) 也可能导致因皮肤感染而引起的亲鱼死亡, 与粘液屏障的恶化有关。
在 1957年, 澳大利亚首次使用气动方法收集鸡蛋.4。该方法的基础是注入气体 (空气, 氮气或氧气) 进入体腔, 以驱逐鸡蛋使用气体压力。这种快速和简便的技术已成功地应用于鲑鱼鱼, 没有任何负面的副作用对鱼4。最近, 这种方法用于野生物种 (北派克,狗鱼卢修斯) 收集成熟的鸡蛋在人工条件5。结果表明, 除受精 (Woynarovich 溶液、Billard 缓冲液或孵化水)5, 与手工剥蛋相比, 空剥蛋具有更高的受精和孵化率。
本研究的主要目的是与传统的手剥法相比, 对彩虹鳟鱼和褐鳟中采集鸡蛋的气动方法 (空气剥离) 进行试验。比较了两种方法的效率 (获得的卵量和采集时间、配子质量 (卵巢液 pH 值) 以及孵化率和产卵后死亡率)。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
程序是根据波兰奥尔什丁动物实验伦理学地方委员会进行的。
1.Equipment. 准备
- 用注射器和针头将气体注入鱼体内腔。
- 设置气体压力在0.5 酒吧, 并保持这个压力在1酒吧在整个。
- 控制气流。对于鲑鱼鱼来说, 1.5 升/分是最有效的气体耗尽速度。保持最佳速度, 因为较高的速度可能不会得到所有的鸡蛋, 而速度慢可能不必要地延长的过程。
- 将注射器与螺纹针连接 (直径 0.8-1.2 毫米), 以避免因气体压力引起的针脱离。
2. 空中产卵
- 麻醉 0.2% Propiscin 的鱼。将鱼放入水浴与 0.2% Propiscin, 等待, 直到鱼变得无反应。
- 在产卵前小心地晾干, 用干棉布擦拭。
- 把鱼放在斜床上, 35-40°, 在她的侧尾边上。随着鱼腹部的轻轻推, 检查从生殖道的鸡蛋流。如果鸡蛋不存在, 鱼不应该被产卵。
- 将一个容器覆盖在鱼的小孔下面, 以收集鸡蛋。
- 快把针插入腹鳍下面。
- 由气体自由地去除蛋, 直到仅奇异的蛋从鱼身体被去除。
- 轻轻按摩腹部, 去除鱼体内多余的气体。
- 产卵后, 将鱼轻轻地转移到有水流的水箱中。鱼被释放到坦克后, 空气产卵可能最初在水面上游泳。几分钟后, 鱼释放剩余的气体, 同时游泳, 并开始正常游泳。
注: 获得的鸡蛋是非常干净的, 没有血液或粪便污染。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
从鲑鱼鱼孵化场 (Rutki-Żukowo, 波兰奥尔什丁内陆渔业研究所) 获得了彩虹鳟鱼 (年龄 2 + 1700 328 克) 和褐色鳟鱼 (年龄 3 +, 1900 @ 435 克) 的成熟雄性和雌性。男性和女性被安置在分开的坦克与容量大约 5 m3。水温12±1°c。在操作之前, 鱼被麻醉了以 0.2% Propiscin。鱼被分成两组。他们中的一部分接受了一种传统的方法来获得卵子,即腹部压力 (n = 20)。剩余的小组接受了气动做法与空气的用途 (n = 20)。每个雌性的卵分别收集并放在干塑料碗里。
在手剥鸡蛋的过程中, 鱼首先用干布擦拭, 同时把鱼放在她的身边, 尾部。产卵的持续时间从操作者持有鱼的点开始测量, 或者, 开始按压腹部或注射针头。终点是在鸡蛋停止流向碗的时候设置的。对于手剥离, 选择了一个熟练的工人进行整个实验, 空气剥离程序是由另一名熟练工人进行。
在这一过程中, 通过测量柱测量卵子的体积, 并分别从每个雌性标本中采集卵巢液。然后用 ph 电极对其 ph 值进行分析。在我们的实验中使用的亲鱼被标记为被动集成转发器 (坑) 标签。标记允许我们观察每组鱼的死亡率。
收集后, 每个样品都经过施肥。精子受精是收集约10分钟前产卵和储存稀释在 Morisawa 溶液6 (0.1 米氯化钠, 0.04 米氯化钾, 0.003 米 CaCl2, 0.0015 m 氯化镁2 x 6 H2O, 0.05 米三, pH 8.5), 在比值1:9 在4°c。分别使用四条虹鳟或棕鳟雄性的精子混合物。
由于孵化率是鸡蛋品质最适宜的测量方法, 手工提取的虹鳟和褐鳟卵和气提法均受到施肥。卵的受精与大约10万精子每卵, 使用约100卵从每个雌性。在精子溶液稀释1后, 精子浓度测定在 Bürker 室中, 2000 例为0.7% 氯化钠。卵受精与精子5毫升的 Billard 溶液 (0.125 米氯化钠, 0.002 米三缓冲, 0.003 米甘氨酸, 0.001 毫米 CaCl2, pH 9.0) 为每个变种7。对每个卵样本进行了两次复制。受精后三分钟, 卵样在孵化水中经过仔细清洗两次。然后, 将卵放置在特殊的网格中, 分别放置每个实验变量。受精卵在恒温箱中放置8摄氏度, 眼卵的数量在四周后确定。孵化卵的百分比也根据公式确定: (卵子受精 x 100%)/(所有鸡蛋在具体的变种)。
实验治疗的差异确定与配对 t 试验在水平上的重要性 P < 0.05。以百分比表示的数据在统计分析之前使用弧-罪变换进行了变换。用 GraphPad 棱镜软件进行了统计分析。
用手剥法采集卵子的持续时间较短 (约十年代). 与两种类型的空气剥离方法相比 (图 1;P < 0.05)。剥离的方法 (传统的或气动的) 不影响从彩虹鳟鱼和棕鳟雌鱼获得的卵量 (图 2)。经手剥离后, 虹鳟中的卵巢液 ph 值为 7.6, 而在空气剥离法中, ph 值增加到 8.0 (图 3;P < 0.05)。然而, 不管采集的方法如何, 褐色鳟鱼中的卵巢液 pH 值不受影响 (图 2)。在虹鳟中, 孵化率显著增高 (图 4;P < 0.05) 在空剥蛋比在手剥蛋。与彩虹鳟鱼的空气剥离相比, 手剥离后死亡率较高。然而, 在褐色鳟鱼中, 空气剥蛋的死亡率 (15%) 高于手剥蛋 (表 1)。
图 1.传统的 (手剥) 和气动 (空气剥离) 法在彩虹鳟鱼和褐鳟鱼中采集鸡蛋的时间.统计意义由表示 p 值的星号 (*** p < 0.001) 表示, 误差条表示 SD (n=20)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2.在彩虹鳟鱼和褐鳟中, 通过传统的 (手剥离) 和气动 (空气剥离) 方法采集鸡蛋的数量.错误条指示 SD (n=20)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3.传统的卵巢液 pH 值 (手剥离) 和气动 (空气剥离) 方法的鸡蛋收集在彩虹鳟鱼和褐色鳟鱼.统计意义由表示 p 值的星号 (*** p < 0.001) 表示, 误差条表示 SD (n=20)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4.传统的 (手剥离) 和气动 (空气剥离) 方法的孵化率在彩虹鳟鱼和褐鳟鱼的卵子收集的百分比.统计意义由代表 p 值的星号表示 (** p < 0.01). 误差条表示 SD (n=20)。请单击此处查看此图的较大版本.
| 物种 | 鸡蛋收集方法 | |
| 手剥 | 空气剥离 | |
| 虹鳟鱼 | 35 | 25 |
| 褐色鳟鱼 | 0 | 15 |
表1。在传统的 (手剥) 和气动 (空气剥离) 方法后产卵后死亡率的百分比彩虹鳟鱼和棕鳟鱼的卵采集量超过一年。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
从鱼中采集卵子的气动方法, 虽然比传统的方法 (手剥) 更耗时, 但能保证成熟卵母细胞的高质量 (这项工作)。这与在应用这个过程中的鸡蛋机械破坏的风险低有关。卵巢液的高 pH 值, 以及施肥率的提高, 证明了气动方法的实用性。总的来说, 在孵化协议的标准化方面, 在鱼类繁殖中收集卵子的空气剥离方法可能是一个很有希望的选择, 因为它们的成功应用与操作者的手工优异度无关。
虽然空气产卵似乎是一个自动的选择, 我们发现它可能需要更多的时间比人工产卵。这种不同的持续时间可以很明显, 特别是当有经验的孵化工人应用手剥离程序。然而, 应指出, 使用气压的产卵时间仍然令人满意;每条鱼大约20秒。此外, 这种技术的有效性不依赖于工人的经验, 就像手剥法的情况一样。
虽然我们没有观察到卵子数量的差异, 但在彩虹鳟鱼的情况下, 卵巢液 pH 值的差异是显而易见的。这种效果很可能与破碎的鸡蛋有关, 因为 pH 值是这个现象的一个很好的指示器3。未受精的卵子更容易受到机械损伤, 在硬化时间8内, 卵子活化后的阻力增加。未受精的破卵负责在其他地方报告的鲑鱼较低的受精率。因此, 在收集卵子的过程中必须最大限度地注意。我们的数据表明, 彩虹鳟鱼未受精的卵比褐色鳟鱼的卵还要弱。与空气剥离相比, 用手剥离法提取的虹鳟卵的 pH 值和孵化率较低。这在褐色鳟鱼的情况下没有被看见。我们的实验表明, 对于较软的鸡蛋鲑鱼物种, 在产卵后的质量方面, 空气剥离过程可能是有益的。
在鲑鱼鱼类孵化场中, 产卵后的亲鱼个体死亡率始终可见。然而, 它们的发生与鱼类的个体状况和健康状况有关。空气剥离似乎是一种温和的鸡蛋收集方法, 因为没有大量的皮肤粘液的损失, 一个重要的屏障, 从水中的病原体。尽管我们没有观察到产卵后的死亡率 (产卵后一个月内), 但全年观察显示鱼的一些损失。在彩虹鳟鱼的情况下, 我们观察到在手剥离组中约有10% 的较高损失, 而在褐鳟鱼中, 空气剥离导致一年的死亡率为15%。我们可以假设, 在鸡蛋质量和亲鱼的总体死亡率方面, 空气剥离比棕鳟鱼更有益于彩虹鳟鱼。
虽然空气剥离是有益的彩虹鳟鱼鸡蛋, 但不对褐色鳟鱼, 我们建议, 这一做法可能会更标准化, 比手剥离程序。在空气剥离中, 对鱼腹壁施加的压力是影响成熟卵母细胞质量和数量的唯一因素。这种方法在孵化场中的使用缓解了三文鱼的卵子损失, 主要是由于卵破碎11。由于不需要特别的技能来进行空气剥离程序, 我们预计, 技术和非熟练的孵化工人可以获得类似数量和质量的鸡蛋。我们建议空气剥离程序是一个有希望的选择, 为新孵化场寻找卵子收集程序的特点是高水平的重现性和效率, 以及很少或没有经验的经营者。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
提出的研究得到了 "鱼剥的气动方法-可能的应用, 对配子的质量和数量和鱼的福利的影响" (缩写: PNEUFISH) 资助下的 "渔业业务计划的发展2007-2013 区和沿海地区 "(OR-61724-OR1400001/10), 拨给动物繁殖和食品研究研究所的资金波兰科学院, 波兰奥尔什丁, 成本办公室 (粮食和农业费用行动 FA1205: AQUAGAMETE).我们要感谢, 斯坦利 Ifeanyi Ugwu 在英语编辑方面的大力支持。我们也要承认动画制片人 "工作室 Filmowe Ruchome Obrazki"。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycine pure P.A. | AVANTOR | 527560117 | sperm activating buffer |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | sperm activating buffer |
| Sodium chloride Bioreagent | Sigma Aldrich | S5886 | sperm activating buffer |
| Calcium chloride anhydrous | Sigma Aldrich | C4901 | sperm activating buffer |
| Propiscin (0.2% etomidate solution) | IRS Olsztyn, Poland | not indicated | |
| compressor | Thomas Sheboigan WI USA | DT/SR 070800001882 | |
| reduction valve | Camozzi | cRJUS U7J | |
| air hose | ZEC T.P.U. | SH.98 | |
| syrgine | EFD | 7012118 | |
| Air spawning stage | Biopasz, Poland | PNEU001 | |
| Orion Ross Ultra electrode | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 8102BNUWP |
References
- Nelson, J. S. Fishes of the World. , 4th, JohnWiley and Sons, Inc. Hoboken, NJ, USA. (2006).
- García-Marín, J. L., Sanz, N., Pla, C. Proportions of native and introduced brown trout in adjacent fished and unfished Spanish rivers. Conservation Biology. 12, 313-319 (1998).
- Dietrich, G. J., Wojtczak, M., Slowinska, M., Dobosz, S., Kuzminski, H., Ciereszko, A. Broken eggs decrease pH of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) ovarian fluid. Aquaculture. 273, 748-751 (2007).
- Zurbuch, P. E. A structure for easy fish recovery during drainage of an impoundment. Progressive FishCulturist. 27, 237-238 (1965).
- Cejko, B. I., et al. Effects of different stripping methods of female and activation medium on fertilization success in northern pike (Esox lucius). Czech Journal of Animal Sciences. 10, 481-486 (2016).
- Morisawa, S., Morisawa, M. Induction of potential for sperm motility by bicarbonate and pH in rainbow trout and chum salmon. Journal of Experimental Biology. 136, 13-22 (1988).
- Billard, R., Cosson, J., Perchec, G., Linhart, O. Biology of sperm and artificial reproduction in carp. Aquaculture. 129, 95-112 (1995).
- Iuchi, I., Ha, C. R., Sugiyama, H., Nomura, K. Analysis of chorion hardening of eggs of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Development Growth and Differentiation. 38, 299-306 (1996).
- Wojtczak, M. A., Kowalski, R. K., Dobosz, S., Goryczko, K., Kuźminski, H., Glogowski, J., Ciereszko, A. Assessment of water turbidity for evaluation of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) egg quality. Aquaculture. 242, 617-624 (2004).
- Tabrizi, E. N., Khara, H., Nezami, S. A., Lorestani, R., Shamspour, S. Broken Eggs Influence on Fertilization Capacity and Viability of Eggs, Turbidity and pH of Ovarian Fluid and Fertilization Water in the Endangered Caspian Brown Trout, Salmo Trutta Caspius. International Journal of Biology. 3 (1), 161-166 (2011).
- Carl, G. C. Beware of the broken egg! A possible cause of heavy losses of salmon eggs. Progresive Fish-Culturist. 53, 30-31 (1941).
