Summary
Det vigtigste formål med denne undersøgelse er at standardisere og teste den pneumatiske metode (air stripping) indsamle æg i regnbueørred og ørred. Denne metode giver mulighed for effektiv og enkel samling af æg uden nødvendighed af fisk mave massage.
Abstract
Indsamling af æg er en af de mest afgørende procedurer under fisk reproduktion i laksefisk klækkerier. Klassiske metoder indebærer brug af håndmassage på fisk underliv at udvise æggene. En alternativ metode bruger presset af gas injiceres i kroppen hulrum, som forårsager den efterfølgende frigivelse af æggene. Denne metode er menes at have mindre negative virkninger på både velfærd og æg kvaliteten af gydebestande. Heri, sammenligner vi resultaterne af luft og hånd stripping metoder med hensyn til et års overlevelse og æg kvantitet og kvalitet i to laksefisk fisk, Regnbueørred (Oncorhynchus mykiss) og ørred (Salmo trutta morpha fario). Vores resultater viser at air stripping givet en bedre kvalitet af æg og højere one-års overlevelse i regnbueørred. Derudover luft stripping resulteret i lavere dødelighed end gruppen udsat for hånd stripping (25% vs. 35%). PH og klækning var af gruppen hånd strippet lavere end de af gruppen luft strippet. I tilfælde af ørred var kvaliteten af æg fremstillet ved både hånd og luft-stripping metoder ens; dog var et år tab i fisk højere i luften strippet gruppe (15% i forhold til 0% i hånd strippet fisk). Selv om fordelene ved air stripping metode over hånd stripping æg kvaliteten ikke kunne observeres i alle laksefisk arter, kunne den luft-stripping procedure være en lovende mulighed for at blive vedtaget i klækkerier, da det sikrer en høj grad af reproducerbarhed og effektivitet.
Introduction
Regnbueørred (Oncorhynchus mykiss) og ørred (Salmo trutta morpha fario) hører til familien Salmonidae af Salmoniformes1. Produktionen af disse to arter i globale akvakultur har opnået hurtige vækst, på grund af deres kommercielle og rekreative betydning. I Polen står produktion af laksefisk fisk på omkring 20 000 tons, med regnbueørred er den dominerende art. På den anden side repræsenterer ørred en væsentlig kilde til ferskvandsfisk ressourcer i Europa på grund af sin kommercielle værdi i akvakultur og betydning for lystfiskeri. I mange vandøkosystemer, er eksistensen af ørred populationer truet. Som et resultat, er kunstig reproduktion blevet anvendt til genpåfyldning lokale populationer af denne art2.
Regnbueørred og ørred attain seksuelle modenhed normalt i en alder af tre, med hanner modning et år tidligere end hunner1. Under kunstige forhold, er æg og sæd af regnbueørred og ørred normalt indsamlet af let mave massage. I praksis, på en lille skala, er en hånd-stripping metode til indsamling af æg omkostningseffektive. Dog på en stor skala, kan metoden hånd-stripping være tidskrævende og udmattende. Som et resultat, kan denne teknik resultere i knækkede æg på grund af træthed arbejdstagernes rugeri. Brud på æg fører ofte til et fald i pH i æggestokkene væske og frigivelse af æggeblomme, som begge indvirke negativt på befrugtning af æg3. Desuden, denne traditionelle metode til indsamling af æg (gentagne gange trykke på af maven) kan også resultere i gydebestande dødelighed forårsaget af hudinfektion er forbundet med forringelsen af den beskyttende barriere af slim.
Pneumatisk metode til indsamling af æg blev første gang brugt i Australien i 19574. Metoden er baseret på indsprøjtning af gasser (luft, nitrogen eller oxygen) ind i kroppens hulrum at udvise æg ved hjælp af gastryk. Denne hurtige og nemme teknik har været anvendt med succes i laksefisk fisk uden nogen negative bivirkninger på fisk4. For nylig, denne metode blev brugt i vilde arter (nordlige gedde, Esox lucius) at indsamle modne æg i kunstige forhold5. Det var vist, at air strippet æg havde højere befrugtning og rugeæg priser i forhold til hånd strippet æg, uanset den løsning, der anvendes til befrugtning (Woynarovich løsning, Billard buffer eller rugeri vand)5.
Det vigtigste formål med denne undersøgelse var at teste den pneumatiske metode (air stripping) indsamle æg i regnbueørred og ørred i forhold til traditionelle hånd stripping metode. Effektiviteten af begge metoder (mængden af fremstillede æg) og tidspunkt for indsamling, kvaliteten af gameter (æggestokkene flydende pH), samt rugeæg sats og efter gydningen dødelighed blev sammenlignet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedurer blev gennemført i overensstemmelse med den lokale Komité for etik af dyr eksperimenter i Olsztyn, Polen.
1. udstyr forberedelse
- Bruge en sprøjte og kanyle til injektion af gas i fisk kroppen hulrum.
- Sæt gastryk på 0,5 bar, og vedligeholde dette pres at være under 1 bar hele.
- Kontrol luft flow. For laksefisk fisk er 1,5 L/min. den mest effektive hastighed af gas udmattelse. Vedligeholde det optimale hastighed, fordi højere hastighed ikke kan få alle æg, mens en langsommere hastighed måske unødigt forlænge proceduren.
- Tilslutte sprøjten med en skruet nål (0,8-1,2 mm i diameter) til at undgå nål detachement forårsaget af gas pres.
2. luft gydning
- Bedøver fisk med 0,2% Propiscin. Læg fisken i et vandbad med 0,2% Propiscin og vent indtil fisken bliver unresponsive.
- Forsigtigt tørre ud før gydning af aftørring med en tør bomuldsklud.
- Læg fisken på skrå seng om 35-40°, på hendes side hale side ned. Med en blid tryk af fisk maven, kontrollere æg strømmen fra kønsorganerne. Hvis æggene ikke er til stede, bør fisk ikke blive opfostrede.
- Sted en container dækket med mesh under fisk papilla til indsamle æg.
- Hurtigt indsætte nålen under de abdominale finner.
- Frit fjerne æggene af gas, indtil kun ental æg er fjernet fra selve fisk.
- Forsigtigt massere maven for at fjerne overskydende gas fra selve fisk.
- Efter gydningen, overføre forsigtigt fisken til en tank med vandflow. Fisk frigivet til tank efter luft gydning måske i første omgang svømme på overfladen af vandet. Efter adskillige minutter fisken frigiver de resterende gas mens svømning og starter svømning normalt.
Bemærk: De opnåede æg er meget rene og fri for forurening af blod eller afføring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voksne hanner og hunner af regnbueørred (alder 2 +, 1700 ± 328 g) og ørred (alder 3 +, 1900 ± 435 g) blev fremstillet af laksefisk fisk rugeriet (Rutki-Żukowo, indre fiskeri Institute i Olsztyn, Polen). Hanner og hunner blev placeret i separate tanke med et volumen på ca. 5 m3. Vandets temperatur var 12±1 ° C. Før manipulation, fisk var anesthetized med 0,2% Propiscin. Fisken var opdelt i to grupper. En del af dem undergik en traditionel metode for at få æg, dvs, abdominal pres (n = 20). De resterende grupper undergik den pneumatiske procedure med brug af luft (n = 20). Æg fra hver kvinde blev indsamlet særskilt og anbringes i tørre plastik skåle.
Under hånd stripning af æggene, var fisken først tørres med en tør klud mens du holder fisk på hendes side, hale. Varighed af gydende blev målt fra det punkt, hvor operatoren holder fisken og enten, start, trykke på maven eller injicere nålen. Slutpunktet blev sat på det tidspunkt, når æg stopper flyder til skålen. For hånd stripning, en faglært blev valgt til at gennemføre hele forsøget, og luften stripping procedure blev udført af en anden faglært.
Under proceduren, mængden af æggene opnået blev målt ved hjælp af et måleglas og æggestokkene væsken blev indsamlet særskilt fra hver kvindelige prøvemateriale. Derefter blev dens pH niveau analyseret ved hjælp af en pH elektrode. Gydebestande fisk, der anvendes i vores forsøg blev markeret med passiv integreret Transponder (PIT) tags. Tagging tillod os at observere dødeligheden i hver gruppe af fisk.
Umiddelbart efter opsamlingen, blev hver prøve udsat for befrugtning. Sæd fortyndet til befrugtning blev indsamlet om 10 minutter forud for gydningen og opbevares i Morisawa løsning6 (0,1 M NaCl, 0,04 M KCl, 0,003 M CaCl2, 0.0015 M MgCl2 x 6 H2O, 0,05 M Tris, pH 8,5), i forholdet 1:9 ved 4 ° C. Blandingen af sædceller fremstillet fire regnbueørred eller ørred hanner blev anvendt hhv.
Da udrugning sats er den mest hensigtsmæssige foranstaltning af ægkvalitet, regnbueørred og ørred æg fremstillet i hånden og pneumatiske stripping metoder blev udsat for befrugtning. Æg blev befrugtede med omkring 100.000 sædceller pr. æg, ved hjælp af omkring 100 æg fra hver opfostrede kvinde. Sperm koncentrationer blev målt i Bürker afdeling efter sæd løsninger blev fortyndet 1:2000 med 0,7% NaCl. Æg blev befrugtet med sæd i 5 mL af opløsningen Billard (0,125 M NaCl, 0.002 M Tris buffer, 0,003 M Glycin og 0.001 mM CaCl2, pH 9,0) for hver variant7. To replikationer blev udført for hver prøve af æg. Tre minutter efter befrugtningen, blev æg prøver omhyggeligt vaskes to gange i rugeriet vand. Så, æg blev placeret i en særlig gitter, placere hver eksperimentel variant separat. Befrugtede æg blev placeret i væksthuse ved 8 ° C og antallet eyed æg blev fastsat omkring fire uger senere. Procentdelen af udklækkede æg var også bestemmes ud fra formlen: (æg, der blev befrugtet x 100%) / (alle æg i den konkrete variant).
Forskellene mellem eksperimentelle behandlinger blev fastsat med parret t-test på et niveau af betydning P < 0,05. Dataene udtrykt som en procentdel blev forvandlet, ved hjælp af arc-synd transformation forud for statistisk analyse. Statistiske analyser blev udført med GraphPad prisme software.
Varigheden af indsamling af æg i hånden stripping metode var kortere (ca. 10 s.) i forhold til luft stripping metode i begge arter (figur 1; P < 0,05). Metoder (traditionelle eller pneumatisk) af stripping har ikke indflydelse på mængden af æg fremstillet af både regnbueørred og ørred hunner (figur 2). Æggestokkene flydende pH i regnbueørred efter hånd stripping var 7,6, mens i luften stripping metode, pH blev øget til 8,0 (figur 3; P < 0,05). Men uanset metoder til indsamling af æg, æggestokkene flydende pH i ørred var upåvirket (figur 2). I regnbueørred var udrugning sats betydeligt højere (figur 4; P < 0,05) i luften-strippet æg end i række-afklædt æg. Procent dødelighed var højere efter hånd stripping i forhold til luft stripping i regnbueørred. Men i ørred, procent dødelighed var højere (15%) i luften-strippet æg end i række-afklædt æg (tabel 1).
Figur 1 . Tidspunktet for stripping efter traditionelle (hånd stripping) og pneumatiske (air stripping) metode af æg samling i regnbueørred og bækørred. Statistisk signifikans er angivet med stjerner som repræsenterer P-værdi (*** P < 0,001), fejllinjer angive SD (n = 20). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Mængden af æg fremstillet efter traditionelle (hånd stripping) og pneumatiske (air stripping) metoder til indsamling af æg i regnbueørred og bækørred. Fejllinjer angive SD (n = 20). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Æggestokkene flydende pH efter traditionelle (hånd stripping) og pneumatiske (air stripping) metoder til indsamling af æg i regnbueørred og bækørred. Statistisk signifikans er angivet med stjerner som repræsenterer P-værdi (*** P < 0,001), fejllinjer angive SD (n = 20). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Procentdel af udrugning sats efter traditionelle (hånd stripping) og pneumatiske (air stripping) metoder til indsamling af æg i regnbueørred og bækørred. Statistisk signifikans er angivet med stjerner som repræsenterer P-værdi (** P < 0,01)., fejllinjer angive SD (n = 20). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Arter | Metode til indsamling af æg | |
| Hånd stripping | Luft stripping | |
| Regnbueørred | 35 | 25 |
| Ørred | 0 | 15 |
Tabel 1. Procentdel af post gydende dødelighed efter traditionelle (hånd stripping) og pneumatiske (air stripping) metoder til indsamling af æg i regnbueørred og ørred målt over et år.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den pneumatiske metode til indsamling af æg fra fisk, selv om mere tidskrævende end den traditionelle metode (hånd stripping), kan sikre en høj kvalitet af modnet oocyter (dette arbejde). Dette hænger sammen med lav risiko for mekanisk afbrydelse af æggene samtidig anvendelse af denne procedure. Høj pH af æggestokken væske, samt en stigning i den befrugtning, vidner om nytten af de pneumatiske metode. Samlet set kunne luften stripping metode til indsamling af æg i fisk reproduktion en lovende mulighed med hensyn til standardisering af protokollerne rugeri som deres vellykket anvendelse ikke er relateret til den manuelle excellence af operatørerne.
Selv om air gydning synes at være en automatisk indstilling, fandt vi, at det kan tage længere tid end manuel gydning. Denne forskel i varighed kan være indlysende, især når godt erfarne rugeri arbejdstagere anvender hånd-stripping procedurer. Men det skal bemærkes, at varigheden af gydende med brug af luft tryk er stadig tilfredsstillende; omkring 20 sekunder pr. fisk. Derudover er effektivitet af denne teknik ikke afhængige af arbejdstageres erfaringer, som det er tilfældet med hånd stripping metode.
Selv om vi ikke har overholdt alle forskelle mellem mængderne af fremstillede æg, var forskellene i pH i æggestokkene væske indlysende for regnbueørred. Denne effekt blev sandsynligvis relateret til de knuste æg, som pH er en god indikator for dette fænomen3. Ubefrugtede æg er mere modtagelige for mekanisk skade og deres modstand stigning efter æg aktivering under hærdning tid8. Ubefrugtede knuste æg er ansvarlig for lavere befrugtning priser i laksefisk som rapporteret et andet sted. Derfor, maksimale pleje skal tages under ægudtagningen. Vores data tyder på, at ubefrugtede æg af regnbueørred er svagere end æg af ørred. Regnbueørred æg indsamlet af hånd stripping havde lavere pH og udrugning sats i forhold til dem, der opnås ved air stripping. Dette var ikke tilfældet ørred. Vores eksperimenter tyder på, at for laksefisk arter med blødere æg, kan være til gavn i form efter gydningen kvalitet den luft-stripping procedure.
Enkelte dødelighed af gydebestande efter gydningen er altid synlig i laksefisk fiskeudklækningsanlæg. Men deres forekomst er relateret til både individuelle tilstand og sundhedstilstand fisk. Air stripping synes at være en mild metode til indsamling af æg, som der var ingen massive tab af huden slim, en vigtig hindring mod patogener fra vandet. På trods af, at vi ikke har overholdt alle efter gydende dødelighed (inden en måned fra gydende), viste hele året observation nogle taber fisk. For regnbueørreders vedkommende observerede vi ca. 10% højere tab i hånd strippet gruppe, boer i ørred, air stripping resulterede i 15% dødelighed over året. Vi kan antage, at air stripping kunne være mere gavnlig for regnbueørreders vedkommende end ørred ægkvaliteten og samlet dødelighed af gydebestande.
Selv om air stripping er gavnlige regnbueørred æg men ikke ørred, foreslår vi, at denne procedure kan være mere standardiseret i forhold til hånden stripping procedure. I luften stripping, er trykket anvendes på maven af fisk den eneste faktor, der påvirker kvaliteten og kvantiteten af de modne oocyter opnået. Brug af denne metode i klækkerier lindrer laks æg tab, som hovedsagelig opstår som følge af knuste æg11. Da ingen særlige færdigheder er påkrævet at udføre luft-stripping procedure, forventer vi, at tilsvarende mængde og kvalitet af æg kan opnås af både faglærte og ikke-faglærte rugeri arbejdstagere. Vi anbefaler luft-stripping procedure som en lovende mulighed for nye klækkerier søger æg samling procedure kendetegnet ved høj grad af reproducerbarhed og effektivitet, samt lidt eller ingen erfaring af erhvervsdrivende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Præsenteres undersøgelsen blev støttet af projektet "pneumatiske metode til fisk stripping - eventuel anvendelse, indflydelse på mælke kvalitet og mængde og fisks velfærd" (akronym: PNEUFISH) finansieres under "operationelle Program udvikling af the fiskeri Sektor og Coastal områder 2007-2013"(OR-61724-OR1400001/10), midler afsat til Institute for Animal reproduktion og Food Research Polish Academy of Sciences, Olsztyn, Polen, og støtte af omkostninger Office (fødevarer og landbrug COST Action FA1205: AQUAGAMETE ). Vi vil gerne takke, Stanley Ankjær Teddys for stor støtte i engelsk redigering. Vi ønsker at anerkende også animation producenter "Studio Filmowe Ruchome Obrazki".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycine pure P.A. | AVANTOR | 527560117 | sperm activating buffer |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | sperm activating buffer |
| Sodium chloride Bioreagent | Sigma Aldrich | S5886 | sperm activating buffer |
| Calcium chloride anhydrous | Sigma Aldrich | C4901 | sperm activating buffer |
| Propiscin (0.2% etomidate solution) | IRS Olsztyn, Poland | not indicated | |
| compressor | Thomas Sheboigan WI USA | DT/SR 070800001882 | |
| reduction valve | Camozzi | cRJUS U7J | |
| air hose | ZEC T.P.U. | SH.98 | |
| syrgine | EFD | 7012118 | |
| Air spawning stage | Biopasz, Poland | PNEU001 | |
| Orion Ross Ultra electrode | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 8102BNUWP |
References
- Nelson, J. S. Fishes of the World. , 4th, JohnWiley and Sons, Inc. Hoboken, NJ, USA. (2006).
- García-Marín, J. L., Sanz, N., Pla, C. Proportions of native and introduced brown trout in adjacent fished and unfished Spanish rivers. Conservation Biology. 12, 313-319 (1998).
- Dietrich, G. J., Wojtczak, M., Slowinska, M., Dobosz, S., Kuzminski, H., Ciereszko, A. Broken eggs decrease pH of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) ovarian fluid. Aquaculture. 273, 748-751 (2007).
- Zurbuch, P. E. A structure for easy fish recovery during drainage of an impoundment. Progressive FishCulturist. 27, 237-238 (1965).
- Cejko, B. I., et al. Effects of different stripping methods of female and activation medium on fertilization success in northern pike (Esox lucius). Czech Journal of Animal Sciences. 10, 481-486 (2016).
- Morisawa, S., Morisawa, M. Induction of potential for sperm motility by bicarbonate and pH in rainbow trout and chum salmon. Journal of Experimental Biology. 136, 13-22 (1988).
- Billard, R., Cosson, J., Perchec, G., Linhart, O. Biology of sperm and artificial reproduction in carp. Aquaculture. 129, 95-112 (1995).
- Iuchi, I., Ha, C. R., Sugiyama, H., Nomura, K. Analysis of chorion hardening of eggs of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Development Growth and Differentiation. 38, 299-306 (1996).
- Wojtczak, M. A., Kowalski, R. K., Dobosz, S., Goryczko, K., Kuźminski, H., Glogowski, J., Ciereszko, A. Assessment of water turbidity for evaluation of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) egg quality. Aquaculture. 242, 617-624 (2004).
- Tabrizi, E. N., Khara, H., Nezami, S. A., Lorestani, R., Shamspour, S. Broken Eggs Influence on Fertilization Capacity and Viability of Eggs, Turbidity and pH of Ovarian Fluid and Fertilization Water in the Endangered Caspian Brown Trout, Salmo Trutta Caspius. International Journal of Biology. 3 (1), 161-166 (2011).
- Carl, G. C. Beware of the broken egg! A possible cause of heavy losses of salmon eggs. Progresive Fish-Culturist. 53, 30-31 (1941).
