Summary
Intensjonen med denne studien er å standardisere og teste pneumatiske metoden (luft stripping) å samle egg i regnbueørret og ørret. Denne metoden tillater enkel samling av egg uten nødvendigheten av fisk magen massasje.
Abstract
Høsting er en av de mest avgjørende prosedyrene under fisk kopiering fordøyelsesfunksjon klekkerier. Klassiske metoder som innebærer bruk av hånd massasje på fisk sklerotisert å utvise eggene. En alternativ metoden bruker press av gass injisert i kroppens hulrom, som forårsaker etterfølgende utgivelsen av egg. Denne metoden er antatt å ha mindre negative effekter på både velferd og egg kvaliteten på broodstocks. Her, sammenligne vi resultatene av luft og hånd stripping metoder når det gjelder ett års overlevelse og egg kvantitet og kvalitet på to fordøyelsesfunksjon fisk, regnbueørret (Oncorhynchus mykiss) og ørret (Salmo trutta morpha fario). Våre resultater indikerer at luften stripping gitt en bedre kvalitet på egg og høyere ett års overlevelse i regnbueørret. I tillegg luft stripping resultert i lavere dødelighet enn gruppen utsatt for hånd stripping (25% vs. 35%). PH og klekking frekvensen av den strippet gruppen var lavere enn de luftgruppen strippet. Når det gjelder ørret var kvaliteten på eggene ved både hånd og luft-stripping metoder lignende; men var ett års tapene i fisk høyere i luften strippet gruppe (15% sammenlignet med 0% i hånd strippet fisk). Selv om fordelene med air stripping metoden over hånd stripping i egg kvalitet ikke kanskje være observert i alle fordøyelsesfunksjon arter, kan air-stripping prosedyren være en lovende kan bli vedtatt i klekkerier som den sikrer høy reproduserbarhet og effektivitet.
Introduction
Regnbueørret (Oncorhynchus mykiss) og ørret (Salmo trutta morpha fario) tilhører Salmonidae familie Salmoniformes1. Produksjon av disse to artene i globale akvakultur har fått rask vekst, på grunn av deres kommersielle og fritidsaktiviteter betydning. I Polen, produksjon av fordøyelsesfunksjon fisk står på rundt 20 000 tonn, med regnbueørret blir den dominerende arten. På den annen side, representerer ørreten en viktig kilde til ferskvannsfisk ressurser i Europa på grunn av sin kommersielle verdi i akvakultur og betydning for fisking. Mange akvatiske økosystemer, er eksistensen av ørret populasjoner truet. Som et resultat, er kunstige reproduksjon brukt til restock lokale bestander av denne art2.
Regnbueørret og ørret oppnå seksuell modenhet vanligvis i en alder av tre, med menn modning et år tidligere enn hunnene1. Under kunstig forhold, er egg og sperm regnbueørret og ørret vanligvis samlet av mild underlivs massasje. I praksis, på en liten skala, er hånd-stripping metode å samle egg kostnadseffektive. Imidlertid i stor skala, kan hånd-stripping metoden være arbeidskrevende og utmattende. Som et resultat, kan denne teknikken føre brutt egg på grunn av tretthet av klekkeriet arbeiderne. Brudd på egg fører ofte til en reduksjon i pH ovarian væske og utgivelsen av eggeplomme, begge negativt påvirke befruktning av egg3. Videre kan denne tradisjonelle metoden av egg samling (trykke gjentatte ganger på magen) også resultere i stamfisk dødelighet forårsaket av hudinfeksjon forbundet med forverring av beskyttende barriere av slim.
Pneumatiske metode for høsting ble først brukt i Australia i 19574. Metoden er basert på injeksjon av gasser (luft, nitrogen eller oksygen) i kroppens hulrom å utvise egg bruke gasstrykket. Denne raske og enkle teknikken har vært anvendt i fordøyelsesfunksjon fisk uten noen negative bivirkninger på fisk4. Nylig ble denne metoden brukt i arter (gjedde, Esox lucius) for å samle moden egg i kunstige forhold5. Det ble vist at luften strippet egg hadde høyere befruktning og klekking priser med hånden strippet egg, uavhengig av løsningen for befruktning (Woynarovich løsning, Billard buffer eller klekkeriet vann)5.
Intensjonen med denne studien var å teste pneumatiske metoden (luft stripping) å samle egg i regnbueørret og ørret med tradisjonelle hånd stripping metoden. Effektiviteten av begge metoder (volum innhentet egg) og klokkeslett for samlingen, kvalitet gameter (ovarian væske pH), i tillegg til klekking rate og etter gyting dødelighet ble sammenlignet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prosedyrer ble utført i samsvar med lokale komité for etikk av dyr eksperimenter i Olsztyn, Polen.
1. utstyr forberedelse
- Bruk en sprøyte og sprøytespiss for injeksjon av gass i fisk kroppens hulrom.
- Sette gasstrykket på 0,5 bar, og vedlikeholde dette presset til under 1 bar gjennom.
- Kontrollere luftstrømmen. For fordøyelsesfunksjon fisken er 1,5 L/min mest effektive hastigheten på gass utmattelse. Opprettholde den optimale hastigheten fordi høyere hastighet ikke kan hente alle eggene mens en lavere hastighet kan unødvendig forlenge prosedyren.
- Koble sprøyten med en ødelagt nål (0,8-1.2 mm i diameter) å unngå nål avdeling forårsaket av gasstrykket.
2. luft gyting
- Bedøve fisken med 0,2% Propiscin. Legg fisken i et vannbad med 0,2% Propiscin og vente til fisken blir unresponsive.
- Nøye tørke ut før gyting ved å tørke med en tørr.
- Legg fisken på skrå sengen om 35-40°, på hennes halen siden ned. Med et lett trykk på fisk magen, sjekk egg strømmen fra genital tract. Hvis eggene ikke finnes, bør du ikke spawned fisken.
- Sett en beholder dekket med mesh under fisk papilla å samle egg.
- Raskt sette inn nålen under abdominal finnene.
- Fritt fjerne egg av gassen før bare entall egg er fjernet fra fisk kroppen.
- Forsiktig massasje magen for å fjerne overflødig gass fra selve fisk.
- Etter gyting, forsiktig overføre fisken til en tank med vannstrømmen. Fisk utgitt til tank etter luft gyting kan først svømme på overflaten av vannet. Etter flere minutter fisken utgivelser den gjenværende gassen mens du svømmer og starter svømming normalt.
Merk: Innhentet eggene er veldig rent og fri fra blod eller feces forurensning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eldre menn og kvinner av regnbueørret (alder 2 +, 1700 ± 328 g) og ørret (alder 3 +, 1900 ± 435 g) ble innhentet fra fordøyelsesfunksjon fisk klekkeriet (Rutki-Żukowo, innlandet fiskeri Institute i Olsztyn, Polen). De menn og kvinner ble plassert i separate tanker med et volum på ca 5 m3. Temperaturen var 12±1 ° C. Før manipulering, fisk var anesthetized med 0,2% Propiscin. Fisken ble delt i to grupper. Del av dem gjennomgikk en tradisjonell metode for å få egg, dvs. abdominal Press (n = 20). Gjenstående grupper gjennomgikk pneumatiske prosedyren med bruk av luft (n = 20). Egg fra hver hunn ble samlet separat og plassert i tørr plastikk skåler.
Under hånd stripping av egg, var fisk først tørkes med en tørr klut mens du holder fisken på hennes side, hale. Varigheten av gyting ble målt fra punktet der operatøren har fisken og heller, begynner å trykke magen eller injisere nålen. Endepunktet ble satt på tiden når egg opphøre tilstrømmende til bollen. For hånd stripping, en faglært ble valgt å gjennomføre hele eksperimentet, og luften stripping prosedyren ble utført av en annen faglært.
Under inngrepet, volumet av eggene innhentet ble målt ved hjelp av en måling sylinder og eggstokkene væsken ble innhentet separat fra hver livmorhalsprøven. Deretter ble sitt pH nivå analysert ved hjelp av en pH elektrode. Stamfisk våre forsøk ble merket med passiv integrert Transponder (PIT) koder. Merking tillatt oss å observere dødelighet i hver gruppe av fisk.
Umiddelbart etter samling, ble hver prøve utsatt for befruktning. Sæd fortynnet for befruktning var samlet om 10 minutter før til gyting og lagret i Morisawa løsning6 (0.1 M NaCl, 0.04 M KCl, 0.003 M CaCl2, 0.0015 M MgCl2 x 6 H2O, 0,05 M Tris, pH 8.5) i forholdet 1:9 på 4 ° C. Blandingen av sæd fra fire regnbueørret eller ørret menn ble brukt henholdsvis.
Siden klekking er den mest passende mål egg kvaliteten, regnbueørret og ørret egg fremstilt for hånd og pneumatiske stripping metoder ble utsatt for befruktning. Egg var befruktet med om lag 100.000 sperm per egg, med rundt 100 egg fra hver gytt kvinne. Sperm konsentrasjoner ble målt i Bürker kammeret etter sperm løsninger var fortynnes 1:2000 med 0,7% NaCl. Egg var befruktet med sædceller i 5 mL Billard løsningen (0.125 M NaCl, 0.002 M Tris buffer, 0.003 M glysin og 0,001 mM CaCl2, pH 9.0) hver variant7. To replikeringer ble utført for hvert utvalg av egg. Tre minutter etter befruktning, vasket egg prøver nøye to ganger i klekkeriet vann. Deretter ble egg plassert i en spesiell rutenett, plassere hver eksperimentelle variant separat. Befruktede egg ble plassert i Inkubatorer på 8 ° C og antall øyne-egg ble bestemt om fire uker senere. Andelen skravert egg ble også bestemt formelen: (egg som var befruktet x 100%) / (alle egg i betong varianten).
Forskjellene mellom eksperimentelle behandlinger var bestemt med sammenkoblede t-tester på et nivå av betydning P < 0,05. Dataene uttrykt prosentvis ble transformert bruke arc-sin transformasjon før statistisk analyse. Statistiske analyser ble gjennomført med GraphPad prisme programvare.
Varigheten av egg samling av hånd stripping metoden var kortere (ca. 10 s.) i forhold til luft stripping metoden i begge arter (figur 1; P < 0,05). Metodene (tradisjonell eller pneumatisk) med stripping har ikke innflytelse på volumet av egg fra både regnbueørret og ørret kvinner (figur 2). Ovarian væske pH i regnbueørret etter hånd stripping var 7.6, mens, i luften stripping metoden, pH ble økt til 8.0 (Figur 3; P < 0,05). Men uansett metoder for høsting, ovarian væske pH i ørret var upåvirket (figur 2). Regnbueørret var klekking hastigheten betydelig høyere (Figur 4; P < 0,05) i luften-strippet egg enn i hånd-avkledt egg. Prosentandel dødeligheten var høyere etter hånd stripping i forhold til luft stripping i regnbueørret. Men i Aure var prosentandel dødelighet høyere (15%) i luften-strippet egg enn i hånd-avkledt egg (tabell 1).
Figur 1 . Tidspunktet for stripping etter tradisjonelle (hånd stripping) og pneumatiske (luft stripping) metode for egg samling i regnbueørret og Aure. Statistisk signifikans angis av stjerner som representerer P-verdien (*** P < 0,001), feilfelt angi SD (n = 20). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Volumet av egg innhentet etter tradisjonelle (hånd stripping) og pneumatiske (luft stripping) metoder for egg samling i regnbueørret og Aure. Feilfelt viser SD (n = 20). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Ovarian væske pH etter tradisjonelle (hånd stripping) og pneumatiske (luft stripping) metoder for egg samling i regnbueørret og Aure. Statistisk signifikans angis av stjerner som representerer P-verdien (*** P < 0,001), feilfelt angi SD (n = 20). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Andelen klekking rate etter tradisjonelle (hånd stripping) og pneumatiske (luft stripping) metoder for egg samling i regnbueørret og Aure. Statistisk signifikans angis av stjerner som representerer P-verdien (** P < 0,01)., feilfelt angi SD (n = 20). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Arter | Metode for høsting | |
| Hånd stripping | Air stripping | |
| Regnbueørret | 35 | 25 |
| Ørret | 0 | 15 |
Tabell 1. Andelen etter gyting dødelighet etter tradisjonelle (hånd stripping) og pneumatiske (luft stripping) metoder for egg innsamling i regnbueørret og ørret målt over ett år.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pneumatiske metoden for egg samling fra fisk, selv om mer tidkrevende enn den tradisjonelle metoden (hånd stripping), kan sikre en høy kvalitet på modnet oocytes (dette arbeidet). Dette er relatert til lav risiko for mekanisk avbrudd av egg mens du bruker denne fremgangsmåten. Høy pH i eggstokken væsken, samt en økning i befruktning ofte, bevitne nytten av pneumatiske metoden. Samlet kan luften stripping metode for høsting i fisk reproduksjon være et lovende alternativ i form av standardisering av klekkeriet protokoller, som vellykkede programmet ikke er relatert til manuell fortreffelighet av operatørene.
Selv om luften gyting synes å være et alternativ for automatisk, fant vi at det kan ta mer tid enn manuell gyting. Denne forskjellen i varigheten kan være åpenbare spesielt når godt erfarne klekkeriet arbeidere bruke hånd-stripping prosedyrer. Det bør imidlertid være pekte ut at hele gyting med bruk av lufttrykk er fortsatt tilfredsstillende; cirka 20 sekunder per fisk. Videre er er effektiviteten av denne teknikken ikke avhengig av arbeidernes erfaring, som er tilfellet med hånd stripping metoden.
Selv om vi ikke observerer ulikheter mellom mengder innhentet egg, var forskjellene i pH ovarian væske tydelig i regnbueørret. Dette skyldtes sannsynligvis ødelagt egg, pH er en god indikator på dette fenomenet3. 5mas egg er mer mottagelige for mekanisk skade og deres motstand øke etter egg aktivering i løpet av herdingen tid8. 5mas brutt egg er ansvarlig for lavere befruktning priser i salmonider som rapportert andre steder. Derfor må maksimalt hensyn tas under høsting. Våre data tyder på at 5mas egg av regnbueørret er svakere enn egg av ørret. Regnbueørret egg samlet av hånd stripping hadde lavere pH og klekking rente sammenlignet med de innhentet av luft stripping. Dette var ikke sett i ørret. Vår eksperimenter foreslå at for fordøyelsesfunksjon Art med mykere egg, air-stripping prosedyren kan være nyttig i forhold til etter gyting kvalitet.
Individuelle dødelighet av fiskestammer etter gyting er alltid synlig i fordøyelsesfunksjon fiskeoppdrett. Imidlertid er av forekomsten knyttet til både individuelle tilstand og helsetilstanden til fisken. Air stripping synes å være en mild egg samling som det ikke var noen massive tap av huden slim, en viktig barriere mot patogener fra vannet. Til tross for at vi ikke observerer alle etter gyting dødelighet (innen en måned fra gyting), viste hele året observasjon noen taper fisk. I regnbueørret observerte vi ca 10% høyere tap i hånden strippet gruppen mens, i Aure, air stripping resulterte i 15% dødelighet året. Vi kan anta at luften stripping kan være mer gunstig for regnbueørret enn ørret egg kvalitet og Total dødelighet av Ynglestammen.
Selv om luften stripping er gunstig for regnbueørret egg, men ikke for ørret, foreslår vi at denne prosedyren kan være mer standardisert sammenlignet med hånden stripping prosedyre. I luft stripping, er presset på magen av fisk den eneste faktoren som påvirker kvaliteten og kvantiteten av modnet oocytes oppnådd. Bruk av denne metoden i klekkerier lindrer laks egg tap, som hovedsakelig oppstår fordi brutt egg11. Siden ingen spesielle ferdigheter som kreves for å utføre luft feltrelatert stripping prosedyre, forventer vi at lignende kvantitet og kvalitet av egg kan fås ved begge dyktige og ikke-dyktige klekkeriet arbeidere. Vi anbefaler luft feltrelatert stripping prosedyre som en lovende alternativ for nye klekkerier søker for egg datainnsamling prosedyre preget av høy reproduserbarhet og effektivitet, samt lite eller ingen erfaring av operatørene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Presentert studien ble støttet av prosjektet "pneumatiske metode for fisk stripping - mulig program, påvirker kjønnscellene kvalitet og kvantitet og velferden til fisk" (akronym: PNEUFISH) finansiert under "operative Program utvikling the fiskeri Sektor og kyst områder 2007-2013"(OR-61724-OR1400001/10), midler bevilget til Institute av dyr reproduksjon og mat forskning Polish Academy of Sciences, Olsztyn, Polen, og støtte av kostnader Office (mat og landbruk pris handling FA1205: AQUAGAMETE ). Vi ønsker å takke, Stanley Ifeanyi Ugwu for store støtte i engelsk redigering. Vi ønsker å erkjenne også animasjon produsenter "Studio Filmowe Ruchome Obrazki".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycine pure P.A. | AVANTOR | 527560117 | sperm activating buffer |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | sperm activating buffer |
| Sodium chloride Bioreagent | Sigma Aldrich | S5886 | sperm activating buffer |
| Calcium chloride anhydrous | Sigma Aldrich | C4901 | sperm activating buffer |
| Propiscin (0.2% etomidate solution) | IRS Olsztyn, Poland | not indicated | |
| compressor | Thomas Sheboigan WI USA | DT/SR 070800001882 | |
| reduction valve | Camozzi | cRJUS U7J | |
| air hose | ZEC T.P.U. | SH.98 | |
| syrgine | EFD | 7012118 | |
| Air spawning stage | Biopasz, Poland | PNEU001 | |
| Orion Ross Ultra electrode | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 8102BNUWP |
References
- Nelson, J. S. Fishes of the World. , 4th, JohnWiley and Sons, Inc. Hoboken, NJ, USA. (2006).
- García-Marín, J. L., Sanz, N., Pla, C. Proportions of native and introduced brown trout in adjacent fished and unfished Spanish rivers. Conservation Biology. 12, 313-319 (1998).
- Dietrich, G. J., Wojtczak, M., Slowinska, M., Dobosz, S., Kuzminski, H., Ciereszko, A. Broken eggs decrease pH of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) ovarian fluid. Aquaculture. 273, 748-751 (2007).
- Zurbuch, P. E. A structure for easy fish recovery during drainage of an impoundment. Progressive FishCulturist. 27, 237-238 (1965).
- Cejko, B. I., et al. Effects of different stripping methods of female and activation medium on fertilization success in northern pike (Esox lucius). Czech Journal of Animal Sciences. 10, 481-486 (2016).
- Morisawa, S., Morisawa, M. Induction of potential for sperm motility by bicarbonate and pH in rainbow trout and chum salmon. Journal of Experimental Biology. 136, 13-22 (1988).
- Billard, R., Cosson, J., Perchec, G., Linhart, O. Biology of sperm and artificial reproduction in carp. Aquaculture. 129, 95-112 (1995).
- Iuchi, I., Ha, C. R., Sugiyama, H., Nomura, K. Analysis of chorion hardening of eggs of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Development Growth and Differentiation. 38, 299-306 (1996).
- Wojtczak, M. A., Kowalski, R. K., Dobosz, S., Goryczko, K., Kuźminski, H., Glogowski, J., Ciereszko, A. Assessment of water turbidity for evaluation of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) egg quality. Aquaculture. 242, 617-624 (2004).
- Tabrizi, E. N., Khara, H., Nezami, S. A., Lorestani, R., Shamspour, S. Broken Eggs Influence on Fertilization Capacity and Viability of Eggs, Turbidity and pH of Ovarian Fluid and Fertilization Water in the Endangered Caspian Brown Trout, Salmo Trutta Caspius. International Journal of Biology. 3 (1), 161-166 (2011).
- Carl, G. C. Beware of the broken egg! A possible cause of heavy losses of salmon eggs. Progresive Fish-Culturist. 53, 30-31 (1941).
