Summary
O principal objetivo deste estudo é padronizar e testar o método pneumático (retirar o ar) de coleta de ovos em truta arco-íris e truta. Esse método permite que simples e eficaz de recolha dos ovos, sem necessidade de massagem do abdômen de peixe.
Abstract
Recolha de ovos é um dos procedimentos mais cruciais durante a reprodução de peixes em incubadoras de salmonídeos. Métodos clássicos envolvem o uso de massagem da mão na abdomes peixe para expelir os ovos. Um método alternativo usa a pressão do gás injetado na cavidade do corpo, o que provoca a liberação subsequente dos ovos. Este método é acreditado para ter efeitos menos negativos sobre o bem-estar e o ovo qualidade do ostreicultor. Neste documento, podemos comparar os resultados do ar e mão stripping métodos com relação a qualidade e quantidade de ovos e sobrevivência de um ano em dois peixes salmonídeos, truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss) e truta (Salmo trutta morpha fario). Nossos resultados indicam que esse ar de descascamento rendeu uma melhor qualidade de ovos e maior taxa de sobrevivência de um ano em truta arco-íris. Além disso, ar descascamento resultou em menor taxa de mortalidade que o grupo submetido a mão descascamento (25% vs. 35%). A taxa de pH e incubação do grupo mão despojado foi inferior do grupo ar despojado. No caso de truta, a qualidade dos ovos obtidos pela mão e ar-descascamento métodos foi semelhante; no entanto, as perdas de um ano em peixes foram maiores no grupo ar despojado (15% contra 0% na mão despojado de peixe). Embora as vantagens do ar descascamento método entreguem descascamento em termos de qualidade do ovo não podem ser observadas em todas as espécies de salmonídeos, o procedimento de remoção de ar pode ser uma opção promissora para ser adotado em incubadoras como garante um elevado nível de reprodutibilidade e eficiência.
Introduction
A truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss) e truta (Salmo trutta morpha fario) pertencem à família Salmonidae Salmoniformes1. A produção dessas duas espécies na aquicultura global ganhou rápido crescimento, devido à sua importância comercial e de lazer. Na Polônia, produção de peixe é de cerca de 20 000 toneladas, com truta arco-íris, sendo a espécie dominante. Por outro lado, a truta representa uma importante fonte de recursos de peixes de água doce na Europa por causa de seu valor comercial em aquicultura e importância para a pesca. Em muitos ecossistemas aquáticos, a existência de populações de truta está ameaçada. Como resultado, a reprodução artificial tem sido aplicada para reabastecer as populações locais desta espécie2.
Truta arco-íris e truta atingir a maturidade sexual geralmente na idade de três, com os machos amadurecendo um ano mais cedo do que as fêmeas1. Sob condições artificiais, ovos e esperma de truta arco-íris e truta geralmente é recolhidas pela massagem abdominal suave. Na prática, em pequena escala, um método mão-descascamento de coleta de ovos é cost-effective. No entanto, em grande escala, o método mão-descascamento pode ser trabalhoso e cansativo. Como resultado, esta técnica pode resultar em ovos quebrados devido o cansaço dos trabalhadores incubatório. Quebra de ovos, muitas vezes, leva a uma diminuição do pH do fluido ovariano e a libertação de gema de ovo, os quais afetam negativamente a fertilização dos ovos3. Além disso, este método tradicional de recolha de ovos (pressionando repetidamente do abdômen) também pode resultar em reprodutores mortalidade causada por infecção de pele, associada com a deterioração da barreira protetora de muco.
Pneumático método de recolha de ovos foi usado primeiramente na Austrália em 19574. O método baseia-se a injeção de gases (ar, nitrogênio e oxigênio) na cavidade do corpo para expelir os ovos usando pressão de gás. Esta técnica rápida e fácil tem sido aplicada com sucesso no peixe sem quaisquer efeitos colaterais negativos sobre o peixe4. Recentemente, este método foi usado em espécies selvagens (Northern pike, Esox lucius) para coletar ovos maduros em condições artificiais5. Foi demonstrado que o ar despojado ovos tinham maior fertilização e taxas em comparação com a mão de incubação despojado ovos, independentemente da solução usada para fertilização (solução Woynarovich, água de buffer ou incubatório Billard)5.
O principal objetivo deste estudo foi testar o método pneumático (retirar o ar) de coleta de ovos em truta arco-íris e truta em comparação com o método de descascamento de mão tradicional. Eficiência de ambos os métodos (volume de ovos obtidos) e tempo de coleta, qualidade dos gâmetas (pH fluido ovariano), bem como a mortalidade taxa e pós desova de incubação foram comparada.
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Protocol
Os procedimentos foram realizados em conformidade com o Comitê Local sobre a ética de experimentos animais em Olsztyn, Polônia.
1. preparação do material
- Use uma seringa e uma agulha para a injeção do gás na cavidade do corpo do peixe.
- Ajustar a pressão de gás em 0,5 bar e manter esta pressão deve ser inferior a 1 bar ao longo.
- Controle o fluxo de ar. Para os peixes salmonídeos, 1,5 L/min é a mais eficiente velocidade de exaustão de gás. Manter a velocidade ideal, pois maior velocidade não pode obter todos os ovos, enquanto que uma velocidade mais lenta desnecessariamente pode prolongar o procedimento.
- Conectar a seringa com uma agulha parafusada (0.8-1.2 mm de diâmetro) para evitar o desprendimento de agulha causado pela pressão de gás.
2. ar desova
- Anestesiar o peixe com 0,2% Propiscin. Coloque o peixe em um banho de água com a 0,2% Propiscin e aguarde até que o peixe torna-se sem resposta.
- Seca-se cuidadosamente antes de desova esfregando com um pano de algodão seco.
- Coloque o peixe sobre a cama de inclinação de 35-40°, em seu lado de cauda para baixo. Com um empurrão suave do abdome do peixe, verificar o fluxo de ovo do tracto genital. Se os ovos não estão presentes, o peixe não deve ser gerado.
- Coloque um recipiente coberto com malha abaixo da papila de peixe para recolher os ovos.
- Inserir rapidamente a agulha abaixo as barbatanas abdominais.
- Livremente, retire os ovos pelo gás até apenas singular ovos são removidos do corpo de peixe.
- Massageie suavemente o abdome para remover o excesso de gás do corpo de peixe.
- Após a desova, delicadamente transferi os peixes de um tanque com volume de água. Peixe lançado para tanque após a desova de ar inicialmente pode nadar na superfície da água. Após vários minutos, o peixe libera o restante gás enquanto nadava e começa a nadar normalmente.
Nota: Os ovos obtidos são muito limpas e livres de contaminação de sangue ou de fezes.
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Representative Results
Maduros machos e fêmeas de truta arco-íris (idade 2 +, 1700 ± 328 g) e truta (idade 3 +, 1900 ± 435 g) foram obtidas de peixes salmonídeos incubatório (Rutki-Żukowo, interior da pesca Instituto em Olsztyn, Polônia). Os machos e as fêmeas foram colocadas em tanques separados, com um volume de cerca de 5 m3. A temperatura da água era 12±1 ° C. Antes de manipulação, os peixes foram anestesiados com 0,2% Propiscin. Os peixes foram divididos em dois grupos. Parte deles passou por um método tradicional para obter ovos, ou seja, a pressão intra-abdominal (n = 20). Os grupos restantes foi submetido a procedimento de pneumáticos com o uso de ar (n = 20). Ovos de cada fêmea foram coletados separadamente e colocadas em tigelas de plástico secas.
Durante mão descascamento dos ovos, o peixe primeiro foi limpo com um pano seco enquanto pressiona o peixe do lado dela, a cauda. A duração da desova foi medida a partir do ponto onde o operador mantém o peixe e também, começar a pressionar o abdômen ou injetar a agulha. O ponto final foi definido na época quando ovos param de correr para a tigela. Para mão de descascamento, um trabalhador qualificado foi escolhido para realizar o experimento todo, e o ar descascamento procedimento foi realizado por outro trabalhador qualificado.
Durante o procedimento, o volume dos ovos obtidos foi medido usando uma proveta graduada e o fluido ovariano foi coletado separadamente de cada espécime feminino. Depois disso, seu nível de pH foi analisada utilizando um eletrodo de pH. Peixes reprodutores utilizados em nossas experiências foram marcados com tags de Transponder passivo integrado (PIT). Marcação nos permitiu observar a taxa de mortalidade em cada grupo de peixes.
Imediatamente após a colheita, cada amostra foi submetida à fertilização. Esperma para fertilização foi recolhida sobre 10 minutos antes de desova e armazenada diluído em Morisawa solução6 (0.1 M NaCl, KCl, 0,003 M CaCl2, 0,0015 M MgCl2 x 6 H2O de 0,04 M, 0,05 M Tris, pH 8,5), na proporção de 1:9 a 4 ° C. A mistura de espermatozoides obtidos de quatro truta arco-íris ou truta machos foi usada respectivamente.
Desde que a taxa de eclosão é a medida mais adequada de qualidade do ovo, ovos de truta arco-íris e truta obtidos com a mão e métodos descascamento pneumáticos foram submetidos à fertilização. Os ovos foram fertilizados com o esperma de cerca de 100.000 por ovo, usando cerca de 100 ovos de cada fêmea gerado. As concentrações de esperma foram medidas na câmara Bürker depois esperma soluções foram diluídas 1:2000 com 0,7% NaCl. Os ovos foram fertilizados com o esperma em 5 mL da solução para cada variante7Billard (0,125 M NaCl, tampão Tris de 0,002 M, 0,003 M glicina e 0,001 mM CaCl2, pH 9.0). Realizaram-se duas repetições para cada amostra de ovos. Três minutos após a fertilização, as amostras de ovo foram cuidadosamente lavadas duas vezes na água do incubatório. Em seguida, os ovos foram colocados em uma grade especial, colocando cada variante experimental separadamente. Ovos fertilizados foram colocados em incubadoras a 8 ° C e o número de ovos-eyed determinou-se cerca de quatro semanas mais tarde. A percentagem de ovos eclodidos também foi determinada de acordo com a fórmula: (ovos que foram fertilizados x 100%) / (todos os ovos na variante de concreto).
As diferenças entre os tratamentos experimentais foram determinadas com testes t pareados em um nível de significância P < 0,05. Os dados expressados em percentagem foi transformados usando arco-sin transformação antes da análise estatística. Análises estatísticas foram realizadas com o software GraphPad Prism.
A duração da recolha de ovos à mão descascamento método era mais curta (cerca de 10 s.) em comparação com ar stripping método em ambas as espécies (Figura 1; P < 0,05). Os métodos (tradicionais ou pneumáticos) de stripping não tinha uma influência sobre o volume de ovos obtidos de fêmeas tanto a truta arco-íris e a truta (Figura 2). PH fluido ovariano em truta arco-íris após decapagem de mão foi 7,6, Considerando que, no ar método de descascamento, o pH foi aumentado para 8.0 (Figura 3; P < 0,05). No entanto, independentemente dos métodos de recolha de ovos, o pH fluido ovariano em truta foi afetado (Figura 2). Em truta arco-íris, a taxa de eclosão foi significativamente maior (Figura 4; P < 0,05) em ovos de ar-despojado do que mão-despojado dos ovos. A percentual de mortalidade foi maior após mão descascando em comparação com ar stripping em truta arco-íris. No entanto, em truta, porcentagem de mortalidade foi maior (15%) em ovos de ar-despojado do que na mão-despojado ovos (tabela 1).
Figura 1 . Tempo de remoção após o tradicional (descascamento de mão) e pneumático (retirar o ar) o método de coleta de ovos em truta arco-íris e truta. Significância estatística é indicada por asteriscos que representa o valor-P (* * * P < 0,001), barras de erro indicam SD (n = 20). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . O volume de ovos obtidos após tradicional (descascamento de mão) e pneumático (retirar o ar) métodos de recolha de ovos em truta arco-íris e truta. Barras de erro indicam SD (n = 20). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . PH fluido ovariano após tradicional (descascamento de mão) e pneumático (retirar o ar) métodos de recolha de ovos em truta arco-íris e truta. Significância estatística é indicada por asteriscos que representa o valor-P (* * * P < 0,001), barras de erro indicam SD (n = 20). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Percentagem da taxa de eclosão depois tradicional (descascamento de mão) e pneumático (retirar o ar) métodos de recolha de ovos em truta arco-íris e truta. Significância estatística é indicada por asteriscos que representa o valor-P (* * P < 0,01)., barras de erro indicam SD (n = 20). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Espécies | Método de recolha de ovos | |
| Mão de descascamento | Descascamento do ar | |
| Truta arco-íris | 35 | 25 |
| Truta marrom | 0 | 15 |
Tabela 1. Percentual de mortalidade pós-desova após tradicional (descascamento de mão) e pneumático (retirar o ar) métodos de recolha de ovos em truta arco-íris e truta, medida ao longo de um ano.
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Discussion
O método pneumático de recolha de ovos de peixes, embora mais demorada do que o método tradicional (descascamento de mão), podem garantir uma elevada qualidade de ovócitos amadurecidos (este trabalho). Isto está relacionado com o baixo risco de ruptura mecânica dos ovos durante a aplicação deste procedimento. PH elevado de fluido do ovário, bem como um aumento na taxa de fertilização, atestam a utilidade do método pneumático. No geral, o ar stripping método de recolha de ovos em reprodução de peixes pode ser uma opção promissora em termos de padronização dos protocolos de incubatório, como sua aplicação bem sucedida não está relacionada com a excelência manual dos operadores.
Embora a desova do ar parece ser uma opção automática, achamos que pode levar mais tempo do que o manual de desova. Esta diferença de duração pode ser óbvia, especialmente quando bem experiente incubatório trabalhadores aplicam procedimentos mão-descascamento. No entanto, deve ser apontado que a duração da desova, com o uso de pressão de ar ainda é satisfatória; cerca de 20 segundos por peixe. Além disso, a eficácia desta técnica não é dependente da experiência dos trabalhadores, como é o caso com mão método de descascamento.
Embora nós não observaram diferenças entre volumes de ovos obtidos, as diferenças de pH do fluido ovariano eram evidentes no caso da truta arco-íris. Este efeito foi mais provavelmente relacionado com os ovos quebrados, como o pH é um bom indicador deste fenômeno3. Ovos não-fertilizados são mais suscetíveis a danos mecânicos e seu aumento de resistência após a ativação do ovo durante o endurecimento tempo8. Os ovos não fertilizados de partidos são responsáveis por menores taxas de fertilização em salmonídeos como relatado em outro lugar. Portanto, máxima deve ter cuidado durante a coleta de ovos. Nossos dados sugerem que os ovos não fertilizados de truta arco-íris são mais fracos que ovos de truta. Truta arco-íris ovos recolhidos descascando mão tinham pH inferior e incubação a taxa, em comparação com aqueles obtidos pela remoção de ar. Isto não foi visto no caso de truta. Nossos experimentos sugerem que para espécies salmonícolas com ovos mais suaves, o procedimento de remoção de ar pode ser benéfico em termos de pós desova de qualidade.
Mortalidade individual dos reprodutores após a desova é sempre visível em incubadoras de peixe. No entanto, sua ocorrência está relacionada a condição individual e estado de saúde dos peixes. Descascamento do ar parece ser um método suave de recolha de ovos, como não havia nenhuma perda maciça do muco da pele, uma importante barreira contra agentes patogénicos na água. Apesar do fato de que nós não observaram qualquer mortalidade pós desova (dentro de um mês de desova), observação de ano inteiro mostrou alguns perde de peixe. No caso de truta arco-íris, observamos que cerca de 10% maior de perdas na mão despojado de grupo, Considerando que, em truta, ar descascamento resultou em mortalidade de 15% ao longo do ano. Podemos assumir que ar descascamento pode ser mais benéfico para a truta arco-íris que truta em termos de qualidade do ovo e mortalidade global dos reprodutores.
Embora o ar stripping é benéfico a truta arco-íris ovos mas não a truta marrom, sugerimos que este procedimento pode ser mais padronizado em relação ao processo de descascamento de mão. No ar de descascamento, a pressão aplicada no abdômen de peixe é o único fator que afeta a qualidade e a quantidade de maturação oócitos obtidos. O uso desse método em incubadoras alivia perdas de ovos de salmão, que ocorrem principalmente como resultado dos ovos partidos11. Uma vez que não há habilidades especiais são necessárias para realizar o procedimento de remoção de ar, esperamos que quantidade e qualidade dos ovos semelhantes podem ser obtidos por dois trabalhadores qualificados e não qualificados incubatório. Podemos recomendar ar-stripping procedimento como uma opção promissora para incubatórios novos buscando para procedimento de coleta de ovo caracterizado pelo elevado nível de eficiência e reprodutibilidade, bem como pouco ou não experiência pelos operadores.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
O estudo apresentado foi apoiado pelo projeto "método pneumático de peixe stripping - possível aplicação, influência sobre o bem-estar dos peixes e a quantidade e a qualidade dos gametas" (sigla: PNEUFISH) financiadas ao abrigo do "operacional programa desenvolvimento of the Fisheries Sector e das zonas costeiras 2007-2013"(OR-61724-OR1400001/10), fundos apropriados de Instituto de reprodução Animal e pesquisa de alimentos polonês Olsztyn, Polônia, Academia das Ciências e suporte pelo escritório de custo (alimentação e agricultura custo ação FA1205: AQUAGAMETE ). Gostaríamos de agradecer, Stanley Ifeanyi Ugwu grande apoio na edição inglesa. Queremos reconhecer também os produtores de animação "Studio Filmowe Mobile do".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycine pure P.A. | AVANTOR | 527560117 | sperm activating buffer |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | sperm activating buffer |
| Sodium chloride Bioreagent | Sigma Aldrich | S5886 | sperm activating buffer |
| Calcium chloride anhydrous | Sigma Aldrich | C4901 | sperm activating buffer |
| Propiscin (0.2% etomidate solution) | IRS Olsztyn, Poland | not indicated | |
| compressor | Thomas Sheboigan WI USA | DT/SR 070800001882 | |
| reduction valve | Camozzi | cRJUS U7J | |
| air hose | ZEC T.P.U. | SH.98 | |
| syrgine | EFD | 7012118 | |
| Air spawning stage | Biopasz, Poland | PNEU001 | |
| Orion Ross Ultra electrode | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 8102BNUWP |
References
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