Summary
Huvudsyftet med denna studie är att standardisera och testa pneumatiska metoden (air strippar) för att samla ägg i regnbåge och öring. Denna metod tillåter effektiv och enkel insamling av ägg utan nödvändigheten av fisk buken massage.
Abstract
Insamling av ägg är en av de mest avgörande förfaranden under fisk reproduktion i laxfisk kläckerier. Klassiska metoder innebär användning av handmassage på fisk abdomens att utvisa äggen. En alternativ metod använder trycket av gas som har injicerats i kroppen hålighet, som orsakar den påföljande frisättningen av äggen. Denna metod tros ha mindre negativa effekter på både välfärd och ägg kvalitet av broodstocks. Häri, jämför vi resultaten av luft och hand strippar metoder med avseende på ett års överlevnad och ägg kvantitet och kvalitet i två laxfisk, regnbåge (Oncorhynchus mykiss) och öring (Salmo trutta morpha fario). Våra resultat tyder det luft strippar gav en bättre kvalitet på ägg och högre ett års överlevnad i regnbåge. Dessutom, air strippar resulterade i lägre dödlighet än den grupp som utsätts för hand strippar (25% vs. 35%). PH och kläckning var av gruppen hand strippad lägre än de i gruppen air strippad. När det gäller öring var kvaliteten på ägg som erhållits genom både hand- och luft-strippning metoder liknande; de ettåriga förlusterna i fisk var dock högre i luften strippad grupp (15% jämfört med 0% i hand strippad fisk). Även om fördelarna med luft strippar metod över hand strippar ägg kvalitativt inte kan observeras i alla laxfiskar arter, vara det luft-strippning förfarandet ett lovande alternativ antas i kläckerier eftersom det garanterar en hög reproducerbarhet och effektivitet.
Introduction
De regnbåge (Oncorhynchus mykiss) och öring (Salmo trutta morpha fario) tillhör familjen Salmonidae Salmoniformes1. Produktionen av dessa två arter i globala vattenbruket har fått snabb tillväxt, på grund av deras kommersiella och fritids betydelse. I Polen, produktionen av laxartad fisk står på omkring 20 000 ton, med regnbåge som den dominerande arten. Däremot, representerar öring en viktig källa av sötvattensfisk resurser i Europa på grund av dess kommersiella värde i vattenbruk och betydelse för sportfiske. I många akvatiska ekosystem hotas förekomsten av öring populationer. Som ett resultat, har artificiell reproduktion tillämpats för att förnya lokala populationer av denna art2.
Regnbåge och öring uppnå könsmognad vanligen på tre, med män mognar ett år tidigare än kvinnor1års ålder. Under konstgjorda förhållanden samlas ägg och spermier av regnbåge och öring vanligtvis av mild buken massage. I praktiken, i liten skala, är en hand-strippning metod för att samla ägg kostnadseffektiv. I stor skala, kan hand-strippning metoden emellertid arbetsintensiva och utmattande. Som ett resultat, kan denna teknik resultera i trasiga ägg på grund av trötthet arbetstagares kläckeri. Brott på ägg leder ofta till en minskning av pH-värdet i äggstockarna vätska och frisläppandet av äggula, vilka båda negativt påverka befruktningen av ägg3. Dessutom kan denna traditionella metod för insamling av ägg (upprepade gånger trycka på av buken) också resultera i avelsbestånd dödlighet orsakad av hudinfektion som är associerad med försämringen av den skyddande barriären av slem.
Pneumatiska metoden för insamling av ägg användes först i Australien i 19574. Metoden är baserad på injektion av gaser (luft, kvävgas eller syrgas) i kroppen hålighet att utvisa ägg använder gastryck. Denna snabba och enkla teknik har tillämpats framgångsrikt i laxartad fisk utan några negativa biverkningar på fisk4. Denna metod användes nyligen, i vilda arter (gädda, Esox lucius) för att samla mogna ägg i konstgjorda förhållanden5. Det visades att luft strippad ägg hade högre befruktning och kläckning priser jämfört med hand strippad ägg, oavsett vilken lösning som används för befruktning (Woynarovich lösning, Billard buffert eller kläckeri vatten)5.
Huvudsyftet med denna studie var att testa pneumatiska metoden (air strippar) för att samla ägg i regnbåge och öring i jämförelse med traditionella hand strippar metod. Effektivitetsvinsterna av båda metoderna (volym av erhållna ägg) och tid för samling, kvalitet av könsceller (cystor vätska pH), liksom kläckning ränta och efter romläggningen dödlighet jämfördes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Förfaranden genomfördes i enlighet med den lokala kommittén för etik av djur experimenten i Olsztyn, Poland.
1. utrustning förberedelse
- Använd en spruta och nål för injektion av gas i fisk organ hålighet.
- Ställa in gastrycket på 0,5 bar och upprätthålla detta trycket ligga under 1 bar under hela.
- Styra luftflödet. För laxartad fisk är 1,5 L/min den mest effektiva hastigheten av gas utmattning. Upprätthålla den optimala hastigheten eftersom högre hastighet inte kan erhålla alla ägg medan långsammare kan onödan förlänga förfarandet.
- Anslut sprutan med en skruvad nål (0,8-1,2 mm i diameter) att undvika nål avlossning orsakas av gastrycket.
2. luften lekande
- Söva fisken med 0,2% Propiscin. Placera fisken i ett vattenbad med 0,2% Propiscin och vänta tills fisken blir inte svarar.
- Försiktigt torka ut före leken genom att torka med en torr bomullstrasa.
- Placera fisken på de lutande sängen om 35-40°, på hennes sida svans sida ner. Med en mild push av fisk buken, kontrollera ägg flödet från könsorganen. Om äggen inte är närvarande, bör fisken inte att lekt.
- Placera en behållare som täckt med mesh nedanför fisk papilla till samla ägg.
- Snabbt in nålen under buk fenor.
- Fritt bort äggen av gasa tills endast singular ägg tas bort från fisk kroppen.
- Massera försiktigt in i buken för att ta bort överflödig gas från fisk kroppen.
- Efter romläggningen försiktigt överför fisken till en tank med vattenflöde. Fisk släpptes till tank efter luft lek kan initialt simma på ytan av vattnet. Efter flera minuter fisken släpper resterande gas medan simning och börjar simma normalt.
Obs: Erhållna äggen är mycket ren och fri från blod eller avföring kontaminering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mogna män och kvinnor av regnbåge (ålder 2 +, 1700 ± 328 g) och öring (ålder 3 +, 1900 ± 435 g) erhölls från laxartad fisk kläckeriet (Rutki-Żukowo, inre fiskeri Institute i Olsztyn, Poland). De män och kvinnor placerades i separata behållare med en volym på ca 5 m3. Vattentemperaturen var 12±1 ° C. Innan manipulation, fisk var bedövas med 0,2% Propiscin. Fisken var indelade i två grupper. En del av dem genomgick en traditionell metod för att få ägg, dvs buktryck (n = 20). De återstående grupperna genomgick pneumatiska förfarandet med hjälp av air (n = 20). Ägg från varje kvinna samlades in separat och placeras i torr plast skålar.
Under hand strippar av äggen, var fisken först torkas med en torr trasa håll fisken på hennes sida, svans. Varaktigheten av lekande mättes start från den punkt där operatören innehar fisken och antingen, börja trycka på buken eller injicera nålen. Slutpunkten sattes vid tidpunkten när ägg slutar flöda till skålen. För hand strippar, en yrkesman valdes för att genomföra hela experimentet, och luften strippning förfarande utfördes av en annan yrkesman.
Under förfarandet, volymen av äggen erhålls mättes med en mätcylinder och cystor vätskan var samlas in separat från varje kvinnliga exemplaret. Därefter analyserades dess pH-värde med hjälp av en pH-elektrod. Avelsbestånd fisk som används i våra experiment har markerats med passiv integrerad Transponder (PIT) Taggar. Taggning tillät oss att iaktta dödligheten inom varje grupp av fisk.
Omedelbart efter samlingen utsattes varje prov för befruktning. Spermier utspätt för befruktning var som samlas in om 10 minuter före lek och lagras i Morisawa lösning6 (0.1 M NaCl, 0,04 M KCl, 0,003 M CaCl2, 0,0015 M MgCl2 6 H2O, 0,05 M Tris, pH 8,5) i förhållandet 1:9 vid 4 ° C. Blandningen av sperma från fyra regnbåge eller öring hanar användes respektive.
Eftersom kläckning är den mest lämpliga åtgärden av äggkvaliteten, regnbåge och öring ägg erhållits för hand och pneumatiska stripp metoder utsattes för befruktning. Ägg blev befruktade med cirka 100.000 spermie per ägg, med ca 100 ägg från varje lekt kvinna. Spermier koncentrationerna mättes i Bürker kammare efter spermier lösningar var utspädd 1:2000 med 0,7% NaCl. Ägg blev befruktade med sperma i 5 mL Billard lösningen (0,125 M NaCl, 0,002 M Tris buffert, 0,003 M glycin och 0,001 mM CaCl2, pH 9,0) för varje variant7. Två replikationer utfördes för varje prov av ägg. Tre minuter efter befruktningen, var ägg proverna noggrant tvättas två gånger i kläckeriet vatten. Ägg placerades sedan i en speciell rutnät, att placera varje experimentella variant separat. Befruktade ägg placerades i inkubatorer vid 8 ° C och antalet eyed-ägg bestämdes ca fyra veckor senare. Procentandelen av kläckta ägg var också bestämmas enligt formeln: (ägg som befruktas x 100%) / (alla ägg i den konkreta varianten).
Skillnaderna mellan experimentella behandlingar bestämdes med parade t-tester på en signifikansnivå P < 0,05. Data uttryckt som en procentsats förvandlades med arc-sin omvandling före statistisk analys. Statistiska analyser genomfördes med GraphPad Prism programvara.
Varaktigheten av insamling av ägg för hand strippar metod var kortare (ca 10 s.) i jämförelse med luften strippar metod hos båda arterna (figur 1. P < 0,05). Analysmetoder (traditionell eller pneumatiska) strippar inte påverka volymen av ägg från både regnbåge och öring kvinnor (figur 2). Ovariell vätska pH i regnbåge efter hand strippar var 7,6, medan i luften strippar metod, pH ökades till 8,0 (figur 3. P < 0,05). Men oavsett metoderna för insamling av ägg, cystor vätska pH i öring var opåverkad (figur 2). I regnbåge var kläckning den betydligt högre (figur 4. P < 0,05) i air-skrapat ägg än i hand-skrapat ägg. Den procentuella dödligheten var högre efter hand strippar i jämförelse med luften strippar i regnbåge. Dock i öring var procentandel dödligheten högre (15%) i air-skrapat ägg än i hand-skrapat ägg (tabell 1).
Figur 1 . Tidpunkten för strippning efter traditionella (hand strippar) och pneumatiska (air strippar) metoden för ägg insamling i regnbåge och öring. Statistisk signifikans markeras med asterisker som representerar P-värde (*** P < 0.001), felstaplar visar SD (n = 20). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Volymen av ägg erhållits efter traditionella (hand strippar) och pneumatiska (air strippar) metoder för insamling av ägg i regnbåge och öring. Felstaplar visar SD (n = 20). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Ovariell vätska pH efter traditionella (hand strippar) och pneumatiska (air strippar) metoder för insamling av ägg i regnbåge och öring. Statistisk signifikans markeras med asterisker som representerar P-värde (*** P < 0.001), felstaplar visar SD (n = 20). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Procentandel av kläckning efter traditionella (hand strippar) och pneumatiska (air strippar) metoder för insamling av ägg i regnbåge och öring. Statistisk signifikans markeras med asterisker som representerar P-värde (** P < 0,01)., felstaplar visar SD (n = 20). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Arter | Metod för insamling av ägg | |
| Hand strippar | Luft strippar | |
| Regnbåge | 35 | 25 |
| Öring | 0 | 15 |
Tabell 1. Procentandel av efter lekbeståndets dödlighet efter traditionella (hand strippar) och pneumatiska (air strippar) metoder för insamling av ägg i regnbåge och öring mätt över året.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pneumatiska metoden för insamling av ägg från fisk, även om mer tidskrävande än den traditionella metoden (hand strippar), kan säkerställa en hög kvalitet mognat oocyter (detta arbete). Detta är relaterat till den låga risken för mekaniska störningar av äggen medan du tillämpar den här proceduren. Högt pH av äggstocken vätskan, liksom en ökning i befruktning, intyga att nyttan av pneumatiska metoden. Sammantaget kan luften strippar metod för insamling av ägg i fisk reproduktion vara ett lovande alternativ när det gäller standardisering av kläckeriet protokollen, som deras ansökan inte är relaterad till den manuella kompetensen hos operatörerna.
Även om den luft lekande verkar vara ett alternativ för automatisk, hittade vi att det kan ta mer tid än manuell lekande. Denna skillnad i längd kan vara uppenbart särskilt när väl erfarna kläckeri arbetstagare tillämpa förfaranden som hand-strippar. Dock skall det påpekas att varaktigheten av lekande med hjälp av lufttryck är fortfarande tillfredsställande. ca 20 sekunder per fisk. Dessutom är effektiviteten av denna teknik inte beroende av arbetstagare erfarenhet, vilket är fallet med hand strippar metod.
Även om vi inte konstatera några skillnader mellan volymer av erhållna ägg, var skillnaderna i pH av äggstockscancer vätska uppenbar när det gäller regnbåge. Denna effekt var troligen relaterad till de Knäckta ägg, som pH är en bra indikator på detta fenomen3. Obefruktade ägg är mer mottagliga för mekanisk skada och deras motstånd ökning efter ägg aktivering under härdning tid8. Obefruktat Knäckta ägg ansvarar för lägre befruktning hos laxfiskar som rapporterats någon annanstans. Högsta försiktighet måste därför iakttas under insamling av ägg. Våra data tyder på att obefruktade ägg av regnbåge är svagare än ägg av öring. Regnbåge ägg som samlats in av hand strippar hade lägre pH och kläckning takt jämfört med dem som erhålls genom luften strippning. Detta sågs inte när det gäller öring. Våra experiment tyder på att det luft-strippning förfarandet för laxfiskar arter med mjukare ägg, kan vara fördelaktigt när det gäller efter romläggningen kvalitet.
Enskilda dödligheten bland avelsbestånd efter leken syns alltid i laxfisk kläckerier. Men är deras förekomst relaterad till både enskilda villkor och hälsoläget för fisken. Air strippar verkar vara en mild metod för insamling av ägg som fanns det ingen omfattande förluster av huden slem, en viktig barriär mot patogener från vattnet. Trots att vi inte har följt någon efter lekbeståndets mortalitet (inom en månad från lekande), visade hela året observation några förlorar fisk. När det gäller regnbåge observerat vi cirka 10% högre förluster i hand strippad grupp, medan, öring, air strippar resulterade i 15% dödlighet under året. Vi kan anta att luften strippar kan vara mer fördelaktigt för regnbåge än öring när det gäller äggkvalitet och total mortalitet av avelsbestånd.
Även om luften strippar är fördelaktigt regnbåge ägg men inte öring, vi föreslår att detta förfarande skulle vara mer standardiserade jämfört med hand strippning förfarande. I air strippar, är trycket tillämpas på magen av fisk den enda faktor som påverkar kvalitet och kvantitet av de mognade oocyter som erhållits. Användningen av denna metod i kläckerier lindrar lax ägg förluster, som huvudsakligen förekommer till följd av trasiga ägg11. Eftersom inga speciella kunskaper krävs för att genomföra förfarandet för luft-strippning, förväntar vi oss att liknande kvantitet och kvalitet av ägg kan erhållas av både skicklig och icke-kompetenta kläckeri arbetare. Vi rekommenderar air-strippning förfarande som ett lovande alternativ för nya kläckerier söker ägg insamling förfarande kännetecknas av hög reproducerbarhet och effektivitet, samt liten eller ingen erfarenhet av operatörerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Presenterade studien stöddes av projektet ”pneumatiska metoden för fisk strippar - eventuell tillämpning, påverkan på könsceller kvalitet och kvantitet och välfärd för fisk” (förkortning: PNEUFISH) finansieras ”operativa Program utveckling av the fiske Sektorn och kust områden 2007-2013 ”(OR-61724-OR1400001/10), medel disponeras till Institute of Animal reproduktion och livsmedelsforskning polska vetenskapsakademin, Olsztyn, Polen, och stöd av COST-kontoret (mat och jordbruk kostnad åtgärd FA1205: AQUAGAMETE ). Vi vill tacka, Stanley Patrik brenckert för stora stöd i engelska redigering. Vi vill erkänna också animation producenterna ”Studio Filmowe mobil Obrazki”.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycine pure P.A. | AVANTOR | 527560117 | sperm activating buffer |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | sperm activating buffer |
| Sodium chloride Bioreagent | Sigma Aldrich | S5886 | sperm activating buffer |
| Calcium chloride anhydrous | Sigma Aldrich | C4901 | sperm activating buffer |
| Propiscin (0.2% etomidate solution) | IRS Olsztyn, Poland | not indicated | |
| compressor | Thomas Sheboigan WI USA | DT/SR 070800001882 | |
| reduction valve | Camozzi | cRJUS U7J | |
| air hose | ZEC T.P.U. | SH.98 | |
| syrgine | EFD | 7012118 | |
| Air spawning stage | Biopasz, Poland | PNEU001 | |
| Orion Ross Ultra electrode | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 8102BNUWP |
References
- Nelson, J. S. Fishes of the World. , 4th, JohnWiley and Sons, Inc. Hoboken, NJ, USA. (2006).
- García-Marín, J. L., Sanz, N., Pla, C. Proportions of native and introduced brown trout in adjacent fished and unfished Spanish rivers. Conservation Biology. 12, 313-319 (1998).
- Dietrich, G. J., Wojtczak, M., Slowinska, M., Dobosz, S., Kuzminski, H., Ciereszko, A. Broken eggs decrease pH of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) ovarian fluid. Aquaculture. 273, 748-751 (2007).
- Zurbuch, P. E. A structure for easy fish recovery during drainage of an impoundment. Progressive FishCulturist. 27, 237-238 (1965).
- Cejko, B. I., et al. Effects of different stripping methods of female and activation medium on fertilization success in northern pike (Esox lucius). Czech Journal of Animal Sciences. 10, 481-486 (2016).
- Morisawa, S., Morisawa, M. Induction of potential for sperm motility by bicarbonate and pH in rainbow trout and chum salmon. Journal of Experimental Biology. 136, 13-22 (1988).
- Billard, R., Cosson, J., Perchec, G., Linhart, O. Biology of sperm and artificial reproduction in carp. Aquaculture. 129, 95-112 (1995).
- Iuchi, I., Ha, C. R., Sugiyama, H., Nomura, K. Analysis of chorion hardening of eggs of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Development Growth and Differentiation. 38, 299-306 (1996).
- Wojtczak, M. A., Kowalski, R. K., Dobosz, S., Goryczko, K., Kuźminski, H., Glogowski, J., Ciereszko, A. Assessment of water turbidity for evaluation of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) egg quality. Aquaculture. 242, 617-624 (2004).
- Tabrizi, E. N., Khara, H., Nezami, S. A., Lorestani, R., Shamspour, S. Broken Eggs Influence on Fertilization Capacity and Viability of Eggs, Turbidity and pH of Ovarian Fluid and Fertilization Water in the Endangered Caspian Brown Trout, Salmo Trutta Caspius. International Journal of Biology. 3 (1), 161-166 (2011).
- Carl, G. C. Beware of the broken egg! A possible cause of heavy losses of salmon eggs. Progresive Fish-Culturist. 53, 30-31 (1941).
