Summary
El principal objetivo de este estudio es estandarizar y probar el método neumático (air stripping) de la recogida de huevos de trucha arco iris y trucha marrón. Este método permite colección eficaz y simple de los huevos sin la necesidad de masaje de abdomen del pez.
Abstract
Colección de huevo es uno de los procedimientos más importantes durante la reproducción de peces en criaderos de salmónidos. Métodos clásicos implican el uso de masaje de la mano en el abdomen de pescado para expulsar los huevos. Un método alternativo utiliza la presión del gas inyectado en la cavidad del cuerpo, que causa la liberación de los huevos. Este método se cree que tienen efectos menos negativos sobre la calidad del bienestar y el huevo de los lotes de reproductores. En el presente, se comparan los resultados de aire y remover métodos con respecto a la supervivencia de un año y la cantidad de huevo y calidad de dos peces salmónidos, trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) y trucha (Salmo trutta morpha fario). Nuestros resultados indican air stripping rindió una mejor calidad de huevos y una mayor tasa de supervivencia de un año en trucha arco iris. Además, extracción de aire dio lugar a la menor tasa de mortalidad que el grupo sometido a la extracción de la mano (25% vs. 35%). El índice pH y eclosión del grupo mano despojado fue inferior a los del grupo de aire despojado. En el caso de la trucha, la calidad de los óvulos obtenidos por métodos de extracción de aire y mano fue similar; sin embargo, las pérdidas de un año en peces fueron superiores en aire despojado grupo (15% frente a 0% en peces de mano despojado). Aunque las ventajas de aire desmontaje método mano pelando en términos de calidad del huevo no se pueden observar en todas las especies de salmónidos, el procedimiento de extracción de aire podría ser una opción prometedora a adoptarse en los criaderos ya que asegura un alto nivel de reproducibilidad y la eficiencia.
Introduction
La trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) y trucha café (Salmo trutta morpha fario) pertenecen a la familia Salmonidae Salmoniformes1. La producción de estas dos especies en la acuicultura mundial ha ganado rápido crecimiento, debido a su importancia comercial y recreativa. En Polonia, producción de peces salmónidos se encuentra en alrededor de 20 000 toneladas, con trucha arco iris, siendo la especie dominante. Por otro lado, la trucha marrón representa una importante fuente de recursos de peces de agua dulce en Europa debido a su valor comercial en importancia para la pesca y la acuicultura. En muchos ecosistemas acuáticos, se ve amenazada la existencia de poblaciones de trucha marrón. Como resultado, reproducción artificial se ha aplicado para reponer las poblaciones locales de esta especie2.
Trucha arco iris y trucha marrón alcanzar madurez sexual generalmente en la edad de tres, con la maduración de un año antes que las hembras1machos. Bajo condiciones artificiales, óvulos y espermatozoides de trucha arco iris y trucha marrón son generalmente recogidos por masaje abdominal suave. En la práctica, en pequeña escala, un método de extracción de mano de la recogida de huevos es rentable. Sin embargo, a gran escala, el método de desmontaje a mano puede ser intensivo y agotador. Como resultado, esta técnica puede producir huevos rotos debido a la fatiga de los trabajadores del criadero. Rotura de huevos a menudo conduce a una disminución en el pH del fluido ovárico y el lanzamiento de yema de huevo, los cuales afectan negativamente a la fecundación de huevos3. Además, este método tradicional de colección de huevo (pulsando del abdomen) puede resultar también en reproductores mortalidad causada por la infección de la piel asociada con el deterioro de la barrera protectora de moco.
Método neumático de colección de huevo fue utilizado primero en Australia en 19574. El método se basa en la inyección de gases (aire, nitrógeno u oxígeno) en la cavidad del cuerpo para expulsar huevos usando la presión del gas. Esta técnica rápida y fácil se ha aplicado con éxito en peces salmónidos sin efectos secundarios negativos en los peces4. Recientemente, este método fue utilizado en especies silvestres (Lucio, Esox lucius) para recoger huevos maduros en condiciones artificiales5. Fue demostrado que aire despojado huevos tuvieron mayor fertilización y eclosión tarifas en comparación con mano despojado huevos, independientemente de la solución utilizada para fertilización (solución Woynarovich, Billard buffer o criadero agua)5.
El principal objetivo de este estudio era poner a prueba el método neumático (air stripping) de la recogida de huevos de trucha arco iris y trucha marrón en comparación con el tradicional método de desmontaje de la mano. Se compararon la eficacia de ambos métodos (volumen de huevos obtenidos) y el tiempo de colección, calidad de gametos (pH líquido ovárico), así como la eclosión posterior desove y tasa de mortalidad.
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Protocol
Los procedimientos fueron realizados según el Comité sobre el ética de los experimentos animales en Olsztyn, Polonia.
1 preparación de equipo
- Utilice una jeringa y aguja para la inyección del gas en la cavidad del cuerpo del pescado.
- La presión del gas en 0,5 bar y mantener esta presión por debajo de 1 bar a lo largo.
- Controlar el flujo de aire. Para los peces salmónidos, 1,5 L/min es la velocidad más eficiente de agotamiento de gas. Mantener la velocidad óptima porque velocidad no puede obtener todos los huevos, mientras que una velocidad más lenta puede prolongar innecesariamente el procedimiento.
- Conectar la jeringa con una aguja roscada (0.8-1.2 mm de diámetro) para evitar separación de aguja, causada por la presión del gas.
2. aire de desove
- Anestesiar el pez con 0,2% Propiscin. Coloque el pescado en un baño de agua con el 0.2% Propiscin y espere hasta que el pescado deja de responder.
- Secarse cuidadosamente antes de desove con un paño de algodón seco.
- Coloque el pescado en la cama de la inclinación de 35-40°, en su lado de la cola hacia abajo. Con un suave empuje del abdomen del pez, compruebe el flujo de huevos en el tracto genital. Si los huevos no están presentes, el pescado no debe ser generado.
- Coloque un recipiente cubierto con el acoplamiento debajo de la papila de peces a recoger los huevos.
- Inserte rápidamente la aguja por debajo de las aletas abdominales.
- Libremente, retirar los huevos por el gas hasta que sólo singular huevos se extraen del cuerpo de los pescados.
- Masajee suavemente el abdomen para eliminar el exceso de gas del cuerpo de los pescados.
- Después del desove, transferir suavemente el pez a un tanque con el flujo de agua. Peces liberados al tanque después aire de desove puede nadar inicialmente en la superficie del agua. Después de varios minutos el pescado libera el gas restante mientras nadas y comienza a nadar normalmente.
Nota: Los huevos obtenidos son muy limpios y libres de contaminación de la sangre o las heces.
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Representative Results
Los machos maduros y las hembras de trucha arco iris (edad 2 +, 1700 ± g 328) y trucha (edad 3 +, 1900 ± 435 g) se obtuvieron del criadero de peces salmónidos (Rutki-Żukowo, interior pesquería Instituto en Olsztyn, Polonia). Los machos y las hembras se colocaron en tanques separados con un volumen de aproximadamente 5 m3. La temperatura del agua era 12±1 ° C. Antes de manipulación, los peces fueron anestesiados con 0,2% Propiscin. Los peces fueron divididos en dos grupos. Parte de ellos experimentó un método tradicional para obtener huevos, es decir, la presión abdominal (n = 20). Los grupos restantes experimentaron el procedimiento neumático con el uso de aire (n = 20). Huevos de cada hembra se colectaron por separado y colocan en recipientes de plástico seco.
Durante parte de los huevos, el pescado fue primero limpiar con un paño seco mientras sostiene el pez por su parte, la cola hacia abajo. La duración de la freza se midió a partir del punto donde el operador tiene el pescado y tampoco iniciar presionando el abdomen o inyectar la aguja. El punto final se fijó en el tiempo cuando huevos dejan de fluir a la taza. Para pelar de la mano, un trabajador calificado fue elegido para realizar el experimento entero, y se llevó a cabo el procedimiento de desmontaje de aire por otro trabajador calificado.
Durante el procedimiento, el volumen de los huevos obtenidos se midió utilizando una probeta y el líquido ovárico fue recogido por separado de cada espécimen hembra. Después de eso, su nivel de pH se analizó utilizando un electrodo de pH. Peces reproductores utilizados en nuestros experimentos se marcaron con etiquetas de transpondedor integrados pasivos (PIT). Etiquetado nos ha permitido observar la tasa de mortalidad en cada grupo de peces.
Inmediatamente después de la colección, cada muestra se sometió a la fertilización. Esperma para la fertilización fue recogida sobre 10 minutos antes de que desove y almacenada diluido en Morisawa solución6 (0,1 M NaCl, KCl, 0,003 M CaCl2, 0,0015 M MgCl2 x 6 H2O de 0,04 M, 0,05 M Tris, pH 8,5), en la proporción 1:9 a 4 ° C. Se utilizó la mezcla de esperma obtenida de cuatro truchas arco iris o trucha marrón machos respectivamente.
Eclosión es la medida más adecuada de la calidad del huevo, huevos de trucha arco iris y trucha marrón obtienen a mano y métodos extracción neumáticos se sometieron a la fertilización. Huevos fueron fertilizados con unos 100.000 espermatozoides por óvulo, con cerca de 100 huevos de cada hembra enraícen. Se midieron las concentraciones de esperma en la cámara de Bürker después esperma soluciones fueron diluidas 1:2000 con 0.7% NaCl. Huevos se fertilizan con los espermatozoides en 5 mL de la solución de Billard (0,125 M NaCl, tampón de Tris de 0,002 M, glicina de 0,003 M y 0,001 mM de CaCl2, pH 9.0) para cada variante7. Se realizaron dos repeticiones por cada muestra de huevos. Tres minutos después de la fertilización, las muestras de huevo cuidadosamente se lavaron dos veces en el agua de criadero. Huevos se colocan en una rejilla especial, colocando cada variante experimental por separado. Los huevos fertilizados se colocaron en incubadoras a 8 ° C y se determinó el número de huevos con ojos unas cuatro semanas más tarde. El porcentaje de huevos eclosionados se determinó según la fórmula: (huevos que fueron fecundados x 100%) / (todos los huevos en la variante concreta).
Las diferencias entre los tratamientos experimentales se determinaron con pruebas de t pareadas a un nivel de significancia P < 0.05. Los datos expresados en porcentaje se transforman usando arco-sin transformación antes del análisis estadístico. Los análisis estadísticos se realizaron con el software GraphPad Prism.
La colección de huevo a mano pela método fue más breve (aproximadamente 10 s.) en comparación con aire extracción método en ambas especies (figura 1; P < 0.05). Los métodos (tradicionales o neumático) de desmontaje no tenía una influencia en el volumen de los huevos obtenidos de hembras de trucha arco iris y trucha marrón (figura 2). PH líquido ovárico en trucha arco iris después de mano pelar 7.6, mientras que en el aire, método de extracción, el pH se incrementó a 8.0 (figura 3; P < 0.05). Sin embargo, independientemente de los métodos de colección de huevo, el pH líquido ovárico en trucha marrón fue afectado (figura 2). En trucha arco iris, la tasa de eclosión fue significativamente mayor (figura 4; P < 0.05) en huevos de aire despojado que en huevos de pelado a mano. El porcentaje de mortalidad fue mayor después de stripping con aire desmontaje en trucha arco iris a mano. Sin embargo, en trucha, porcentaje de mortalidad fue mayor (15%) en huevos de aire despojado que en huevos de pelado a mano (tabla 1).
Figura 1 . Tiempo de desmontaje después de tradicional (mano pelando) y neumático (air stripping) método de colección de huevos de trucha arco iris y trucha marrón. Significación estadística se indica mediante asteriscos que representa P-valor (*** P < 0,001), barras de error indican SD (n = 20). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . El volumen de los huevos obtenidos después de la tradicional (mano pelando) y neumático (air stripping) métodos de colección de huevo en trucha arco iris y trucha marrón. Barras de error indican SD (n = 20). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . PH líquido ovárico después de la tradicional (mano pelando) y neumático (air stripping) métodos de colección de huevo en trucha arco iris y trucha marrón. Significación estadística se indica mediante asteriscos que representa P-valor (*** P < 0,001), barras de error indican SD (n = 20). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Porcentaje de eclosión después de la tradicional (mano pelando) y neumático (air stripping) métodos de colección de huevo en trucha arco iris y trucha marrón. Significación estadística se indica mediante asteriscos que representa P-valor (** P < 0.01)., barras de error indican SD (n = 20). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Especies | Método de colección de huevo | |
| Desmontaje de la mano | Extracción de aire | |
| Trucha arco iris | 35 | 25 |
| Trucha marrón | 0 | 15 |
Tabla 1. Porcentaje de mortalidad post desove después tradicional (mano pelando) y neumático (air stripping) métodos de colección de huevo en trucha arco iris y trucha marrón medida más de un año.
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Discussion
El método neumático de la colección de huevos de peces, aunque más lento que el método tradicional (extracción de la mano), pueden garantizar una alta calidad de los ovocitos madurados (este trabajo). Esto se relaciona con el bajo riesgo de interrupción mecánica de los huevos mientras se aplica este procedimiento. PH alto del fluido de ovario, así como un aumento en la tasa de fertilización, avalan la utilidad del método neumático. En general, el aire extracción método de colección de huevo en la reproducción de peces podría ser una opción promisoria en términos de estandarización de los protocolos de criadero, pues su aplicación exitosa no está relacionada con la excelencia manual de los operadores.
Aunque el desove del aire parece ser una opción automática, se encontró que podría tomar más tiempo que el desove manual. Esta diferencia en la duración puede ser obvio, especialmente cuando criadero bien experimentados trabajadores aplicarán procedimientos de desmontaje a mano. Sin embargo, debe ser acentuado que la duración de desove con el uso de presión de aire es todavía satisfactoria. unos 20 segundos por pescado. Además, la eficacia de esta técnica no es dependiente en la experiencia de los trabajadores, como es el caso con la mano pela método.
Aunque no observamos diferencias entre volúmenes de huevos obtenidos, las diferencias en el pH del fluido ovárico fueron evidentes en el caso de la trucha arco iris. Este efecto fue más probablemente relacionado con los huevos rotos, como el pH es un buen indicador de este fenómeno3. Huevos no fertilizados son más susceptibles a daños mecánicos y el aumento de la resistencia después de la activación del huevo durante el endurecimiento del tiempo8. No fecundados los huevos rotos son responsables de menores tasas de fertilización en los salmónidos como divulgado a otra parte. Por lo tanto, se debe tener máximo cuidado durante la recogida del huevo. Nuestros datos sugieren que los huevos no fertilizados de trucha arco iris son más débiles que huevos de trucha. Huevos de trucha arco iris recopilados mano pelando tenían menor pH y eclosión tasa en comparación con los obtenidos por extracción de aire. Esto no fue visto en el caso de la trucha. Nuestros experimentos indican que para las especies de salmónidos con huevos más suaves, el procedimiento de extracción de aire podría ser beneficioso en términos de calidad de post desove.
Mortalidad individual de los reproductores después del desove siempre está visible en los criaderos de peces salmónidos. Sin embargo, su ocurrencia se relaciona con cada condición y estado de salud de los peces. Desmontaje de aire parece ser un método suave de colección de huevo ya que no había ninguna pérdida masiva de la mucosa de la piel, una barrera importante contra agentes patógenos del agua. A pesar de que no observamos ninguna mortalidad post desove (dentro de un mes de desove), observación de todo el año mostró algunas pérdidas de pescado. En el caso de la trucha arco iris, observamos alrededor de 10% mayor pérdidas en mano desnudaron de grupo, mientras que en trucha, extracción de aire dio lugar a 15% de mortalidad durante el año. Podemos suponer que la extracción de aire podría ser más beneficiosa para la trucha de arco iris que la trucha en términos de calidad del huevo y mortalidad de los reproductores.
Aunque air stripping es beneficioso a los huevos de trucha arco iris pero no a la trucha, nos sugieren que este procedimiento puede ser más estandardizado en comparación con el procedimiento de desmontaje a mano. Extracción de aire, la presión sobre el abdomen de los peces es el único factor que afecta la calidad y cantidad de los ovocitos maduros obtenidos. El uso de este método en los criaderos alivia pérdidas de huevos de salmón, que principalmente se producen como resultado huevos rotos11. Puesto que ningunas habilidades especiales se requieren para llevar a cabo el procedimiento de extracción de aire, esperamos que similar cantidad y calidad de huevos pueden obtenerse por los trabajadores cualificados y no cualificados de la incubadora. Recomienda el procedimiento de extracción de aire como una opción promisoria para nuevos criaderos buscando procedimiento de colección de huevo caracterizada por alto nivel de reproducibilidad y eficiencia, así como poca o ninguna experiencia de los operadores.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El estudio presentado fue apoyado por el proyecto "método neumático de extracción de peces - posible aplicación, influencia en la calidad de los gametos y la cantidad y el bienestar de los peces" (acrónimo: PNEUFISH) financiados por "operativa programa de desarrollo de la pesca Sector y áreas de la costa 2007-2013"(OR-61724-OR1400001/10), fondos asignados al Instituto de reproducción Animal y la investigación de alimentos Academia de Ciencias, Olsztyn, Polonia y la ayuda por gastos de oficina (de alimentos y agricultura costo acción FA1205: AQUAGAMETE ). Nos gustaría dar las gracias, Stanley Ifeanyi Ugwu por gran apoyo en la edición de inglés. Queremos agradecer también a los productores de animación "Estudio Filmowe Ruchome Obrazki".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycine pure P.A. | AVANTOR | 527560117 | sperm activating buffer |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | sperm activating buffer |
| Sodium chloride Bioreagent | Sigma Aldrich | S5886 | sperm activating buffer |
| Calcium chloride anhydrous | Sigma Aldrich | C4901 | sperm activating buffer |
| Propiscin (0.2% etomidate solution) | IRS Olsztyn, Poland | not indicated | |
| compressor | Thomas Sheboigan WI USA | DT/SR 070800001882 | |
| reduction valve | Camozzi | cRJUS U7J | |
| air hose | ZEC T.P.U. | SH.98 | |
| syrgine | EFD | 7012118 | |
| Air spawning stage | Biopasz, Poland | PNEU001 | |
| Orion Ross Ultra electrode | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 8102BNUWP |
References
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