يصف لنا منصة تحليل الحمض النووي الريبي نقل الأصلي المسمى بقعة (منهاج مبسط لمراقبة الحمض الريبي النووي النقال). بقعة في الوقت ذاته تدابير الخلوية مستويات ترنس جميع العينات البيولوجية وفي ثلاث خطوات فقط، وفي أقل من 24 ساعة.
نقل الكشف (الحمض الريبي النووي النقال) هي وفيرة قصيرة غير الترميز الحمض النووي الريبي الأنواع التي تكون عادة من 76 إلى 90 النيوكليوتيدات في الطول. ترناس مسؤولة مباشرة عن تخليق البروتين بترجمة codons في مرناً في تسلسل الأحماض الأمينية. واعتبرت ترنس طويلة كبيت حفظ الجزيئات التي تفتقر إلى الوظائف التنظيمية. بيد أن مجموعة متزايدة من الأدلة تشير إلى أن مستويات الحمض الريبي النووي النقال الخلوي تتقلب في المراسلات لظروف مختلفة مثل نوع الخلية، والبيئة، والإجهاد. تقلب التعبير الحمض الريبي النووي النقال يؤثر تأثيراً مباشرا ترجمة الجينات، تفضل أو قمع التعبير عن البروتينات خاصة. في نهاية المطاف فهم دينامية تخليق البروتين يتطلب تطوير أساليب قادرة على تقديم لمحات الحمض الريبي النووي النقال عالية الجودة. الطريقة التي نقدم هنا يسمى البقعة، التي تقف على “منصة مبسطة” لمراقبة الحمض الريبي النووي النقال. بقعة يتكون من ثلاث خطوات بدءاً بوسم الأيضية للثقافات الخلية مع الديامونيوم المشعة، تليها جوانيدينيوم ثيوسيانات-الفينول-كلوروفورم استخراج الكشف الإجمالي المشعة وأخيراً طبع التهجين في المنزل ماكروارايس. وتقدر مستويات الحمض الريبي النووي النقال بقياس كثافة النشاط الإشعاعي في كل بقعة التحقيق. في البروتوكول المعروضة هنا لنا صورة ترنس في بكتريا سميجماتيس mc2155، nonpathogenic بكتيريا غالباً ما تستخدم ككائن نموذج لدراسة مرض السل.
وتتقلب مستويات الحمض الريبي النووي النقال الخلوي وفقا لظروف مثل نوع الخلية، والبيئة، والإجهاد1،،من23. بقعة، “منهاج مبسط” لمراقبة الحمض الريبي النووي النقال، هو الأصلي، ويمكن الاعتماد عليها، وتقنية واضحة تسمح الكمي سريع ودقيق لمستويات نقل الجيش الملكي النيبالي في الكائنات الحية التي نمت في المختبر.
وقد ترناس استقرارا ملحوظا هياكل التعليم الثانوي والتعليم العالي4. كما أنها تعرض العديد من التعديلات بوستترانسكريبشونال5. وتمثل هذه الميزات الهيكلية الكبيرة وحواجز التسلسل يتحامل أو في بعض الأحيان منع التنميط الحمض الريبي النووي النقال المباشر واستنساخه باستخدام تقنيات القياس الكمي المعيار القياسي رنا6. المجموعات البحثية العالم اضطر إلى تطوير التقنيات الإبداعية ولكن غالباً معقدة لتقييم مستويات الحمض الريبي النووي النقال الخلوي. وتشمل بعض هذه الطرق: فصل ترناس أيضي المسمى الغرواني الكهربي ثنائي الأبعاد (1) جنبا إلى جنب مع منهجية الإحالة بقعة بوصمة عار شمال1؛ (2) القياس الكمي الفردية بالشمالية لطخة استخدام موحدة بعناية المشعة الحمض النووي المسابير7؛ (3) بعد استخراج العلامات مع فلوروتشروميس سينين تليها ميكرواري تحليل3، و (4) في المختبر تجريد تعديلات الحمض الريبي النووي النقال باستخدام الإنزيمات ديموديفيكيشن المؤتلف جنبا إلى جنب مع النسخ العكسي واللاحقة 8من التسلسل الفائق.
بقعة تركيبة بسيطة والاصلي من النهجين موحدة وواضحة: هيئة الجيش الملكي النيبالي (1) وضع العلامات، الذي يتكون في التوليف، في نمو الكائنات الحية، المشعة الكشف التام والحمض الريبي النووي النقال (2) ماكروارايس، أداة منهجية والمنمنمة الجينوم الأمثل لعزل الحمض الريبي النووي النقال.
نماذج مبسطة من الكائنات الحية إلى منصة التقدير الكمي. ويتم تحليل مباشرة بعد استخراج، ولم تتم معالجة أي المزيد مما يحد بشكل كبير التحيزات مقارنة بالتقنيات التي تتطلب استخراج بعد التضخيم أو علاجات الانزيمية. بقعة تنوعاً ويمكن دمجها بسهولة لوجود بوليسومي لتحديد وتقدير حجم الحمض الريبي النووي النقال الفئات السكانية الفرعية المرتبطة فعلياً بترجمة ريبوسوم.
البروتوكول المعروضة هنا هو الأمثل بكتريا سميجماتيس، وأنها استخدمت أيضا بنجاح في ترنس الشخصية في الإشريكيّة القولونية9 Saccharomyces cerevisiae10، والماوس، والثقافات الخلية البشرية11 .
انبعاثات جسيمات بيتا معروفة وكلاء والاريثروسين وجراثيم14، بيد أن الإشعاعات في نطاق اختبار لا تأثير كبير على الخلية اللياقة البدنية. عد التﻷلؤ أظهرت أن إدماج النشاط الإشعاعي في 25 في المائة من مجموع الخلية مقتطفات وفي وقت لاحق، 1% من الكشف الكامل المنقي.
المسابير أحجام متطابقة ودرجة حرارة ذوبان قابلة للمقارنة ومحتوى GC، جنبا إلى جنب مع بروتوكول موحد لاكتشاف ماكرواراي، يسمح التهجين والتحديد الكمي لقياس مستويات الحمض الريبي النووي النقال مباشرة من إشارات موضعية غير متحيزة.
بقعة استنساخه ومحددة. في مجموعة دينامية كبيرة وقابل للتعديل بسهولة عتبة يسمح التنميط الأنواع وفيرة منخفضة، مثل ترنس المرتبطة بوليسوميس، ببساطة عن طريق إطالة الصفيف التعرض مرات9. بعد الاستثمارات الأولية للمعدات اللازمة، المتوسطات إدارة التكلفة لكل عينة، بما في ذلك المواد الاستهلاكية، 15 دولار كل العينات.
بقعة ينطبق على أي كائن حي المجين الذي يتوفر لتصميم التحقيق. نموذج الكائنات الحية التي تزرع في المختبر بالمرشحين المثالي لوسم الأيضية. كما ترميز الجينوم الثدييات غالباً العديد من إيسوديكوديرس (ترناس أن حصة أنتيكودونس متطابقة ولكن عرض الاختلافات الصغيرة في تسلسل هذه الهيئة) يلزم المسابير تحولت جزئيا الحفاظ على التهجين متجانس وثيق الحمض الريبي النووي النقال الأنواع. وأخيراً، تعطي خلايا الثدييات ملتصقة كميات أقل عادة من الحمض النووي الريبي مجموع الكائنات الحية التي نمت في تعليق مثل م. سميجماتيس، حيث الثقافات بحاجة إلى الارتقاء إلى حد كبير بالمقارنة مع.
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل بمنحه “إينبري اتفاقية استكهولم” من المعهد الوطني للعامة الطبية العلوم-المعاهد الوطنية للصحة (P20GM103499 للنمو الحقيقي) ويمنح CA555536 & CA154664 من المعهد الوطني للسرطان ل P.H.H. هذا البرنامج كان دعما جزئيا بمنحه لكلية تشارلستون من معهد هوارد هيوز الطبي من خلال كلية قبل & برنامج تعليم العلوم الجامعية والمنح المقدمة من المركز الوطني “بحوث الموارد” (5 P20 RR016461) وفي المعهد الوطني للعامة الطبية العلوم (8 P20 GM103499) من المعاهد الوطنية للصحة.
Glass slide indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 470 | |
Glass slide arrayer replicator | V&P Scientific, Inc. | VP 478 | |
96 well microplate indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 472 | |
Wash and blot station | V&P Scientific, Inc. | VP 475 | |
Replicator pin dryer | V&P Scientific, Inc. | VP 474 | |
Amine coated slides | Molecular Devices | K2615 | |
Hybridizer / Automated hybridization and washing station | Digilab | Hyb10022 | |
Shaker incubator | Eppendorf Themomixer | 05-400-200 | |
Screw cap 2 ml tubes | Thermo Scientific | 21-403-201 | |
[32P] Na2HPO4 | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (Trizol) | Invitrogen | 15596026 | |
0.5 mm glass beads | Research Products International Corp. | 9831 | |
Mini bead mill | VWR | 25-020 | |
Storage phosphore screen | Fujifilm | BAS-IP SR 0813 | |
Phosphorimager | GE Healthcare | Typhoon FLA7000 | |
DNA oligonucleotides | IDT | N/A | |
UV crosslinker | Spectroline | Select series 254 nm | |
Microarray centrifuge | Arrayit Corporation | MHC110V | |
Mycobacterium smegmatis | ATCC | 700084 | |
Single-use needles | BD (Becton Dickinson) | 305185 | |
2 ml centrifuge tube | Fisherbrand | 14-666-317 | |
Precipitant (GlucoBlue) | Invitrogen | AM9516 | |
7H9 broth | Difco | 271310 | |
Chloroform | Fisher Chemicals | C298-500 | |
Isopropanol | Fisher Chemicals | A451-4 | |
20 X SSC | Lonza | 51205 | |
SDS | Fisher Bioreagents | BP166-100 | |
hybridisation cassette | GE Healthcare | 63-0035-44 | |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
Tween 80 | Amresco | M126-100ML | |
NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
Albumin | Spectrum Chemicals | A3611 | |
Dextrose | Fisher Chemicals | D16-1 | |
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid) | Fisher Bioreagents | BP2482-500 | |
0.5 M Phosphate buffer pH 7.2 | Alfa Aesar | AAJ63974AP |