We beschrijven een originele transfer-RNA analyse platform genaamd SPOt (gestroomlijnde Platform voor de waarneming van tRNA). Ter plaatse gelijktijdig maatregelen cellulaire niveaus van alle tRNAs in biologische monsters, in slechts drie stappen en in minder dan 24 uur.
Overdracht RNAs (tRNA) zijn overvloedige korte niet-coderende RNA soorten die meestal 76 tot 90 nucleotiden in lengte zijn. tRNAs zijn direct verantwoordelijk voor eiwitsynthese door het vertalen van codonen in mRNA in aminozuur sequenties. tRNAs werden lang beschouwd als huis-keeping moleculen die ontbrak regelgevende taken. Een groeiend lichaam van bewijsmateriaal blijkt evenwel dat cellulaire tRNA niveaus in correspondentie aan wisselende omstandigheden zoals celtype, milieu, en stress schommelen. De schommeling van tRNA meningsuiting beïnvloedt direct gene vertaling, ten gunste van of het onderdrukken van de expressie van bepaalde eiwitten. Uiteindelijk begrijpen de dynamiek van de eiwitsynthese, vereist de ontwikkeling van methoden kunnen leveren kwalitatief hoogwaardige tRNA profielen. De methode die wij hier presenteren heet de plek, die voor gestroomlijnde Platform for Observing tRNA staat. Plek bestaat uit drie stappen beginnen met metabole labeling van celculturen met radioactieve ORTHOFOSFAAT, gevolgd door guanidinium kaliumthiocyanaat-fenol-chloroform extractie van radioactieve totale RNAs en ten slotte hybridisatie op in-house afgedrukt macroarrays. tRNA niveaus worden geschat door het kwantificeren van de intensiteiten van de radioactiviteit op elke plek van de sonde. In het protocol hier gepresenteerde profileren we tRNAs in Mycobacterium smegmatis mc2155, een nonpathogenic bacterie vaak gebruikt als een modelorganisme bij het bestuderen van tuberculose.
Cellulaire tRNA niveaus schommelen volgens voorwaarden zoals celtype, milieu en stress1,2,3. Plek, gestroomlijnde Platform voor de waarneming van tRNA, is een origineel, betrouwbaar, en eenvoudige techniek waarmee snelle en precieze kwantificering van transfer-RNA niveaus in laboratorium gekweekte organismen.
tRNAs zijn opmerkelijk stabiel secundaire en tertiaire structuren4. Talrijke post-transcriptional wijzigingen5worden deze ook weergegeven. Deze eigenschappen vertegenwoordigen aanzienlijke structurele en volgorde wegblokkades vertekenende of soms voorkomen van directe en reproduceerbare tRNA profielen met behulp van standaard benchmark RNA kwantificering technieken6. Onderzoeksgroepen over de hele wereld werden gedwongen om creatief, maar vaak ingewikkelde technieken om te evalueren van de cellulaire tRNA niveaus te ontwikkelen. Enkele van deze methoden omvatten: (1) twee-dimensionale elektroforetische scheiding van metabolisch gelabelde tRNAs gecombineerd met methodische plek toewijzing door noordelijke vlek1; (2) individuele kwantificering door Noord vlek met behulp van zorgvuldig gestandaardiseerde radioactieve DNA sondes7; (3) na extractie labelen met cyanine fluorochromes gevolgd door microarray analyse3, en (4) in vitro strippen van tRNA wijzigingen met behulp van recombinant demodification enzymen gecombineerd met omgekeerde transcriptie en de daaropvolgende High-throughput sequencing8.
Plek is een eenvoudige en originele combinatie van twee standaard en ongecompliceerd methoden: (1) RNA lichaam etikettering, die in de synthese bestaat, in het kweken van organismen, van radioactieve totale RNAs en tRNA (2) macroarrays, een systematische en verkleinde genomic tool geoptimaliseerd voor tRNA segregatie.
Monsters worden naar het platform van de kwantificering van levende organismen gestroomlijnd. Ze direct na extractie worden geanalyseerd en niet verwerkt geen verdere waardoor vooroordelen ten opzichte van technieken waarvoor na extractie versterking of enzymatische behandelingen aanzienlijk wordt beperkt. SPOt is veelzijdig en gemakkelijk kan worden gecombineerd tot Polysoom fractionering te identificeren en kwantificeren van tRNA subpopulaties die fysiek verbonden met het vertalen van ribosomen zijn.
Het protocol hier gepresenteerd is geoptimaliseerd voor Mycobacterium smegmatis, en het werd ook met succes gebruikt om profiel tRNAs in Escherichia coli9, Saccharomyces cerevisiae10muis en menselijke celculturen11 .
Beta deeltjesemissies zijn bacteriostatische en bactericide agenten14, bekend maar straling in het geteste bereik geen significant effect op de geschiktheid van de cel hebben. Scintillatie tellen toonde aan dat de radioactiviteit in 25% van de totaal-cel extracten en vervolgens 1% van gezuiverde totale RNAs wordt opgenomen.
De sondes identiek maten, vergelijkbare smelttemperatuur en GC inhoud, samen met een uniform protocol voor het spotten van de macroarray, hybridisatie en kwantificering voorziet onbevooroordeelde meting van tRNA niveaus rechtstreeks vanuit plek signalen.
Plek is reproduceerbaar zijn en specifieke. Zijn groot dynamisch bereik en makkelijk instelbaar drempel kunt profilering lage overvloedige soorten, zoals tRNAs gekoppeld aan polysomes, simpelweg door het verlengen van matrix blootstelling keer9. Na de initiële investering voor de benodigde apparatuur, het verloop kost per monster, met inbegrip van verbruiksgoederen, gemiddeld $15 per monsters.
Plek is van toepassing op elk organisme waarvan genoom beschikbaar voor sonde ontwerp is. Modelorganismen die worden gekweekt in vitro zijn ideale kandidaten voor het labelen van metabole. Zoals zoogdieren genoom coderen vaak vele isodecoders (tRNAs die delen van identieke anticodons maar weer kleine verschillen in hun lichaam sequenties) moeten sondes gedeeltelijk gedegenereerd voor het behoud van homogene hybridisatie nauwe tRNA-soorten. Ten slotte opbrengst aanhangend zoogdiercellen doorgaans lagere bedragen van de totale RNA in vergelijking met organismen gegroeid in suspensie zoals M. smegmatis, dus culturen moeten aanzienlijk worden opgeschaald.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door een subsidie van de SC INBRE van het nationale Institute of General Medical Science – NIH (P20GM103499 naar R.G.) en grants CA555536 en CA154664 van het National Cancer Institute te P.H.H. Dit programma was deels gesteund door een subsidie naar het College van Charleston van het Howard Hughes Medical Institute via de pre college & Undergraduate Science Education Program en door subsidies van het National Center voor onderzoeksmiddelen (5 P20 RR016461) en het National Institute of General Medical Sciences (8 P20 GM103499) van de National Institutes of Health.
Glass slide indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 470 | |
Glass slide arrayer replicator | V&P Scientific, Inc. | VP 478 | |
96 well microplate indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 472 | |
Wash and blot station | V&P Scientific, Inc. | VP 475 | |
Replicator pin dryer | V&P Scientific, Inc. | VP 474 | |
Amine coated slides | Molecular Devices | K2615 | |
Hybridizer / Automated hybridization and washing station | Digilab | Hyb10022 | |
Shaker incubator | Eppendorf Themomixer | 05-400-200 | |
Screw cap 2 ml tubes | Thermo Scientific | 21-403-201 | |
[32P] Na2HPO4 | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (Trizol) | Invitrogen | 15596026 | |
0.5 mm glass beads | Research Products International Corp. | 9831 | |
Mini bead mill | VWR | 25-020 | |
Storage phosphore screen | Fujifilm | BAS-IP SR 0813 | |
Phosphorimager | GE Healthcare | Typhoon FLA7000 | |
DNA oligonucleotides | IDT | N/A | |
UV crosslinker | Spectroline | Select series 254 nm | |
Microarray centrifuge | Arrayit Corporation | MHC110V | |
Mycobacterium smegmatis | ATCC | 700084 | |
Single-use needles | BD (Becton Dickinson) | 305185 | |
2 ml centrifuge tube | Fisherbrand | 14-666-317 | |
Precipitant (GlucoBlue) | Invitrogen | AM9516 | |
7H9 broth | Difco | 271310 | |
Chloroform | Fisher Chemicals | C298-500 | |
Isopropanol | Fisher Chemicals | A451-4 | |
20 X SSC | Lonza | 51205 | |
SDS | Fisher Bioreagents | BP166-100 | |
hybridisation cassette | GE Healthcare | 63-0035-44 | |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
Tween 80 | Amresco | M126-100ML | |
NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
Albumin | Spectrum Chemicals | A3611 | |
Dextrose | Fisher Chemicals | D16-1 | |
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid) | Fisher Bioreagents | BP2482-500 | |
0.5 M Phosphate buffer pH 7.2 | Alfa Aesar | AAJ63974AP |