Nous décrivons une plateforme d’analyse ARN de transfert original nommée SPOt (plateforme simplifiée pour l’observation des ARNt). SPOt mesure simultanément les concentrations cellulaires de tous les ARNt dans des échantillons biologiques, en seulement trois étapes et en moins de 24 heures.
ARN de transfert (ARNt) sont abondantes court non codantes d’ARN qui sont typiquement de 76 à 90 nucléotides de long. ARNt est directement responsables de la synthèse des protéines par la traduction des codons de l’ARNm dans les séquences d’acides aminés. ARNt ont été longtemps considérée comme molécules ménager qui ne disposaient pas de fonctions de réglementation. Toutefois, un nombre croissant de preuves indique que les concentrations cellulaires de tRNA fluctuent en correspondance de diverses conditions telles que le type de cellule, environnement et le stress. La fluctuation de l’expression de l’ARNt influence directement la traduction de gène, favorisant ou de réprimer l’expression des protéines particulières. Finalement comprendre la dynamique de la synthèse des protéines nécessite le développement de méthodes capables de fournir des profils de tRNA de haute qualité. La méthode que nous vous présentons ici est nommée place, ce qui signifie simplifiée Platform for Observing ARNt. Place se compose de trois étapes qui commence par un marquage métabolique de cultures cellulaires avec radioactif orthophosphate, suivie d’extraction thiocyanate-phénol-chloroforme guanidinium d’ARN total radioactifs et enfin imprimé hybridation sur interne macroréseaux. niveaux d’ARNt sont estimés par quantifier les intensités de radioactivité à chaque endroit de la sonde. Dans le protocole présenté ici nous vous présentons des ARNt à Mycobacterium smegmatis mc2155, une bactérie non pathogène, souvent utilisée comme un organisme modèle pour étudier la tuberculose.
Les concentrations cellulaires de tRNA fluctuent en fonction des conditions telles que le type de cellule, l’environnement et stress1,2,3. SPOt, plateforme simplifiée pour l’observation des ARNt, est un original, fiable et une technique simple qui permet la quantification rapide et précise des niveaux d’ARN de transfert dans les organismes cultivés en laboratoire.
ARNt ont remarquablement stables structures secondaires et tertiaires,4. Elles affichent également les nombreuses modifications post-transcriptionnels5. Ces caractéristiques représentent structurels importants et barrages de séquence polarisation ou empêchant parfois directe et reproductible tRNA profilage à l’aide de la norme standard RNA quantification techniques6. Groupes de recherche du monde entier ont dû développer des techniques créatives mais souvent alambiquées pour évaluer les concentrations cellulaires de tRNA. Certaines de ces méthodes comprennent : (1) séparation par électrophorèse bidimensionnelle des ARNt métaboliquement marqués combinés avec affectation spot méthodique par Northern blot1; (2) individuelle quantification par Northern blot utilisant soigneusement normalisée radioactifs sondes ADN7; (3) après extraction d’étiquetage avec les fluorochromes cyanine suivie de microarray analysis3et (4) in vitro se déshabillant des modifications ARNt à l’aide d’enzymes recombinantes demodification combinées avec la transcription inverse et suivantes séquençage haut-débit8.
SPOt est une combinaison simple et originale de deux approches standards et simples : corps RNA (1), étiquetage, qui consiste dans la synthèse, en croissance d’organismes, d’ARN total radioactifs et ARNt (2) macroréseaux, un outil génomique systématique et miniaturisé optimisé pour la ségrégation de l’ARNt.
Les échantillons sont simplifiés d’organismes vivants à la plate-forme de la quantification. Ils sont analysés directement après extraction et pas traitement pas plus qui limite considérablement les préjugés par rapport aux techniques nécessitant une extraction après amplification ou traitements enzymatiques. SPOt est polyvalent et peut être facilement combiné au fractionnement de polysome pour identifier et quantifier des sous-populations de tRNA physiquement associés à traduire des ribosomes.
Le protocole présenté ici est optimisé pour Mycobacterium smegmatis, et on l’utilisait aussi avec succès à profil ARNt dans Escherichia coli9, Saccharomyces cerevisiae10, souris et cultures de cellules humaines11 .
Les émissions de particules bêta sont connues des agents bactériostatiques et bactéricides14, cependant les rayonnements dans la gamme testée n’ont aucun incidence significative sur l’aptitude de la cellule. Comptage par scintillation a montré que la radioactivité est incorporée dans 25 % des extraits de cellules total et par la suite, 1 % d’ARN total purifiée.
Des sondes tailles identiques, température de fusion comparable et contenu en GC, ainsi qu’un protocole uniform pour macroarray spotting, hybridation et quantification permet impartiale mesurage des niveaux de tRNA directement à partir de signaux spots.
SPOt est précis et reproductible. Sa large gamme dynamique et seuil facilement réglable permet de profilage basses espèces abondantes, comme les ARNt associé polysomes, simplement en prolongeant de tableau exposition fois9. Après l’investissement initial pour le matériel nécessaire, le fonctionnement, coût par échantillon, y compris des consommables, en moyenne 15 $ par échantillons.
SPOt est applicable à tout organisme dont le génome est disponible pour la conception de la sonde. Organismes modèles qui sont cultivés in vitro sont des candidats idéaux pour le marquage métabolique. Comme les génomes de mammifères codent souvent beaucoup isodecoders (ARNt qui partage les anticodons identiques mais affiche des petites différences dans leur séquence de corps) sondes doivent être partiellement dégénérés pour préserver l’hybridation des espèces voisines de tRNA homogène. Enfin, des cellules de mammifères adhérentes produisent typiquement inférieure donne d’ARN total par rapport aux organismes cultivés en suspension telles que M. smegmatis, donc les cultures doivent être sensiblement intensifié.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par une subvention de SC INBRE de la National Institute of General Medical Science – NIH (P20GM103499 à R.G.) et donne le CA555536 & CA154664 de l’Institut National du Cancer à P.H.H. Ce programme a été soutenu en partie par une subvention pour le Collège de Charleston par le Howard Hughes Medical Institute à travers le pré-college & programme d’enseignement de premier cycle sciences et par des subventions du National Center for Research Resources (5 RR016461 P20) et le National Institute of General Medical Sciences (P20 8 GM103499) des National Institutes of Health.
Glass slide indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 470 | |
Glass slide arrayer replicator | V&P Scientific, Inc. | VP 478 | |
96 well microplate indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 472 | |
Wash and blot station | V&P Scientific, Inc. | VP 475 | |
Replicator pin dryer | V&P Scientific, Inc. | VP 474 | |
Amine coated slides | Molecular Devices | K2615 | |
Hybridizer / Automated hybridization and washing station | Digilab | Hyb10022 | |
Shaker incubator | Eppendorf Themomixer | 05-400-200 | |
Screw cap 2 ml tubes | Thermo Scientific | 21-403-201 | |
[32P] Na2HPO4 | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (Trizol) | Invitrogen | 15596026 | |
0.5 mm glass beads | Research Products International Corp. | 9831 | |
Mini bead mill | VWR | 25-020 | |
Storage phosphore screen | Fujifilm | BAS-IP SR 0813 | |
Phosphorimager | GE Healthcare | Typhoon FLA7000 | |
DNA oligonucleotides | IDT | N/A | |
UV crosslinker | Spectroline | Select series 254 nm | |
Microarray centrifuge | Arrayit Corporation | MHC110V | |
Mycobacterium smegmatis | ATCC | 700084 | |
Single-use needles | BD (Becton Dickinson) | 305185 | |
2 ml centrifuge tube | Fisherbrand | 14-666-317 | |
Precipitant (GlucoBlue) | Invitrogen | AM9516 | |
7H9 broth | Difco | 271310 | |
Chloroform | Fisher Chemicals | C298-500 | |
Isopropanol | Fisher Chemicals | A451-4 | |
20 X SSC | Lonza | 51205 | |
SDS | Fisher Bioreagents | BP166-100 | |
hybridisation cassette | GE Healthcare | 63-0035-44 | |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
Tween 80 | Amresco | M126-100ML | |
NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
Albumin | Spectrum Chemicals | A3611 | |
Dextrose | Fisher Chemicals | D16-1 | |
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid) | Fisher Bioreagents | BP2482-500 | |
0.5 M Phosphate buffer pH 7.2 | Alfa Aesar | AAJ63974AP |