Wir beschreiben eine original Transfer-RNA-Analyse-Plattform namens SPOt (optimierte Plattform für die Beobachtung der tRNA). Ort und Stelle misst simultan zelluläre Ebenen alle tRNAs in biologischen Proben, in nur drei Schritten und in weniger als 24 Stunden.
Transfer-RNA (tRNA) sind reichlich kurzen nicht-kodierende RNA-Spezies, die in der Regel 76 bis 90 Nukleotide in der Länge sind. tRNAs sind direkt verantwortlich für die Proteinsynthese Codons in mRNA in Aminosäuresequenzen übersetzt. tRNAs galten lange als Zimmermädchen Moleküle, die regulatorische Funktionen fehlten. Allerdings zeigt eine wachsende Zahl von beweisen, dass zelluläre tRNA Ebenen, in Übereinstimmung mit unterschiedlichen Bedingungen wie Zelltyp, Umwelt und Stress schwanken. Die Fluktuation der tRNA Ausdruck hat direkten Einfluss auf gen Übersetzung, Begünstigung oder unterdrücken die Expression von bestimmten Proteinen. Schließlich begreifen, die Dynamik der Proteinsynthese, erfordert die Entwicklung von Methoden in der Lage, qualitativ hochwertige tRNA Profile liefern. Die Methode, die wir hier vorstellen heißt Ort, steht für optimierte Plattform für Beobachtung tRNA. Vor Ort besteht aus drei Schritten, beginnend mit metabolischen Kennzeichnung von Zellkulturen mit radioaktiven Orthophosphat, gefolgt von Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion von radioaktiven total RNAs und schließlich Hybridisierung auf hauseigenen gedruckt Macroarrays. tRNA Ebenen sind geschätzt, indem die Radioaktivität Intensitäten an jedem Ort der Sonde zu quantifizieren. Im hier vorgestellten Protokoll Profil wir tRNAs in Mycobacterium Smegmatis Mc2155, ein apathogen Bakterium häufig als Modellorganismus verwendet, um Tuberkulose zu studieren.
Zelluläre tRNA Ebenen schwanken je nach Bedingungen wie Zelltyp, Umwelt und Stress1,2,3. SPOt, optimierte Plattform für die Beobachtung der tRNA, ist ein Original, zuverlässig, und einfache Technik, die schnelle und präzise Quantifizierung der Transfer-RNA-Spiegel im Labor gewachsen Organismen ermöglicht.
tRNAs haben bemerkenswert stabil sekundäre und tertiäre Strukturen4. Sie zeigen auch zahlreiche posttranskriptionelle Modifikationen5. Diese Funktionen stellen wesentliche Struktur- und Sequenz Straßensperren Vorspannen oder manchmal verhindert direkte und reproduzierbare tRNA Profilierung mit standard-Benchmark RNA Quantifizierung Techniken6. Forschergruppen auf der ganzen Welt waren gezwungen, kreativ, aber oft komplizierten Techniken um zelluläre tRNA-Ebenen zu bewerten. Einige dieser Methoden sind: (1) zweidimensionale Elektrophorese Trennung von metabolisch beschrifteten tRNAs kombiniert mit methodischen Ort Zuordnung von Northern Blot1; (2) individuelle Quantifizierung von Northern blot mit sorgfältig standardisierte radioaktiver DNA-Sonden7; (3) nach Extraktion Etikettierung mit Cyanin Fluorochromes gefolgt von Microarray-Analyse3und (4) in-vitro- Abisolieren der tRNA Änderungen mit Hilfe von rekombinanten Demodification Enzymen kombiniert mit reverse Transkription und die anschließende Hochdurchsatz-Sequenzierung8.
Vor Ort ist eine einfache und originelle Kombination aus zwei unkomplizierten Ansätze: (1) RNA Körper bezeichnen, besteht in der Synthese in den wachsenden Organismen, von radioaktiven total RNAs und (2) tRNA Macroarrays, eine systematische und miniaturisierte genomische Werkzeug optimiert für tRNA Segregation.
Proben sind von lebenden Organismen auf die Quantifizierung Plattform optimiert. Sie werden direkt nach der Extraktion analysiert und nicht verarbeitet nicht weiter die Verzerrungen im Vergleich zu Techniken, die Post-Extraktion Verstärkung oder enzymatischen Behandlungen erfordern wesentlich einschränkt. SPOt ist vielseitig und leicht zu Polysome Fraktionierung zu identifizieren und quantifizieren tRNA Subpopulationen, die physisch verbunden mit der Übersetzung von Ribosomen sind kombinierbar.
Die hier vorgestellten Protokoll ist optimiert für Mycobacterium Smegmatis, und es wurde auch erfolgreich eingesetzt, um Profil tRNAs in Escherichia coli9, Saccharomyces Cerevisiae10, Maus und menschlichen Zellkulturen11 .
Beta Partikelemissionen sind bakteriostatisch und antibakterielle Agenten14, bekannt, aber Strahlungen im Bereich getestet keine nennenswerten Auswirkungen auf Zelle Fitness haben. Funkeln Zählung ergab, dass 25 % der Gesamt-Zelle Extrakten und anschließend 1 % des gereinigten total RNAs die Radioaktivität eingegliedert ist.
Der Sonden identische Größen, vergleichbarer Schmelztemperatur und GC-Gehalt, sowie ein einheitliches Protokoll für Macroarray Schmierblutungen, Hybridisierung und Quantifizierung erlauben eine objektive Messung der tRNA Ebenen direkt vom spot Signale.
Ort ist reproduzierbar und spezifisch. Seine großen Dynamikbereich und leicht einstellbaren Schwellwert ermöglicht Profilierung geringere reichliche Arten wie tRNAs Polysomes, einfach durch eine Verlängerung Array Belichtung Zeiten9zugeordnet. Nach der anfänglichen Investition für die notwendige Ausrüstung die laufenden Kosten pro Probe, einschließlich Verbrauchsmaterialien, im Durchschnitt $15 pro Proben.
Vor Ort gilt für jeden Organismus, dessen Genom für Sonde Design zur Verfügung steht. Modell-Organismen, die in-vitro- angebaut werden sind ideale Kandidaten für die metabolische Beschriftung. Wie Säugetier-Genome codieren oft viele Isodecoders (tRNAs, die Teilen identisch Anticodons, aber kleine Unterschiede in ihren Körper Sequenzen anzeigen) müssen Sonden teilweise degenerierten, homogene Hybridisierung enge tRNA-Arten zu erhalten sein. Schließlich liefern anhaftende Säugetier-Zellen in der Regel geringere Mengen an Gesamt-RNS im Vergleich zu Organismen in Federung wie M. Smegmatis, angebaut, so Kulturen erheblich skaliert werden müssen.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen SC INBRE Zuschuss aus dem National Institute of General Medical Science – NIH (P20GM103499, r.g.) und gewährt von der National Cancer Institute P.H.H. CA555536 & CA154664 Dieses Programm wurde zum Teil durch einen Zuschuss an das College of Charleston aus dem Howard Hughes Medical Institute über das Pre-College & Undergraduate Science Education Program und durch Zuschüsse aus dem National Center für Forschungsmittel (5 P20 RR016461) unterstützt und das National Institute of General Medical Sciences (8 P20 GM103499) von den National Institutes of Health.
Glass slide indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 470 | |
Glass slide arrayer replicator | V&P Scientific, Inc. | VP 478 | |
96 well microplate indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 472 | |
Wash and blot station | V&P Scientific, Inc. | VP 475 | |
Replicator pin dryer | V&P Scientific, Inc. | VP 474 | |
Amine coated slides | Molecular Devices | K2615 | |
Hybridizer / Automated hybridization and washing station | Digilab | Hyb10022 | |
Shaker incubator | Eppendorf Themomixer | 05-400-200 | |
Screw cap 2 ml tubes | Thermo Scientific | 21-403-201 | |
[32P] Na2HPO4 | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (Trizol) | Invitrogen | 15596026 | |
0.5 mm glass beads | Research Products International Corp. | 9831 | |
Mini bead mill | VWR | 25-020 | |
Storage phosphore screen | Fujifilm | BAS-IP SR 0813 | |
Phosphorimager | GE Healthcare | Typhoon FLA7000 | |
DNA oligonucleotides | IDT | N/A | |
UV crosslinker | Spectroline | Select series 254 nm | |
Microarray centrifuge | Arrayit Corporation | MHC110V | |
Mycobacterium smegmatis | ATCC | 700084 | |
Single-use needles | BD (Becton Dickinson) | 305185 | |
2 ml centrifuge tube | Fisherbrand | 14-666-317 | |
Precipitant (GlucoBlue) | Invitrogen | AM9516 | |
7H9 broth | Difco | 271310 | |
Chloroform | Fisher Chemicals | C298-500 | |
Isopropanol | Fisher Chemicals | A451-4 | |
20 X SSC | Lonza | 51205 | |
SDS | Fisher Bioreagents | BP166-100 | |
hybridisation cassette | GE Healthcare | 63-0035-44 | |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
Tween 80 | Amresco | M126-100ML | |
NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
Albumin | Spectrum Chemicals | A3611 | |
Dextrose | Fisher Chemicals | D16-1 | |
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid) | Fisher Bioreagents | BP2482-500 | |
0.5 M Phosphate buffer pH 7.2 | Alfa Aesar | AAJ63974AP |