Vi beskriver en opprinnelige overføring RNA analyse plattform kalt SPOt (strømlinjeformet plattform for å observere tRNA). Sted måler samtidig mobilnettet nivåer av alle tRNAs i biologiske prøver, bare tre trinn, og i mindre enn 24 timer.
Overføre RNAs (tRNA) er rikelig kort ikke-koding RNA arter som er typisk 76 til 90 nukleotider i lengde. tRNAs er direkte ansvarlig for proteinsyntese ved å oversette kodon i mRNA i amino acid sekvenser. tRNAs ble lenge ansett som vaktmester molekyler som manglet juridiske funksjoner. Men indikerer en voksende mengde bevis at mobilnettet tRNA nivåer svinge i korrespondanse for varierende forhold som celle type, miljø og stress. Svingninger i tRNA uttrykket påvirker direkte genet oversettelse, favoriserer eller repressing uttrykk for bestemt proteiner. Til slutt forstå dynamikken i proteinsyntese krever utviklingen av metoder kunne levere høykvalitets tRNA profiler. Metoden som vi presenterer her kalles SPOt, som står for strømlinjeformet plattform for observere tRNA. Stedet består av tre trinn starter med metabolske merking av cellekulturer med radioaktivt orthophosphate, etterfulgt av guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform utvinning av radioaktivt totalt RNAs og til slutt hybridisering på interne trykt macroarrays. tRNA nivåer er anslått av kvantifisere radioaktivitet intensiteten på hver probe spot. I protokollen presenteres her profil vi tRNAs i Mycobacterium smegmatis mc2155, en attenueres bakterie ofte brukt som en modell organisme for å studere tuberkulose.
Mobilnettet tRNA nivåene variere i henhold til vilkår som celle type, miljø og stress1,2,3. Stedet, strømlinjeformet plattform for å observere tRNA, er en original, pålitelig, og enkel teknikk som gjør at rask og presis kvantifisering av overføring RNA i laboratoriet dyrket organismer.
tRNAs har bemerkelsesverdig stabil sekundære og tertiære strukturer4. De viser også mange post-transcriptional modifikasjoner5. Disse funksjonene representerer betydelige strukturelle og sekvens veisperringer biasing eller noen ganger hindrer direkte og reproduserbar tRNA profilering bruker standard benchmark RNA kvantifisering teknikker6. Forskningsgrupper verden ble tvunget til å utvikle kreative men ofte convoluted teknikker for å vurdere mobilnettet tRNA nivåer. Noen av disse metodene: (1) todimensjonal electrophoretic separasjon av metabolically merket tRNAs kombinert med metodisk spot tildeling av nordlige blot1; (2) personlige kvantifisering av Northern blot bruke nøye standardisert radioaktivt DNA sonder7; (3) etter utvinning merking med cyanine fluorochromes etterfulgt av microarray analyse3, og (4) i vitro stripping av tRNA endringer ved hjelp av rekombinant demodification enzymer kombinert med omvendt transkripsjon og påfølgende høy gjennomstrømming sekvensering8.
Stedet er en enkel og original kombinasjon av to standard og enkel tilnærminger: (1) RNA kroppen merking, som består i syntese, i voksende organismer, radioaktivt totalt RNAs og (2) tRNA macroarrays, en systematisk og miniatyriserte genomisk verktøy optimalisert for tRNA raseskille.
Eksempler er strømlinjeformet fra levende organismer kvantifisering plattformen. De analyseres direkte etter ekstraksjon og behandlet ikke noen videre som grenser betydelig biases sammenlignet med teknikker som krever etter utvinning forsterkning eller enzymatisk behandlinger. Stedet er allsidig og kan lett kombineres til polysome fraksjoneres å identifisere og telle tRNA subpopulasjoner fysisk forbundet med oversette ribosomer.
Protokollen presenteres her er optimalisert for Mycobacterium smegmatis, og det ble også brukt til profilen tRNAs i Escherichia coli9 Saccharomyces cerevisiae10, musen og menneskelige cellekulturer11 .
Beta partikler utslipp er kjent bakteriostatisk og bakteriedrepende agenter14, men stråler i testet området har ingen betydelig innvirkning på celle fitness. Scintillation teller viste at radioaktiviteten er innlemmet i 25% av total-celle ekstrakter og deretter 1% av renset totalt RNAs.
Sonder identisk størrelser, sammenlignbare Smeltetemperaturen og GC innhold, sammen med en ensartet protokoll for macroarray småblødninger, hybridisering og måling gir objektiv måling av tRNA direkte fra spot signaler.
Stedet er reproduserbare og bestemt. Dens stort dynamisk område og lett justerbar terskelen tillater profilering lav rikelig arter, som tRNAs knyttet til polysomes, ved å forlenge matrise eksponering ganger9. Etter den innledende investeringen for nødvendig utstyr gjennomsnitt kjøringen kostnad per utvalg, inkludert forbruksartikler $15 per prøver.
Stedet er gjelder for noen organismer som genom er tilgjengelig for sonden design. Modell organismer som dyrkes i vitro er velegnet for metabolske merking. Som pattedyr genomer koder ofte mange isodecoders (tRNAs som deler samme anticodons men vise små forskjeller i deres kropp sekvenser) må sonder være delvis degenerert å bevare homogen blanding av nært tRNA arter. Til slutt, tilhenger pattedyrceller gir vanligvis lavere mengder totale RNA sammenlignet organismer vokst i suspensjon som M. smegmatis, så kulturer må være vesentlig oppskalert.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av en SC INBRE grant fra det nasjonale Institutt for General medisinsk vitenskap – NIH (P20GM103499 til R.G.) og gir CA555536 og CA154664 fra National Cancer Institute P.H.H. Dette programmet ble støttes delvis stipend til College of Charleston fra Howard Hughes Medical Institute gjennom pre college & Undergraduate Science Education Program og tilskudd fra National Center for forskning ressurser (5 P20 RR016461) og National Institute of General Medical Sciences (8 P20 GM103499) fra nasjonalt institutter for helse.
Glass slide indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 470 | |
Glass slide arrayer replicator | V&P Scientific, Inc. | VP 478 | |
96 well microplate indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 472 | |
Wash and blot station | V&P Scientific, Inc. | VP 475 | |
Replicator pin dryer | V&P Scientific, Inc. | VP 474 | |
Amine coated slides | Molecular Devices | K2615 | |
Hybridizer / Automated hybridization and washing station | Digilab | Hyb10022 | |
Shaker incubator | Eppendorf Themomixer | 05-400-200 | |
Screw cap 2 ml tubes | Thermo Scientific | 21-403-201 | |
[32P] Na2HPO4 | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (Trizol) | Invitrogen | 15596026 | |
0.5 mm glass beads | Research Products International Corp. | 9831 | |
Mini bead mill | VWR | 25-020 | |
Storage phosphore screen | Fujifilm | BAS-IP SR 0813 | |
Phosphorimager | GE Healthcare | Typhoon FLA7000 | |
DNA oligonucleotides | IDT | N/A | |
UV crosslinker | Spectroline | Select series 254 nm | |
Microarray centrifuge | Arrayit Corporation | MHC110V | |
Mycobacterium smegmatis | ATCC | 700084 | |
Single-use needles | BD (Becton Dickinson) | 305185 | |
2 ml centrifuge tube | Fisherbrand | 14-666-317 | |
Precipitant (GlucoBlue) | Invitrogen | AM9516 | |
7H9 broth | Difco | 271310 | |
Chloroform | Fisher Chemicals | C298-500 | |
Isopropanol | Fisher Chemicals | A451-4 | |
20 X SSC | Lonza | 51205 | |
SDS | Fisher Bioreagents | BP166-100 | |
hybridisation cassette | GE Healthcare | 63-0035-44 | |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
Tween 80 | Amresco | M126-100ML | |
NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
Albumin | Spectrum Chemicals | A3611 | |
Dextrose | Fisher Chemicals | D16-1 | |
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid) | Fisher Bioreagents | BP2482-500 | |
0.5 M Phosphate buffer pH 7.2 | Alfa Aesar | AAJ63974AP |