Мы описываем оригинальной платформе анализ передачи РНК, именем пятно (обтекаемый платформа для наблюдения тРНК). Пятно одновременно измеряет клеточном уровнях всех tRNAs в биологических образцах, только три этапа в менее чем 24 часа.
Передача РНК (тРНК) являются обильные короткие некодирующих РНК видов, которые являются как правило 76-90 нуклеотидов в длину. tRNAs непосредственно отвечают за синтез белка, переведя кодонов в мРНК в аминокислотных последовательностей. tRNAs долго считались домоустройства молекулы, которые не имеют функции регулирования. Однако растущее количество доказательств показывает, что клеточном уровнях tRNA колебаться в соответствие различных условий, таких как тип клеток, окружающей среды и стресса. Колебания выражений тРНКГлу непосредственно влияет ген перевод, пользу или подавлять экспрессию конкретных белков. В конечном итоге осмысления динамический синтез белка требует разработки методов способны доставить высококачественные tRNA профилей. Метод, который мы представляем здесь называется место, которое стоит для рационализации платформы для наблюдения тРНК. Пятно состоит из трех этапов, начиная с метаболической маркировки клеточных культур с радиоактивными ортофосфат, следуют Гуанидиновые тиоцианат фенол хлороформ извлечение радиоактивных всего РНК и наконец гибридизации на собственных печатных macroarrays. tRNA уровни оцениваются путем количественной оценки интенсивности радиоактивности на каждом месте зонд. В протоколе, представленные здесь мы профиль tRNAs Mycobacterium smegmatis mc2155, непатогенных бактерии часто используется в качестве модельного организма для изучения туберкулеза.
Клеточном уровнях tRNA колебаться согласно условий, таких как тип клеток, окружающей среды и стресса1,2,3. Пятно, обтекаемый платформы для наблюдения tRNA, является оригинал, надежный и простой метод, который позволяет быструю и точную количественную оценку уровней передачи РНК в организмах, выращенных в лаборатории.
tRNAs имеют удивительно стабильные вторичной и третичной структуры4. Они также показывают многочисленные модификации post-transcriptional5. Эти функции представляют собой значительные структурные и последовательности заграждения смещения или иногда предотвращение прямых и воспроизводимые tRNA профилирования с использованием стандартных критериев РНК количественная оценка методов6. Исследовательские группы во всем мире были вынуждены развивать творческие, но зачастую запутанной методики оценки клеточном уровнях тРНК. Некоторые из этих методов включают в себя: (1) двумерных электрофоретического разделения метаболически помечены tRNAs в сочетании с методической место назначения Северная помарка1; (2) индивидуальные квантификации по Северной пятно с помощью тщательно стандартизированных радиоактивных ДНК зонды7; (3) после экстракции маркировки с цианиновые флуорохромов следуют microarray анализ3и (4) в vitro зачистки tRNA модификаций с помощью рекомбинантной demodification ферментов в сочетании с обратной транскрипции и последующих высокопроизводительного секвенирования8.
Спот представляет собой простой и оригинальный сочетание двух стандартных и простой подходов: (1) РНК тела маркировки, которая состоит в синтезе, в растущих организмов, радиоактивных всего РНК и macroarrays (2) tRNA, систематической и миниатюрных геномной инструмент оптимизированный для tRNA сегрегации.
Образцы имеют обтекаемую форму из живых организмов к платформе количественной оценки. Они анализируются непосредственно после извлечения и не обрабатывается каких-либо дальнейших, который значительно ограничивает предубеждения, по сравнению с методами, требующих усиления после извлечения или ферментативной обработки. Ролик является универсальным и могут быть легко объединены для фракционирования Полисома для идентификации и количественной оценки tRNA субпопуляций, которые физически связаны с переводом рибосом.
Протокола, представленные здесь оптимизирован для Mycobacterium smegmatis, и она также успешно используется для профиля tRNAs в9 Escherichia coli,10 Saccharomyces cerevisiae, мыши и культурах клеток человека11 .
Бета-частицы выбросов известны бактериостатическое и бактерицидное агентов14, однако излучений в проверенных диапазоне имеют не оказывает значительного влияния на клетки фитнес. Сцинтилляция подсчитывая показал, что радиоактивности включена в 25% всего клеточных экстрактов и впоследствии, 1% очищенного всего РНК.
Зонды одинаковых размеров, сопоставимых температуры плавления и GC содержания, а также единый протокол для macroarray пятнистость, гибридизации и количественная оценка позволяет объективное измерение уровней tRNA непосредственно от места сигналов.
Пятно, воспроизводимые и конкретными. Его большой динамический диапазон и легко регулируемый порог позволяет профилирования низкой обильные видов, таких как tRNAs, связанные с polysomes, просто путем продления массив воздействия раз9. После первоначальных инвестиций для необходимого оборудования стоимость одного образца, включая Расходные материалы, работает в среднем $15 за образцы.
Пятно применима к любой организм, чей геном доступен для Конструкция зонда. Модельные организмы, которые выращиваются в vitro являются идеальными кандидатами для метаболических маркировки. Как млекопитающих геномов часто кодировать многие isodecoders (tRNAs, которые разделяют одинаковые anticodons, но отображать небольшие различия в их тела последовательностей) датчики должны быть частично деградировавшие сохранения однородной гибридизации видов тесного tRNA. Наконец адэрентных клеток млекопитающих урожайности обычно нижнюю всего РНК, по сравнению с организмов, выращенных в подвеска таких м. smegmatis, поэтому культур должны быть существенно повышена.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана SC INBRE грант от национального института Генеральной медицинской науки – низ (P20GM103499 р.г.) и предоставляет CA555536 и CA154664 из Национального института рака P.H.H. Эта программа была поддержана в части Грант Колледж Чарлстон Говард Хьюз медицинский институт через довузовского и Бакалавриат Наука образовательной программы и за счет субсидий из национального центра для исследования ресурсов (5 P20 RR016461) и национального института Генеральной медицинских наук (8 P20 GM103499) от национальных институтов здоровья.
Glass slide indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 470 | |
Glass slide arrayer replicator | V&P Scientific, Inc. | VP 478 | |
96 well microplate indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 472 | |
Wash and blot station | V&P Scientific, Inc. | VP 475 | |
Replicator pin dryer | V&P Scientific, Inc. | VP 474 | |
Amine coated slides | Molecular Devices | K2615 | |
Hybridizer / Automated hybridization and washing station | Digilab | Hyb10022 | |
Shaker incubator | Eppendorf Themomixer | 05-400-200 | |
Screw cap 2 ml tubes | Thermo Scientific | 21-403-201 | |
[32P] Na2HPO4 | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (Trizol) | Invitrogen | 15596026 | |
0.5 mm glass beads | Research Products International Corp. | 9831 | |
Mini bead mill | VWR | 25-020 | |
Storage phosphore screen | Fujifilm | BAS-IP SR 0813 | |
Phosphorimager | GE Healthcare | Typhoon FLA7000 | |
DNA oligonucleotides | IDT | N/A | |
UV crosslinker | Spectroline | Select series 254 nm | |
Microarray centrifuge | Arrayit Corporation | MHC110V | |
Mycobacterium smegmatis | ATCC | 700084 | |
Single-use needles | BD (Becton Dickinson) | 305185 | |
2 ml centrifuge tube | Fisherbrand | 14-666-317 | |
Precipitant (GlucoBlue) | Invitrogen | AM9516 | |
7H9 broth | Difco | 271310 | |
Chloroform | Fisher Chemicals | C298-500 | |
Isopropanol | Fisher Chemicals | A451-4 | |
20 X SSC | Lonza | 51205 | |
SDS | Fisher Bioreagents | BP166-100 | |
hybridisation cassette | GE Healthcare | 63-0035-44 | |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
Tween 80 | Amresco | M126-100ML | |
NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
Albumin | Spectrum Chemicals | A3611 | |
Dextrose | Fisher Chemicals | D16-1 | |
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid) | Fisher Bioreagents | BP2482-500 | |
0.5 M Phosphate buffer pH 7.2 | Alfa Aesar | AAJ63974AP |