Biz orijinal bir transfer RNA analizi platformu nokta (akıcı tRNA gözlemlemek için Platform) adlı tanımlamak. Nokta aynı anda hücresel düzeyde tüm tRNA biyolojik örnekleri, sadece üç adım ve 24 saatten az bir süre ölçer.
Transfer RNA (tRNA) genellikle 76-90 nükleotid uzunluğunda olan bol kısa kodlamayan RNA türü bulunmaktadır. tRNA, mRNA içinde kodon amino asit dizileri haline çevirerek protein sentezi için doğrudan sorumludur. tRNA uzun düzenleyici fonksiyonları yoksun ev tutma molekül olarak kabul edildi. Ancak, kanıt büyüyen bir vücudun hücresel tRNA düzeyleri değişen koşullara hücre tipi, çevre ve stres gibi yazışma dalgalanma gösterir. TRNA ifade dalgalanma lehine veya ifade belirli proteinlerin bastırmak gen çeviri, doğrudan etkiler. Sonuçta protein sentezi dinamik kavrama yöntem yüksek kaliteli tRNA profilleri teslim etmek mümkün geliştirme gerektirir. Burada mevcut yöntemi için aerodinamik Platform için gözlem tRNA standları yer almıştır. Hücre kültürleri radyoaktif orthophosphate, radyoaktif toplam RNA’ların guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform çıkarma tarafından takip ile metabolik etiketleme ile başlayan üç adım nokta oluşur ve nihayet hibridizasyon in-house Tarih baskılı macroarrays. tRNA düzeyleri her sonda spot radyoaktivite Koyulukları miktarının tarafından tahmin edilir. Burada sunulan protokolünde Mycobacterium smegmatis mc2‘ de 155, sık sık bir model organizma tüberküloz çalışırdım nonpathogenic bir bakteri tRNA profil.
Hücre tipi, çevre ve stres1,2,3gibi koşullara göre hücresel tRNA seviyeleri dalgalanma. Nokta, tRNA, gözlemlemek için aerodinamik Platform bir özgün, güvenilir ve laboratuvar yetiştirilen organizmalar transfer RNA düzeylerinin hızlı ve hassas miktar sağlar basit tekniği dir.
tRNA son derece kararlı ikincil ve üçüncül yapıları4var. Bunlar da çok sayıda çoğu değişiklikler5görüntüler. Bu özellikler önemli yapısal ve kutuplama ya da bazen doğrudan ve tekrarlanabilir standart kıyaslama RNA miktar teknikleri6kullanarak tRNA profil oluşturma önleyerek sıra yollara barikat temsil eder. Araştırma grupları dünya çapında hücresel tRNA düzeylerini değerlendirmek için yaratıcı ama kez kıvrık teknikleri geliştirmek zorunda kaldılar. Bu yöntemlerden bazıları şunlardır: (1) iki boyutlu elektroforetik ayrımı metabolik olarak etiketli tRNA kombine metodik nokta atama ile Kuzey leke1tarafından; (2) Kuzey tarafından bireysel miktar leke dikkatle standart radyoaktif DNA probları7kullanarak; (3) sonrası ayıklama siyanür fluorochromes ile etiketleme ardından Mikroarray analiz3ve (4) vitro rekombinant demodification enzimler ters transkripsiyon ile kombine ve sonraki kullanarak tRNA değişiklikler sıyırma yüksek işlem hacmi sıralama8.
Basit ve özgün birleşimi iki standart ve basit yaklaşım bir noktadır: organizmalar, radyoaktif toplam RNA’ların ve (2) tRNA macroarrays, sistematik ve kırılan genomik aracı büyüyen sentez, oluşan etiketleme, (1) RNA vücut tRNA ayrımı için en iyi duruma getirilmiş.
Örnekler canlı organizmalar miktar platforma aerodinamik. Onlar doğrudan çıkarma sonra analiz edilir ve önyargıları sonrası ayıklama amplifikasyon veya enzimatik tedavi gerektiren teknikleri ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde sınırlayan daha fazla işlenen değil. Nokta çok yönlü ve kolayca tanımlamanıza ve ribozomlar çeviri ile fiziksel olarak ilişkili tRNA altgrupları ölçmek için polysome ayırma için kombine edilebilir.
Burada sunulan protokolü Mycobacterium smegmatisiçin optimize edilmiş ve o da başarıyla profil tRNA Escherichia coli9, Saccharomyces cerevisiae10, fare ve insan hücre kültürleri11 için kullanılan .
Ürünü test aralığındaki hücre fitness üzerinde önemli etkisi yoktur ancak beta parçacık emisyonları bakteriyostatik ve bakteri yok edici ajanlar14, bilinir. Mercek sayma radyoaktivite toplam-hücre özleri % 25’i ve daha sonra saf toplam RNA’ların % 1’i dahil gösterdi.
Probları aynı boyutlarda, karşılaştırılabilir erime sıcaklığı ve GC içeriğiyle macroarray lekelenme için Tekdüzen bir protokol hibridizasyon ve miktar tarafsız tRNA düzeylerinden spot sinyalleri doğrudan ölçümü için sağlar.
Tekrarlanabilir ve belirli bir noktadır. Onun geniş dinamik alan ve kolayca ayarlanabilir eşiği düşük gibi bol türlerin, sadece dizi pozlama kez9uzatan tarafından polizomlar ile ilişkili tRNA profil oluşturma sağlar. Sonra ilk yatırım için gerekli ekipman, sarf malzemeleri, dahil olmak üzere örnek maliyet çalışan $15-de örnekleri ortalamasını alır.
Nokta olan genom araştırma tasarımı için kullanılabilir herhangi bir organizma için geçerlidir. Vitro yetiştirilmektedir model organizmalar metabolik etiketleme için ideal aday olur. Memeli genleri genellikle birçok isodecoders (tRNA aynı anticodons paylaşmak, ancak onların vücut sekanslarında küçük farklılıklar görüntülemek) kodlamak gibi probları yakın tRNA türler homojen hibridizasyon korumak için kısmen dejenere olması gerekir. Son olarak, yapisan memeli hücreleri toplam RNA kültürleri önemli ölçüde ölçeklendirilmesi gereken süspansiyon gibi M. smegmatis, sonrasını organizmalar göre genellikle daha düşük miktarlarda verim.
The authors have nothing to disclose.
Bu eser desteklenen bir SC INBRE hibe–dan Ulusal Enstitüsü genel tıp bilim – NIH (RG P20GM103499) ve CA555536 & CA154664 P.H.H. için Ulusal Kanser Enstitüsü’nden verir Bu program kısmen araştırma kaynakları (5 P20 RR016461) Howard Hughes tıp Enstitüsü öncesi üniversite ve lisans bilim eğitim programı aracılığıyla Charleston Koleji için bir hibe ve hibe Milli Merkezi tarafından desteklenen yapıldı. ve Ulusal Genel tıbbi Bilimler Enstitüsü (8 P20 GM103499) ulusal sağlık Enstitüleri üzerinden.
Glass slide indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 470 | |
Glass slide arrayer replicator | V&P Scientific, Inc. | VP 478 | |
96 well microplate indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 472 | |
Wash and blot station | V&P Scientific, Inc. | VP 475 | |
Replicator pin dryer | V&P Scientific, Inc. | VP 474 | |
Amine coated slides | Molecular Devices | K2615 | |
Hybridizer / Automated hybridization and washing station | Digilab | Hyb10022 | |
Shaker incubator | Eppendorf Themomixer | 05-400-200 | |
Screw cap 2 ml tubes | Thermo Scientific | 21-403-201 | |
[32P] Na2HPO4 | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (Trizol) | Invitrogen | 15596026 | |
0.5 mm glass beads | Research Products International Corp. | 9831 | |
Mini bead mill | VWR | 25-020 | |
Storage phosphore screen | Fujifilm | BAS-IP SR 0813 | |
Phosphorimager | GE Healthcare | Typhoon FLA7000 | |
DNA oligonucleotides | IDT | N/A | |
UV crosslinker | Spectroline | Select series 254 nm | |
Microarray centrifuge | Arrayit Corporation | MHC110V | |
Mycobacterium smegmatis | ATCC | 700084 | |
Single-use needles | BD (Becton Dickinson) | 305185 | |
2 ml centrifuge tube | Fisherbrand | 14-666-317 | |
Precipitant (GlucoBlue) | Invitrogen | AM9516 | |
7H9 broth | Difco | 271310 | |
Chloroform | Fisher Chemicals | C298-500 | |
Isopropanol | Fisher Chemicals | A451-4 | |
20 X SSC | Lonza | 51205 | |
SDS | Fisher Bioreagents | BP166-100 | |
hybridisation cassette | GE Healthcare | 63-0035-44 | |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
Tween 80 | Amresco | M126-100ML | |
NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
Albumin | Spectrum Chemicals | A3611 | |
Dextrose | Fisher Chemicals | D16-1 | |
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid) | Fisher Bioreagents | BP2482-500 | |
0.5 M Phosphate buffer pH 7.2 | Alfa Aesar | AAJ63974AP |