Summary
Dette manuskript beskriver brugen af genetisk kodet fluorogenic journalister i et program af live-celle imaging til gennemgang af xenobiotiske-induceret oxidativt stress. Denne eksperimentelle tilgang tilbyder uovertruffen spatiotemporelle opløsning, følsomhed og specificitet samtidig undgå mange af manglerne ved konventionelle metoder, der anvendes til påvisning af toksikologiske oxidativt stress.
Abstract
Mens oxidativ stress er et almindeligt citeret toksikologiske mekanisme, lider konventionelle metoder til at studere det af en række mangler, herunder ødelæggelse af prøven, indførelse af potentielle artefakter og manglende specificitet for den reaktive arter involveret. Der er således en aktuelle behov inden for toksikologi for ikke-destruktiv, følsomme og specifikke metoder, der kan bruges til at observere og kvantificere intracellulære redox perturbationer, mere almindeligt kaldet oxidativt stress. Her præsenterer vi en metode for anvendelse af to genetisk kodet fluorogenic sensorer, roGFP2 og HyPer, skal bruges i live-celle imaging studier til at observere xenobiotiske-induceret oxidative svar. roGFP2 afbalanceres med glutathion redox potentiale (EGSH), mens HyPer direkte registrerer hydrogenperoxid (H2O2). Begge sensorer kan udtrykkes i forskellige celletyper via Transfektion eller transduktion, og kan være målrettet mod specifikke cellulære rum. Vigtigst, tilbyder live-celle mikroskopi ved hjælp af disse sensorer høj rumlige og tidsmæssige opløsning, det ikke er muligt ved hjælp af konventionelle metoder. Ændringer i fluorescens-intensiteten overvåges på 510 nm tjener som udlæsning til både genetisk kodet fluorogenic sensorer når sekventielt ophidset af 404 nm og 488 nm lys. Denne egenskab gør begge sensorer ratiometric, at fjerne fælles mikroskopi artefakter og korrigere for forskelle i sensor udtryk mellem celler. Denne metode kan anvendes på tværs af en række fluorometriske platforme i stand til at spændende og indsamling emissioner på de foreskrevne bølgelængder, hvilket gør det velegnet til brug med Konfokal Billeddannende systemer, konventionelle wide-felt mikroskopi og plade læsere. Begge genetisk kodet fluorogenic sensorer har været brugt i en række forskellige celletyper og toksikologiske undersøgelser for at overvåge cellulære EGSH og H2O2 generation i realtid. Skitseret her er en standardiseret metode, der er bredt kan tilpasses på tværs af celletyper og fluorometriske platforme for anvendelse af roGFP2 og HyPer i live-celle toksikologiske vurderinger af oxidativt stress.
Introduction
Udtrykket "oxidative stress" er ofte nævnt som en mekanisme i toksikologi, men er sjældent begrebet beskrevet specifikt. Oxidativ stress kan henvise til flere intracellulære processer, herunder generation af reaktive ilt arter, skader forårsaget af frie radikaler, oxidation af antioxidant molekyler, og endda aktivering af specifikke signalering kaskader. En bred vifte af miljøforurenende1,2 og apoteksagenter3,4 har dokumenteret for at fremkalde oxidativt stress ved enten direkte aktion af de xenobiotiske sammensatte, selv5 ,6 eller sekundært ved produktion af oxidant arter som en del af en cellulær svar7,8,9,10. Det er derfor af stor interesse for toksikologi til præcist at iagttage og karakterisere de oxidative processer, der fører til negative resultater. Konventionelle metoder til måling af oxidativt stress involverer identifikation af oxideret biomolekyler11,12,13,14,15 eller antioxidanter16 ,17,18,19,20, eller direkte måling af reaktive arter, selv21,22,23, 24. Disse metoder kræver dog typisk cellulære forstyrrelser, der ofte bruger eksemplet, rumlige opløsning, og potentielt introducerer artefakter25. Udviklingen af mere følsomme og specifikke metoder til påvisning af oxidant arter og markører af oxidativt stress er generelt gældende for undersøgelsen af de negative virkninger af xenobiotiske eksponering.
Live-celle mikroskopi ved hjælp af en ny generation af genetisk kodet fluorogenic sensorer er opstået som et kraftfuldt værktøj til at overvåge den intracellulære redox status af levende celler. Disse sensorer udtrykkes typisk ved hjælp af en vektor under kontrol af en viral promotor, der er indført via Transfektion eller transduktion metoder. Høj udtryk effektivitet er ikke nødvendige, da celler, der udtrykker den fluorescerende sensor kan let identificeres visuelt. Toksikologiske vurderinger, kan celler, der udtrykker disse sensorer observeres ved hjælp af Fluorescens mikroskopi, som de udsættes for Miljøfremmede stoffer i realtid. Denne eksperimentelle design tillader gentagne målinger i samme celle, så hver celle etablerede baseline til at fungere som sin egen kontrol. Den høje tidsmæssige opløsning af live-celle imaging er velegnet til påvisning af oxidative begivenheder, især dem, der er beskedne i størrelsesorden eller forbigående karakter. Ud over at være følsomme og specifikke til deres målmolekyler, kan fluorescens af nogle af disse sensorer blive ophidset ved hjælp af to bølgelængder af lys. Dette fænomen giver den fluorescerende emission udtrykkes som en ratio, som tillader dømmekraft af signal ændringer forbundet med autentisk sensor svar fra dem, der forårsages af artefakter såsom variationer i sensor udtryk, celle tykkelse, lampe intensitet, photobleaching og følsomhed af fluorescens detektor26. En anden fordel ved brugen af fluorogenic sensorer er, at de kan være målrettet mod specifikke cellulære rum, at skabe et niveau af rumlige opløsning, der er uovertruffen ved konventionelle metoder25,26,27.
En stor familie af genetisk kodet sensorer baseret på grøn fluorescerende proteiner (NGL) er blevet udviklet og præget at rapportere om en lang række fysiologiske markører, herunder pH, temperatur, calcium koncentrationer og ATP/ADP-forholdet25 ,28,29,30,31. Blandt disse er sensorer af glutathion redox potentiale (EGSH) og hydrogenperoxid (H2O2). Mens disse sensorer blev udviklet til applikationer i redox biologi og fysiologi, er de også blevet tilpasset til at studere xenobiotiske-induceret oxidativt stress. Specifikt, beskriver den protokol, der er skitseret her brugen af EGSH sensor roGFP2 og H2O2 sensor HyPer.
roGFP2 rapporter om redox potentiale af intracellulære reduceret og oxideret glutathion (GSH/GSSG) gennem en redox relæ der involverer glutathion peroxidase (GPx), glutaredoxin (Grx) og glutathion reduktase (GR) (figur 1)25, 32 , 33. glutathion er fremherskende cellulær antioxidant molekyle og findes primært i sin reduceret form (GSH) i millimolar koncentrationer i cytosol25,34. Mens EGSH ikke har været knyttet til enhver funktionelle resultat, er det anerkendt som en vigtig indikator for intracellulære oxidative status34. En forholdsvis lille stigning i koncentrationen af GSSG resulterer i en stigning i EGSH , kan påvises ved roGFP2. Lige så vigtigt, overvågning af EGSH ved hjælp af roGFP2 under xenobiotiske engagementer kan potentielt afsløre meget om virkningsmekanisme på flere punkter i redox-relæ og tilknyttede veje, såsom pentose fosfat selvhelende (figur 1 )35. Den anden sensor diskuteret her, HyPer, er en intracellulær H2O2 sonde afledt af indføjelsen af gul fluorescerende proteiner (YFP) i den lovgivningsmæssige domæne af bakteriel H2O2-følsomme transskription faktor OxyR136. Selvom det har tidligere været betragtet som en ødelæggende reaktive oxygen mellemprodukter, er H2O2 i stigende grad ved at blive anerkendt som en vigtig intracellulære signalfunktion molekyle under fysiologiske tilstande37, 38, tyder på, at ukendte roller for H2O2 findes i toksikologi så godt. For eksempel, kunne overskydende H2O2 induceret af en xenobiotiske udsættelse være en forløber for dysregulering i cellulær signalering eller et skift i bioenergetik.
Begge genetisk kodet fluorogenic sensorer er kommet til udtryk i flere etablerede cellelinier, herunder menneskelige epidermoid karcinom cellelinie A431 og den menneskelige bronchiale epitelcelle linje BEAS-2B, at observere ændringer i EGSH og Hansen2 O2 som svar på en række forskellige toksikologiske engagementer. Disse omfatter forurenende luftarter (ozon35), opløselige komponenter partikler (1,2 naphthoquinone39,40 og zink41) og nikkel nanopartikler (ikke-offentliggjorte data). Disse undersøgelser udgør kun en lille delmængde af de mulige anvendelser af disse to sensorer. Teoretisk set, enhver celletype, der er i stand til at modtage og give udtryk for DNA af disse sensorer gennem konventionelle molekylærbiologiske teknikker kan udnyttes til at vurdere virkningerne af fremmedstoffer mistænkes for at ændre den cellulære oxidativt tilstand. Til dato, er en eller flere af disse sensorer udtrykt i forskellige prokaryoter og eukaryoter, herunder adskillige pattedyr, plante, bakteriel og gær celle typer25,26,36,42. Udlæsning til både EGSH og H2O2 sensorer er en ændring i intensiteten af fluorescens udledes på 510 nm ved excitation med 488 og 404 nm lys. Denne metode er meget tilpasningsdygtige på tværs af fluorometriske platforme, herunder forskellige former for Mikroskopi (Konfokal og wide-felt) og plade læsere. Metoden præsenteres her tillader til følsom og specifik overvågning af intracellulære EGSH og H2O2 i i vitro toksikologiske systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af celler
Bemærk: Denne procedure beskriver den lentiviral transduktion af en udødeliggjort cellelinje (BEAS-2B; ATCC, Manassas, VA) til at udtrykke den ønskede reporter (roGFP2 eller HyPer). Andre celletyper linjer og/eller metoder til genoverførsel, herunder Transfektion, kan udnyttes, så længe de føre til en reporter udtryk tilstrækkelig til at visualisere et tilstrækkeligt antal sensor-udtrykker celler pr. synsfelt (typisk 5-10 celler). Hvis du bruger Transfektion metoder, proceduren skal udføres i skålen, der i sidste ende vil blive anvendt til metode til analyse (f.eks. transfect celler i den samme skål, som vil blive forelagt for mikroskop). Fremgangsmåden beskrevet nedenfor indeholder detaljer for at forberede cellen transductions skal udføres i en 6-godt celle kultur plade. Hvis dette format ikke er en passende størrelse for det ønskede program, kan andre fartøjer erstattes.
- Vokse celler til ca 40-60% sammenløbet i normal vækst medier.
Bemærk: Denne undersøgelse udnyttet den menneskelige bronchiale epitelcelle linje, BEAS-2B, dyrket i keratinocytter vækstmediet (KGM). - Lige før transduktion, erstatte vækst medier på celler med 500 µL af serum-gratis medier indeholdende den passende mængde af virus, som beregnet ved formlen:
- For transduktion af BEAS-2B celler, skal du bruge serumfrit keratinocytter basal medium (KBM) til at erstatte KGM vækst medier under viral inkubationer.
Bemærk: Ovenstående beregning er for en enkelt transduktion af et godt af celler i en 6-godt format. Hvis det er nødvendigt, udføre transductions af flere brønde kan udføres ved at justere formel med en multiplikation af antallet af brønde skal være transduced. Lentiviral transductions, at bruge en mangfoldighed af infektion (MOI) mellem 5 og 20. Adenoviral transductions, bruge en MOI mellem 100 og 500.
- For transduktion af BEAS-2B celler, skal du bruge serumfrit keratinocytter basal medium (KBM) til at erstatte KGM vækst medier under viral inkubationer.
- Inkuber celler med viral blandingen ved 37 ° C i 4 h, omfordele viruspartikler i skålen hver 30-60 min med en kort vuggende eller hvirvlende bevægelse.
- Der tilsættes 1 mL af komplet vækst medier til fadet og der inkuberes ved 37 ° C i en yderligere 4-16 h.
- Fjern alle medier og erstatte med frisk komplet vækst medier.
- Fortsætte med at vokse og passage celler, udvide efter behov.
Bemærk: Celler bør begynde mærkbart udtrykker sensor inden for 12-48 h. Hvis en lentiviral vektor blev brugt til transduktion, fortsat stabil udtryk for den ønskede sensor på tværs af passager. - For mikroskopi-baserede vurderinger, frø celler i glas bund mikroskop retter og vokse til ønskede sammenløbet (≥70 - 80%) før billeddannelse.
Bemærk: Såning tæthed vil afhænge af størrelsen på fadet, vækst i den cellelinie bliver brugt, og tidspunktet for vurderingen efter såning. For eksempel, seed 300.000 BEAS-2B celler ind i en 35-mm ret til udbytte ca 70-80% sammenløbet efter 1 dag i vækst.
2. mikroskopi Set-up
Bemærk: Protokollen beskrevet nedenfor udføres ved hjælp af en Konfokal mikroskop udstyret med laser linjer på 404 og 488 nm. Andre midler til at foretage fluorometriske vurderinger af sensorerne beskrevet inden for denne protokol på deres foreskrevne excitationer/emission bør også udbytte levedygtige data. Vigtigere, kan udstyr indstillinger variere meget afhængigt af den type, alder og tilstand af måleapparatet; Derfor, enhver instrument værdier nævnes muligvis ikke er specifikke for det udstyr, der anvendes i andre laboratorier.
- Udføre alle billedbehandling analyse ved hjælp af miljøkontrol til at opretholde en passende temperatur (fx 37 ° C), luftfugtighed (typisk > 95% relativ fugtighed), og/eller gas koncentration (fx, 5% CO2) egnet til cellerne i hele den varigheden af forsøget.
- Hvis du bruger høje værdier af relativ fugtighed, holde alle overflader, der kan komme i kontakt med fugtig atmosfære (fx., mikroskop mål) på eller lidt over den temperatur, hvor luftfugtigheden er genereret for at forhindre kondens. Dette kan opnås med brugen af en objektiv varmelegeme og/eller opvarmning tape og en passende varmer kontrol.
- Slå alle mikroskop komponenter og konfigurere alle udstyr, der kræves for sekventielle excitation på 488 og 404 nm med emission på 510 nm. Sikre, at alle komponenter i den optiske konfiguration er indstillet korrekt for real-time erhvervelse.
- Oprette en fase-top miljømæssige kammer til at opretholde konstant temperatur på 37 ° C, 5% CO2 atmosfære, og > 95% fugtighed. Før du starter billede erhvervelse, reagensglasset den miljømæssige kammer i mindst 10 min efter den indledende opsætning af alle miljøkontrol.
Bemærk: Miljøforhold kan fjernes eller justeres afhængigt af eksperiment længde, celletype og eksponering bliver brugt. - Placer skål af celler (trin 1,7) på scenen-top inden for den miljømæssige kammer.
- Med de ønskede mål linse, finde brændplanet af celler ved hjælp af okularet og hvidt lys og sikre normale morfologi.
Bemærk: En 1.4 NA 60 X violet-korrigeret, olie-nedsænket mål linse er almindeligt anvendt, som tillader identifikation af intracellulære rum mens maksimering Konfokal-Systems optisk opløsning. - Kontrollere udtrykket fluorescens af celler i synsfeltet. Gør det, mens visualisere celler under wide-felt fluorescens belysning med en passende filtersæt, såsom fluorescein isothiocyanat (FITC). På dette tidspunkt ved wide-felt belysning, mens på udkig gennem okularet er mere praktisk, fordi det er lettere at flytte fad at vælge et område af celler til at studere. I almindelighed, vælge en synsfelt, der indeholder mindst 5 til 10 celler, der udtrykker sensoren, som angivet af grønne fluorescens.
- Alternativt kan du udføre denne vurdering af confocally ved hjælp af laser excitation ved en bølgelængde, som er mest kompatibel med sensoren udtrykkes (488 nm typisk fungerer bedst).
Bemærk: På grund af deres iboende fluorescerende egenskaber, det bliver sværere at visualisere celler, der udtrykker HyPer end disse udtrykker roGFP2 ved hjælp af enten FITC eller på 488 nm. Dog skal det stadig være muligt at se svag celler.
- Alternativt kan du udføre denne vurdering af confocally ved hjælp af laser excitation ved en bølgelængde, som er mest kompatibel med sensoren udtrykkes (488 nm typisk fungerer bedst).
- Når en ønskede synsfelt er fundet, lukke den miljømæssige kammer.
Bemærk: Funktionen opretholdelse af fokus, ofte tilgængelige på avanceret mikroskop stande, til at lette opretholdelsen af en stabil brændplanet i hele undersøgelsen. - Konfigurer erhvervelse parametre til at sikre optimal vurdering af sensoren af interesse på tværs af den ønskede eksponeringstid. Nedenfor er anbefalinger og strategier for Konfokal billeddannelse af sensor svar:
- Justere laser strøm til magnetisering på 488 nm og emission på 510 nm. Vælg en laser power-niveau, der giver mulighed for visualisering af cellerne, og holde dette konstant mellem prøver eller Repliker retter.
Bemærk: For denne undersøgelse, 12% og 1,5% laser power blev brugt til de 488 og 404 nm laser linjer, henholdsvis. - Bruge Konfokal kontrol af erhvervelse software til at sikre, at det valgte brændplanet er optimeret til maksimal fluorescens emission intensitet i midten af celler (z-aksen) ved at scanningen på 488 nm mens du justerer z-plan. Dette er gjort lettere ved hjælp af en høj gevinst indstilling under søgningen efter z-flyet, der resulterer i de mest over-eksponeret celler. Når passende brændplanet er blevet fundet, returnere gevinsten til en indstilling, der er mest optimalt for fluorescens af reporter bliver brugt uden oversaturating pixels overholdes.
Bemærk: Indstillingerne laser og gevinst, der er passende for at finde og observere celler under eksperimenter er helt afhængige af Konfokal systemet udnyttes. I almindelighed, når cellerne er blevet fundet i synsfeltet, er det anbefales, at en minimal mængde af laser power være brugt (normalt ≤20%), som overdreven scanning af celler ved hjælp af høj-drevne laserlys kan fremkalde oxidative ændringer kan spores af sensoren. - Bruge gevinsten til at finjustere baseline fluorescens. Med roGFP2, etablere baseline nær den øvre grænse (≈ 90% relativ intensitet) af instrument uden overdreven mætning, da disse celler vil miste 510 nm fluorescens induceret af 488 nm excitation, når EGSH stiger. Derimod fluorescens-intensiteten med 488 nm excitation bør være lav (≈ 10% relativ intensitet) på baseline for HyPer udtrykker celler, da disse celler vil få 510 nm fluorescens intensitet, når H2O2 opdages.
- Gentag trin 2.9.2 og 2.9.3 med excitation på 404 nm og emission på 510 nm. Gain-indstillinger for 404 nm excitation bølgelængde er modsatte af dem, der anvendes med 488 nm excitation for hver sensor (dvs. lav baseline fluorescens (≈ 10% relativ intensitet) på 404 nm for roGFP2, høj baseline fluorescens (≈ 90% relativ intensitet) til H2 O2 sensor).
Bemærk: I almindelighed, fluorescens (510 emission) på 404 nm excitation vil være betydeligt lavere end at fås med 488 nm excitation i celler udtrykker både roGFP2 og HyPer som den 404 nm højdepunkt er en relativt mindre excitation maksimum for begge disse sensorer.
- Justere laser strøm til magnetisering på 488 nm og emission på 510 nm. Vælg en laser power-niveau, der giver mulighed for visualisering af cellerne, og holde dette konstant mellem prøver eller Repliker retter.
3. dataindsamling
- Oprette erhvervelse software til sekventielt ophidse de to excitation bølgelængder (første 488 nm og derefter 404 nm) og indsamle emissioner for både på 510 nm på en forudbestemt tidsintervallet i den ønskede længde af eksperimentet (fx capture billeder hver 60 s i 60 min).
- Alternativt kan du erhverve billeder manuelt før og efter engagementer hvis omtrentlige timingen af ændringer i EGSH eller H2O2 er kendt for de xenobiotiske bliver testet. Dog kan dette føre til tab af tidsmæssige opløsning.
- For real-time vurdering af eksperimentelle parametre, Vælg mindst 5-10 sensor-udtrykker celler i feltet og oprette dem som regioner af interesse ("ROIs") til at overvåge deres fluorescens ændringer under eksperimentet.
Bemærk: Dette trin er valgfrit, og kan udføres efter forsøget, hvis direkte observation i realtid er uønsket eller softwarebegrænsninger forhindre løbende overvågning. Afhængig af befolkningens celle, udvælgelse af sensor at udtrykke celler som ROIs kan repræsentere en række udtryk niveauer på tværs af celler.- For disse undersøgelser, tilføje miljømæssige giftstof 9,10-phenanthrenequinone (9,10-PQ) eller brintoverilte (H2O2) efter en 5-min oprindelige periode.
- Forberede alle reagenser til senere brug i denne protokol. Opløses 9,10-PQ i dimethylsulfoxid (DMSO) til en koncentration på 15 mM, og fortyndes i basalcelle medier til at give en 250 µM brugsopløsning. Derudover forberede en brugsopløsning af hydrogenperoxid i vand, som vil give en endelig koncentration på 1mM ved injektion.
- Når de eksperimenterende parametre er blevet defineret, Begynd tid kurset erhvervelsen. Oprette en oprindelig periode på mindst 5 min (eller 5 datapunkter) før du starter xenobiotiske engagementer.
- Udsætte celler til giftstoffet undersøges ved hjælp af konventionelle metoder til in vitro- dosering. Forberede opløselige forbindelser i enten vand eller andre passende opløsningsmiddel og indsprøjtes direkte i medierne.
- Hvis organiske opløsningsmidler (f.eks. dimethylsulfoxid eller ethanol) er påkrævet, holde den endelige opløsningsmiddel koncentration på eller under 0,1%. Kontroller, at oploesningsmidlet ikke frembringer en effekt på EGSH eller H2O2 produktion med et køretøj kontrol i en separat skål af celler.
- Forbindelser med lavere opløselighed, tilføje en blanding trin ved hjælp af en mikropipette til protokollen efter Indsprøjtningen er foretaget. Pumpe gasformige engagementer direkte ind i miljøet kammeret ved hjælp af passende luftfartsselskab gasblanding.
- Overvåge ændringer i fluorescens periode eksponering. Udføre efterfølgende injektioner, efter behov. Tage stor forsigtighed for ikke at flytte fadet under injektioner, således at de samme celler følges i hele kurset hele tiden mens afbildet i den samme fokalplan.
- I slutningen af forsøget, udsætte celler til passende kontrol. For begge genetisk kodet fluorogenic sensorer, tilføje bestemte koncentrationer af forbindelser kendt at oxidere og reducere disse sensorer i en spidse demonstration af deres ratiometric reaktionsevne. H2O2 og dithiothreitol (DTT) tjener som passende kontrol til at oxidere og reducere både sensorer. Typisk, en endelig koncentration på 100-1.000 µM H2O2, efterfulgt af 1-5 mM dithiothreitol (DTT), giver brugeren mulighed for fuldt ud at oxidere og reducere disse sensorer.
- For disse undersøgelser, skal du bruge 1 mM H2O2 efterfulgt af 5 mM DTT til at bestemme den maksimale sensor reaktion.
- Vent mindst 5 min til at tillade sensoren til at reagere, og derefter indsprøjtes reduktionsmiddel, såsom DTT, at reducere senor og returnere det til et niveau af fluorescens på eller i nærheden af sine etablerede baseline.
Bemærk: Brug af objekter i dette trin er afgørende for normalisering, og skal udføres i slutningen af hvert eksperiment at bestemme det dynamiske område af sensoren i hver celle. For roGFP2, kan aldrithiol også tilføjes i slutningen af forsøget. Aldrithiol omgår roGFP2 redox relæ for at oxidere sensoren direkte. Dette er nyttigt at vurdere sensor funktion efter xenobiotiske eksponering.
4. dataanalyse
- Hvis ikke allerede er etableret, skal du tegne ROIs omkring cellerne der skal analyseres. Brug den relevante software til at måle fluorescens-intensiteten af hver ROI på hver bølgelængde under hele tiden. Sikre at cellerne ikke bevæge sig eller pladen ikke flytte under flugt.
Bemærk: Etablering af ROIs opnås lettest ved at tegne en lukket region, der følger den fluorescerende udtryk mønster af hver celle. Du kan yderligere hjælpe med denne proces, kan en overførte lys (eller brightfield) billede af celler inden for det etablerede synsfelt overlejres på fluorescerende billedet i bestræbelserne på at definere cellegrænserne. Brug af en overførte lys billede kræver imidlertid bruger til at fange en ekstra kanal (sæt af billeder) i løbet af eksperimentet. Alternativt, visse fabrikanter indarbejder algoritmer i deres billedbehandling software, der bruger bestemte parametre såsom intensitet tærskler for at etablere ROIs i en mere kvantitative, mindre subjektive, metode. - Eksportere data til ønskede analyse software (f.eks. elektroniske regneark).
- Beregn ratiometric sensor svar for hver ROI på hvert tidspunkt ved hjælp af formlerne:
- Hvert tidspunkt, middelværdier beregnede ratiometric af alle ROIs.
- Beregne baseline-værdi, som vil blive brugt til at normalisere dataene, fra et gennemsnit tidligere beregnede ratiometric værdier (trin 4.4) indsamlet før tilsætning af xenobiotiske (f.eks. de første fem-tiden point).
- Normalisere ratiometric værdierne fra trin 4.4 ved at dividere hver værdi af den oprindelige værdi i 4.5. Normaliserede nøgletal vil centrum omkring en værdi på 1 til baseline, mens stiger i EGSH eller H2O2 følgende injektioner vil medføre forhold at øge. Vurderinger af xenobiotiske, der inducerer oxidative ændringer har tendens til at give værdierne i en række af 3 - 6 gange den oprindelige værdi.
- For at støtte i sammenligne svar inden for og på tværs af eksperimenter, udtrykke den normaliserede data som en procentdel af maksimal sensor svar ved at definere svar til kontrol oxidant (f.eks. 1 mM H2O2) som 100%.
Bemærk: Hvis udtrykker data som en procentdel af maksimal sensor svar, det er afgørende at sikre, at den samme koncentration af kontrol oxidant anvendes konsekvent på tværs af eksperimenter. Alle data, der stammer fra live-celle imaging analyse er indstillet til konventionelle parvise og group-wise statistiske analyse skal vælges på skøn af investigator.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Brug af roGFP2 og HyPer til at opdage ændringer i EGSH og intracellulære H2O2 har været godt beskrevet tidligere25,36,42,43 , og er vist her. Konfokal billeder af celler, der udtrykker roGFP2 ved baseline og følgende tilføjelse af H2O2 og DTT er vist i figur 2. Data fra billeder, indsamlet hele eksperimentet blev derefter eksporteres og analyseret som beskrevet i punkt 4 i protokollen. Som vist, producerer tilsætning af eksogene H2O2 som positiv kontrol reproducerbare svar, da dataene er normaliseret til deres respektive baseline og en defineret dynamikområde er etableret gennem tilsætning af kendte eksogene oxidanter/reduktionsmidler (dvs., H2O2 og DTT) (tal 3, 4 og 5).
Svar til toksikologiske stimuli er typisk mere variable end dem fremkaldt af kontrolelementer. Dette er forventeligt, da Miljøfremmede stoffer kan have pleiotrope effekter på cellerne, lige fra redox cykling og adduktion af intracellulære proteiner. Eksempler på roGFP2 og HyPer svar fremkaldt af udsættelse for giftstof 9,10-PQ, en oxiderende luftforurenende dannet af atmosfæriske reaktioner af phenantren44, præsenteres i tallene 6 og 7. Grafer i disse tal skildrer progression af hvert trin involveret i dataanalyse beskrevet i punkt 4 i protokollen. Som vist, reducerer normalisering af hver celle til sin egen baseline og positiv kontrol (fig. 6B), intercellulære variation i størrelsen af sensoren svar fra de rå data (fig. 6A). I tilfælde hvor afvigelsen i den cellulære reaktion er af interesse, kan normalisering af data udføres frem til dette punkt, med individuelle celler repræsenteret af deres egne linjer på grafen. Variation i omfanget eller kinetik af svar blandt celler i de samme parabol kan afsløre vigtige mekanistiske indsigter, der afspejler forskellene i cellecyklus, f.eks. Alternativt kan den gennemsnit svar af celler i en petriskål præsenteres sammen med standardafvigelsen (figur 6C). Ellers, hvis replikater af separate eksperimenter præsenteres, dataene kan præsenteres som normaliseret relative fluorescens intensitetsværdier eller en procentdel af den maksimale svar induceret af kontrol oxidant (tal 3, 4, 5, og 6 D), viser gennemsnittet af alle replikater ledsaget af standardafvigelsen på middelværdien. Den omgivende luft forurenende 9,10-PQ er kendt for at være en potent redox variator, som vi hypotesen er ansvarlig for de cykliske toppene af hydrogenperoxid produktion opdaget af HyPer (figur 7) og trinvis EGSH øger opdaget af () roGFP2 Figur 6 D).
Figur 1 . RoGFP2 glutathion redox relæ. Glutathion peroxidases (GPx) oxidere reduceret glutathion (GSH) til GSSG i svar til hydrogenperoxid (H2O2), dermed øge glutathion redox potentiale (EGSH). Fluorogenic sensor roGFP2 afbalanceres med intracellulære EGSH når oxideres af glutaredoxin (Grx). I reduktiv pathway katalyserer Grx reduktionen af roGFP2 gennem deglutathionylation som GSSG niveauet falder og normale niveauer af GSH er genoprettet af glutathion reduktase (GR) på bekostning af NADPH. NADPH er leveret af glukose gennem pentose fosfat pathway (PPP). Tilpasset fra Gibbs-Flournoy mfl35. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Konfokal mikroskopi billeder af den menneskelige bronchiale epitelcelle linje BEAS-2B udtrykker cytosole roGFP2. Celler blev belyst på 488 nm (A-D), efterfulgt af 404 nm (E-H). Billederne viser fluorescens udledes på 510 nm for følgende betingelser: baseline (A, E), 100 µM H2O2(B, F), 1 mM H2O2 (C, G)og 5 mM DTT (D, H). 60 X planlægger Apo VC mål. Skala søjler repræsenterer 25 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Dosis afhænger af ændringer i roGFP2 induceret af H2O2 i BEAS-2B celler. Celler var ekvilibreres for 30 min i phenol-rød gratis keratinocytter basal medier (KBM) før engagementer. Alle tilføjelser af H2O2 opstod efter en oprindelig periode på 5 min. roGFP2 fluorescens udledes på 510 nm blev indsamlet ved hjælp af en 525/30 nm band pass filter efter laser excitation på 404 og 488 nm. Cellulære svar var normaliseret til deres respektive baseline og maksimale sensor reaktion efter tilsætning af 1 mM H2O2. Værdier er præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse, n = 3, hvor n består af et gennemsnit på 5-10 uafhængige celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Svar af glucose sultet BEAS-2B celler udtrykker roGFP2 til forskellige doser af H2O2. Celler var ekvilibreres i 2 timer i en minimal salt medium, der ikke indeholder glucose før engagementer. Alle tilføjelser af H2O2 opstod efter en oprindelig periode på 5 min. roGFP2 fluorescens udledes på 510 nm blev indsamlet ved hjælp af en 525/30 nm band pass filter efter laser excitation på 404 og 488 nm. Cellulære svar var normaliseret til deres respektive baseline og maksimale sensor reaktion efter tilsætning af 1 mM H2O2. Værdier er præsenteret som den gennemsnitlige ± standardafvigelse, n = 3, hvor n består af et gennemsnit på 5-10 forskellige celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Svar af BEAS-2B celler udtrykker HyPer til forskellige doser af H 2 O 2 . Celler var ekvilibreres for 30 min i phenol-rød gratis KBM før engagementer. Alle tilføjelser af H2O2 opstod efter en oprindelig periode på 5 min. fluorescens udledes på 510 nm blev indsamlet ved hjælp af en 525/30 nm band pass filter efter laser excitation på 404 og 488 nm. Cellulære svar var normaliseret til deres respektive baseline og maksimale sensor reaktion efter tilsætning af 1 mM H2O2. Værdier er præsenteret som den gennemsnitlige ± standardafvigelse, n = 3, hvor n består af et gennemsnit på 5-10 forskellige celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. 9,10-PQ-induceret svar i BEAS-2B celler udtrykker roGFP2. Celler var ekvilibreres for 30 min i phenol-rød gratis KBM før eksponering. Tilsætning af 25 µM 9,10-PQ med blande opstod på 5 min, efterfulgt af tilsætning af 1 mM H2O2 på 20 min og 5 mM DTT ved 24 min. Panel A skildrer rå roGFP2 forholdet mellem individuelle celler i fadet, hver celle repræsenteres af en separat linje. Panelet B viser normalisering af værdier fra hver enkelt celle til sin oprindelige sensor fluorescens, og den gennemsnit og standardafvigelse af disse data er overlejret på de enkelte normaliseret nøgletal i panelet C. Procentdel af maksimal sensor svar på tværs af alle celler i gennemsnit er afbildet i panelet D. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 . 9,10-PQ-induceret svar i BEAS-2B celler udtrykker HyPer. Celler var ekvilibreres for 30 min i phenol-rød gratis KBM før eksponering. Tilsætning af 25 µM 9,10-PQ med blande opstod på 5 min, efterfulgt af tilsætning af 1 mM H2O2 på 20 min og 5 mM DTT på 25 min. fluorescens udledes på 510 nm blev indsamlet ved hjælp af en 525/30 nm band pass filter efter laser excitation på 404 og 488 nm. Cellulære svar var normaliseret til deres respektive baseline og maksimale sensor reaktion efter tilsætning af 1 mM H2O2. Værdier er præsenteret som gennemsnit af 5-10 forskellige celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Brug af roGFP2 og HyPer til at opdage ændringer i intracellulære EGSH og H2O2, henholdsvis, har været godt beskrevet i tidligere undersøgelser af fysiologiske og toksikologiske 25,35,36 ,39,40,41,42,43. Den protokol, der er skitseret her rapporterer en effektiv måde at implementere disse genetisk kodet redox sensorer i spidse toksikologiske undersøgelser skal vurdere xenobiotiske-induceret perturbationer af intracellulære redox homøostase. Vigtigst af alt, links korrekt brug af disse sensorer ændringer observeret at en specifik redox par eller ROS (EGSH eller H2O2), i sidste ende afklaring manglende specificitet med mange konventionelle oxidativt stress tilgange. I sikring af kvaliteten af de data, der genereres fra disse sensorer, et par aspekter skal tages i betragtning, når designe eksperimenter og analysere/fortolke data. De omfatter: 1) anvendelsen af ordentlig kontrol, 2) kontrol af passende sensor svar, og 3) manipulation af eksperimentelle parametre at belyse mekanismerne. Af disse tjener tilsætning af eksogene H2O2 og DTT som kontrolelementer i slutningen af observationsperioden flere formål. Først, det giver mulighed for at vurdere omfanget af den toksiske påvirkning i forhold til de maksimale og minimale signaler opnåelige responsen fra sensoren. Dette er mest nyttigt i normaliseringen svar for sammenligninger mellem eksperimenter. Desuden kan slutter eksperiment med tilsætning af stærk eksogene oxidant og reduktiv stimuli vurdere effekten af den foregående eksponering på sensor/relæ integritet. Derudover kan aldrithiol tilføjes i slutningen af opstille hen til omgå relæet og teste funktionaliteten af sensor direkte til potentielle skader, at eksponeringen kan have påført til fluorophore, sig selv.
Ligesom med andre teknikker, når du anvender denne metode for en specifik undersøgelse af toksikologiske resultater, er det vigtigt at foretage kvalitative vurderinger vedrørende nøjagtigheden af de fremsatte bemærkninger. Når man bruger roGFP2 eller HyPer med enhver ny xenobiotiske er det vigtigt at først afprøve en række doser, samtidig med at sikre, at fluorescens-intensiteten (510 nm emission) fra hver excitation bølgelængde (404 nm og 488 nm) ændrer korrekt (dvs. stigning eller formindske) for redox senor bliver brugt. Målet er at identificere en dosis på som en sensor svar kan spores, men er ikke overvældet af åbenlys manipulation af sensoren eller andre ikke-specifikke effekter af stoffet. Direkte adduktion eller skader på sensoren kan manifestere sig som atypiske ændringer i fluorescens på enten excitation bølgelængde (488 eller 404 nm). I situationer hvor enten sensor er blevet observeret at konsekvent reagerer uhensigtsmæssigt at tilføjelsen af en giftstoffet på tværs af engagementer, anbefales det, at forsøgslederen overveje undersøge eksperimentelle parametre i forbindelse med dosimetri, celle levedygtighed, sensor udtryk, og/eller optisk/kromatisk abnormiteter af måleudstyret anvendes til at observere svarene.
Som med enhver toksikologiske udlæsning, data erhvervet er normalt mere meningsfuldt, når de observerede responser er undersøgt eller godkendt ved hjælp af en mekanisk tilgang, og de eksperimentelle begrænsninger tages i betragtning. Med henblik herpå, kan flere eksperimentelle parametre kombineret med de iboende egenskaber af sensoren udnyttes til at generere robust redox vurderinger. Undersøgelser specifikke for brugen af roGFP2 sensor i sidste ende vedrører redox relæet gennem hvilke roGFP2 sanser EGSH (figur 1). Relæet indebærer intracellulære enzymer, herunder glutaredoxin (Grx), glutathion reduktase (GR) og glutathion peroxidase (GPx). Forskelle i endogene Grx på tværs af både cellulære rum og celletyper kan påvirke målinger af EGSH og foretage sammenligninger mellem eksperimenter vanskeligt43. For at løse dette problem, en serie af "fusion sonder" har blevet syntetiseret, som knytte relevante enzymet direkte til roGFP2 sensor. Senest har var menneskelige Grx-1 knyttet til roGFP2 af Gutscher og kolleger32 til form Grx1-roGFP2. Ud over at have en større dynamikområde end roGFP1 og pH-ufølsom, kan Grx1-roGFP2 overvåge EGSH i celletyper eller segmenter i hvilke Grx aktivitet ellers ville være begrænsende. Forskelle i NADPH niveauer på tværs af celletyper eller selv blandt celler i de samme parabol kan også bidrage til variation i roGFP2 svar. NADPH er fremstillet af glucose gennem pentose-fosfat pathway, og kan udnyttes af glutathion reduktase (GR) at reducere GSSG tilbage til GSH (figur 1). Hvis celler i det samme felt begynder at eksperimentere med forskellige reducerende kapacitet, kan deres EGSH ændringer og deraf følgende roGFP2 svar til en stimulus ikke være ensartet. Dette problem kan overvindes gennem en periode af glucose sult inden eksperiment, som dræner cellulære NADPH bestande og harmoniserer roGFP2 svar. En nedsat arbejdsevne EGSH recovery kan også ses i de 25 µM H2O2 dosis i celler, der blev udsultet af glukose i forhold til cellerne suppleret med normal glukose koncentrationer (figur 3 og 4). Thusly, kan manipulation af NADPH niveauer gennem glukose sult tjene som et middel til at kontrollere inddragelse af flere relæ komponenter i transducing effekt af en xenobiotiske eksponering til sensoren. En anden bekymring, når du bruger roGFP2 i forbindelse med toksikologiske er potentiale for de xenobiotiske at interagere direkte i oxiderende sensoren i stedet handler gennem redox relæet til at ændre EGSH. Direkte oxidation af roGFP2 kan bestemmes ved sondering hvert punkt af redox relæ og vurderingen af dens virkning på roGFP2 signalet. Et eksempel på denne teknik med ozon som en stimulus er påvist i undersøgelsen af Gibbs-Flournoy mfl 35.
For eksperimenter med H2O2 sensor er de ovennævnte betænkeligheder ikke som relevante, som OxyR1 domæne af HyPer sanser H2O2 direkte og ikke gennem en redox relæ. Men i modsætning til roGFP2, H2O2 sensor er følsomme over for ændringer i pH, hvilket kan forårsage ændringer i fluorescens ikke tilskrives H2O2 under et eksperiment. Derfor brugen af korrekt bufferet medier, en miljømæssig kammer til at opretholde den ønskede temperatur, og brugen af køretøjet kontrol er afgørende for enhver eksperiment udnytte H2O2 sensor. Derudover er fluorogenic sensorer blevet udviklet til specielt skærm pH, såsom Jytte, som udsender fluorescens i den røde kanal og kan være co udtrykt i celler, der også udtrykker HyPer45. Ideel pH kontrol til H2O2 sensor er SypHer, som er en version af H2O2 sensor, der har et enkelt punkt mutation gengivelse sig afskåret fra sense H2O2, endnu bevarer lydhørhed over for pH 46. det er også blevet observeret, at celler, der udtrykker H2O2 sensor kræver en længere baseline skal reagensglasset, især efter de transporteres fra en inkubator til site analyse, hvor de oplever små ændringer i media temperatur og pH. Det anbefales at erhverve mindst 5 datapunkter efter den oprindelige plan har stabiliseret før du begynder enhver udsættelse.
Sensorerne drøftet i denne metode, roGFP2 og HyPer, er to af mange fluorogenic sensorer, der har en række nye applikationer inden for toksikologi. Dette omfatter sensorer designet til at detektere ikke kun EGSH og H2O2, men peroxynitrite47, nitrogenoxid48,49, og endda ozon50. Disse sensorer kan udnyttes i live-celle imaging studier til specifikt og hensynsfuld måde overvåge de oxidative arter af interesse. Med fremskridt inden for teknikker såsom spektral urtåge, det er også muligt at co udtrykke to sensorer med lignende spectral karakteristik (inden for 5 nm af hinanden) i den samme celle, og Adskil andelen af fluorescens udledes af hver sensor51 . Denne teknik er af særlig interesse for roGFP2 og HyPer, som de indebærer excitationer og emission på de samme bølgelængder. Som kort nævnt her, kan visse sensorer være målrettet mod specifikke intracellulære rum, såsom mitokondrier, at observere oxidative begivenheder af interesse. Mens disse nye sensorer og teknikker er uden for rammerne af denne metode, henvises læseren til flere de seneste publikationer om emnet af intracellulære redox sensorer, såsom gennemgang af lønninger og kolleger52. Brug af genetisk kodet fluorogenic sensorer med live-celle imaging er en robust værktøj til overvågning af oxidative svar under toksikologiske vurderinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Den forskning, der er beskrevet i denne artikel har gennemgået af National Health og miljømæssige effekter Research Laboratory, US Environmental Protection Agency, og godkendt til offentliggørelse. Indholdet af denne artikel skal ikke fortolkes til at repræsentere agenturet politik, heller ikke udgør omtale af handelsnavne eller kommercielle produkter godkendelse eller anbefaling for brug.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Katelyn Lavrich for assistance med eksperimentelle design og manuskript redigeringer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| roGFP2 Plasmid | University of Oregon | N/A | Generous gift of S.J. Remington |
| HyPer Plasmid | Evrogen | FP941 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma Aldrich | H1009 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 10708984001 | |
| 9,10-Phenanthrenequinone | Sigma Aldrich | 156507 | |
| Black Wall Glass Bottomed Dishes | Ted Pella | 14029-20 | |
| BEAS-2B cell line | American Type Culture Collection | CRL-9609 | |
| Keratinocyte Basal Medium | Lonza | 192151 | |
| Keratinocyte Growth Medium BulletKit | Lonza | 192060 | |
| Excel | Microsoft Office Suite | N/A | |
| NIS-Elements AR Imaging Software | Nikon | N/A | |
| Nikon C1si Confocal Imaging System | Nikon | N/A |
References
- Cross, C. E., et al. Environmental oxidant pollutant effects on biologic systems: a focus on micronutrient antioxidant-oxidant interactions. Am J Respir Crit Care Med. 166, 44-50 (2002).
- Kobzik, L. Environmental particulate-mediated cytokine production in lung epithelial cells (A549): role of preexisting inflammation and oxidant stress. J Toxicol Environ Health. 55, 31-44 (1998).
- Jaeschke, H., McGill, M. R., Ramachandran, A. Oxidant stress, mitochondria, and cell death mechanisms in drug-induced liver injury: lessons learned from acetaminophen hepatotoxicity. Drug Metab Reviews. 44, 88-106 (2012).
- Wolf, M. B., Baynes, J. W. The anti-cancer drug, doxorubicin, causes oxidant stress-induced endothelial dysfunction. Biochim Biophys Acta. 1760, 267-271 (2006).
- Kumagai, Y., Shinkai, Y., Miura, T., Cho, A. K. The chemical biology of naphthoquinones and its environmental implications. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 52, 221-247 (2012).
- Pham, H. T., Maccarone, A. T., Campbell, J. L., Mitchell, T. W., Blanksby, S. J. Ozone-induced dissociation of conjugated lipids reveals significant reaction rate enhancements and characteristic odd-electron product ions. J Am Soc Mass Spectrom. 24, 286-296 (2013).
- Abdel-Malek, Z. A., Kadekaro, A. L., Swope, V. B. Stepping up melanocytes to the challenge of UV exposure. Pigment Cell Melanoma Res. 23, 171-186 (2010).
- Berisha, H., Pakbaz, H., Absood, A., Foda, H., Said, S. Nitric oxide mediates oxidant tissue injury caused by paraquat and xanthine oxidase. Ann N Y Acad Sci. 723, 422-425 (1994).
- Gao, X., et al. Mitochondrial dysfunction may explain the cardiomyopathy of chronic iron overload. Free Radic Bio Med. 49, 401-407 (2010).
- Shukla, A., et al. Asbestos induces mitochondrial DNA damage and dysfunction linked to the development of apoptosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 285, 1018-1025 (2003).
- Charles, R., Jayawardhana, T., Eaton, P.
- Thornalley, P. J., Rabbani, N. Detection of oxidized and glycated proteins in clinical samples using mass spectrometry-a user's perspective. Biochim Biophys Acta. 1840, 818-829 (2014).
- Arato, S., Ito, H., Miyashita, K., Hayakawa, K., Itabashi, Y. A facile method for the detection of aldehydes in oxidized lipids using solid-phase microextraction fiber and gas chromatograph equipped with a septum-free injector. J Oleo Sci. 58, 17-22 (2009).
- Collins, A. R. Measuring oxidative damage to DNA and its repair with the comet assay. Biochim Biophys Acta. 1840, 794-800 (2014).
- Churg, A., Keeling, B., Gilks, B., Porter, S., Olive, P. Rat mesothelial and tracheal epithelial cells show equal DNA sensitivity to hydrogen peroxide-induced oxidant injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 268, 832-838 (1995).
- Fraga, C. G., Oteiza, P. I., Galleano, M. In vitro measurements and interpretation of total antioxidant capacity. Biochim Biophys Acta. 1840, 931-934 (2014).
- Niki, E., Noguchi, N. Evaluation of antioxidant capacity: what capacity is being measured by which method. IUBMB Life. 50, 323-329 (2000).
- Pharikal, K., Das, P., Dey, C., Dasgupta, S. Tissue ascorbate as a metabolic marker in cadmium toxicity. Int J Vitam Nut Res. 58, 306-311 (1987).
- Tabata, M., Totani, M., Murachi, T. A chemiluminometric method for NADPH and NADH using a two-enzyme bioreactor and its application to the determination of magnesium in serum. Biomed Chrom. 4, 123-127 (1990).
- Ballatori, N., et al. Glutathione dysregulation and the etiology and progression of human diseases. Biol Chem. 390, 191-214 (2009).
- Nauseef, W. M. Detection of superoxide anion and hydrogen peroxide production by cellular NADPH oxidases. Biochim Biophys Acta. 1840, 757-767 (2014).
- Hawkins, C. L., Davies, M. J. Detection and characterisation of radicals in biological materials using EPR methodology. Biochim Biophys Acta. 1840, 708-721 (2014).
- Kettle, A. J., et al. Measuring chlorine bleach in biology and medicine. Biochim Biophys Acta. 1840, 781-793 (2014).
- Carballal, S., Bartesaghi, S., Radi, R. Kinetic and mechanistic considerations to assess the biological fate of peroxynitrite. Biochim Biophys Acta. 1840, 768-780 (2014).
- Meyer, A. J., Dick, T. P.
- Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. J Biol Chem. 279, 22284-22293 (2004).
- Malinouski, M., Zhou, Y., Belousov, V. V., Hatfield, D. L., Gladyshev, V. N. Hydrogen peroxide probes directed to different cellular compartments. PloS One. 6, 14564 (2011).
- Guzman, J. N., et al. Oxidant stress evoked by pacemaking in dopaminergic neurons is attenuated by DJ-1. Nature. 468, 696-700 (2010).
- Breckwoldt, M. O., et al. Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo. Nat Med. 20, 555-560 (2014).
- Wolf, A. M., Nishimaki, K., Kamimura, N., Ohta, S. Real-time monitoring of oxidative stress in live mouse skin. J Invest Dermatol. 134, 1701-1709 (2014).
- Mishina, N. M., et al. Does cellular hydrogen peroxide diffuse or act locally. Antioxid Redox Signal. , (2011).
- Gutscher, M., et al. Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential. Nat Methods. 5, 553-559 (2008).
- Lohman, J. R., Remington, S. J. Development of a family of redox-sensitive green fluorescent protein indicators for use in relatively oxidizing subcellular environments. Biochem. 47, 8678-8688 (2008).
- Schafer, F. Q., Buettner, G. R. Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple. Free Radic Bio Med. 30, 1191-1212 (2001).
- Gibbs-Flournoy, E. A., Simmons, S. O., Bromberg, P. A., Dick, T. P., Samet, J. M. Monitoring intracellular redox changes in ozone-exposed airway epithelial cells. Environ Health Perspect. 121, 312 (2013).
- Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat Methods. 3, 281-286 (2006).
- Wood, Z. A., Poole, L. B., Karplus, P. A. Peroxiredoxin evolution and the regulation of hydrogen peroxide signaling. Science. 300, 650-653 (2003).
- Sies, H. Role of Metabolic H2O2 Generation REDOX SIGNALING AND OXIDATIVE STRESS. J Biol Chem. 289, 8735-8741 (2014).
- Cheng, W. -Y., et al. Linking oxidative events to inflammatory and adaptive gene expression induced by exposure to an organic particulate matter component. Environ Health Perspect. 120, 267 (2012).
- Cheng, W. -Y., et al. An integrated imaging approach to the study of oxidative stress generation by mitochondrial dysfunction in living cells. Environ Health Perspect. , 902-908 (2010).
- Wages, P. A., et al. Role of H 2 O 2 in the oxidative effects of zinc exposure in human airway epithelial cells. Redox Biol. 3, 47-55 (2014).
- Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring E GSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radic Bio Med. 51, 1943-1951 (2011).
- Schwarzländer, M., Dick, T. P., Meyer, A. J., Morgan, B. Dissecting redox biology using fluorescent protein sensors. Antiox Redox Signal. 24, 680-712 (2016).
- Wang, L., Atkinson, R., Arey, J. Formation of 9, 10-phenanthrenequinone by atmospheric gas-phase reactions of phenanthrene. Atmos Environ. 41, 2025-2035 (2007).
- Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133, 10034-10037 (2011).
- Matlashov, M. E., et al. Fluorescent ratiometric pH indicator SypHer2: applications in neuroscience and regenerative biology. Biochim Biophys Acta. 1850, 2318-2328 (2015).
- Hou, J. -T., et al. A highly selective water-soluble optical probe for endogenous peroxynitrite. Chem Commun. 50, 9947-9950 (2014).
- Kojima, H., et al. Detection and imaging of nitric oxide with novel fluorescent indicators: diaminofluoresceins. Anal Chem. 70, 2446-2453 (1998).
- Gabe, Y., Ueno, T., Urano, Y., Kojima, H., Nagano, T. Tunable design strategy for fluorescence probes based on 4-substituted BODIPY chromophore: improvement of highly sensitive fluorescence probe for nitric oxide. Anal Bioanal Chem. 386, 621-626 (2006).
- Garner, A. L., et al. Specific fluorogenic probes for ozone in biological and atmospheric samples. Nat Chem. 1, 316-321 (2009).
- Cheng, W. -Y., Larson, J. M., Samet, J. M. Monitoring intracellular oxidative events using dynamic spectral unmixing microscopy. Methods. 66, 345-352 (2014).
- Wages, P. A., Cheng, W. -Y., Gibbs-Flournoy, E., Samet, J. M. Live-cell imaging approaches for the investigation of xenobiotic-induced oxidant stress. Biochim Biophys Acta. 1860, 2802-2815 (2016).
