JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Att kombinera röntgenkristallografi med små Angle X-Ray Scattering att modellera ostrukturerade regioner av Nsa1 från S. Cerevisiae

Published: January 10, 2018
doi:
10.3791/56953
, ,
1Signal Transduction Laboratory, National Institutes of Environmental Health Sciences, Department of Health and Human Services,National Institutes of Health

Summary

Denna metod beskriver kloning, uttryck och rening av rekombinant Nsa1 för strukturella bestämning av röntgenkristallografi och small-angle X-ray scattering (SAXS), och är tillämplig för hybrid strukturell analys av andra proteiner som innehåller både beställde och andningsstörningar domäner.

Abstract

Bestämning av Ribosomen församlingen faktor Nsa1 från Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) fullängds struktur är utmanande på grund av den oordnade och proteashämmare labila C-terminus av protein. Detta manuskript beskrivs metoder för att rena rekombinant Nsa1 från S. cerevisiae för strukturanalys av både röntgenkristallografi och SAXS. Röntgenkristallografi utnyttjades för att lösa strukturen av Nsa1 välordnad N-terminala WD40 domän, och sedan SAXS användes för att lösa C-terminus av Nsa1 struktur i lösning. Lösning scattering data samlades in från fullängds Nsa1 i lösning. De teoretiska scattering amplituderna beräknades från högupplösta kristallstrukturen i WD40 domänen, och sedan en kombination av stel kropp och rättsverkan modellering visade C-terminus av Nsa1. Genom denna hybrid strategi rekonstruerades den Kvartära strukturen av hela proteinet. De metoder som presenteras här bör vara allmänt tillämpliga för hybrid strukturella bestämning av andra proteiner som består av en blandning av strukturerad och ostrukturerad domäner.

Introduction

Ribosomer är stora ribonukleoprotein maskiner som utför viktiga roll att översätta mRNA till proteiner i alla levande celler. Ribosomerna består av två subenheter som produceras i en komplex process som kallas ribosom biogenes1,2,3,4. Eukaryota Ribosomen församling är beroende av hjälp av hundratals väsentliga ribosomal församlingen faktorer2,3,5. Nsa1 (Nop7 tillhörande 1) är en faktor av eukaryota Ribosomen-församlingen som särskilt krävs för produktionen av den stora ribosomal subunit6, och är känd som WD-repeat som innehåller 74 (WDR74) i högre organismer7. WDR74 har visat sig krävas för blastocyst bildandet i möss8och WDR74 arrangören är ofta muterad i cancer celler9. Funktion och exakta mekanismer av Nsa1/WDR74 i Ribosomen församling är dock fortfarande till stor del okända. Till att börja med att avslöja Nsa1/WDR74 roll under eukaryota Ribosomen mognad utfördes flera strukturella analyser, inklusive röntgenkristallografi och små angle X-ray scattering (SAXS)10.

Röntgenkristallografi, kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi, elektronmikroskopi och SAXS finns alla viktiga tekniker för att studera makromolekylära struktur. Storlek, form, tillgänglighet och stabilitet av makromolekyler influenser strukturbiologi metoden som en särskild makromolekyl blir bäst lämpade, men kombinerar flera tekniker genom en s.k. ”hybrid” strategi blir en allt mer fördelaktigt verktyg11. Röntgenkristallografi och SAXS är särskilt kraftfull och kompletterande metoder för strukturella bestämning av makromolekyler12.

Kristallografi ger högupplösta atomära strukturer alltifrån små molekyler till stora cellulära maskineriet såsom Ribosomen, och har lett till många genombrott i förståelsen av de biologiska funktionerna av proteiner och andra makromolekyler13. Dessutom utnyttjar strukturbaserad design kraften i kristallen strukturerar för molekylär dockning av beräkningsmetoder, lägga till en kritisk dimension i drug discovery och utveckling14. Trots dess breda tillämplighet är flexibel och oordnade system utmanande att bedöma av kristallografi sedan crystal packning kan hindras eller electron densitet kartor kan vara ofullständig eller av dålig kvalitet. Omvänt, SAXS är en lösning-baserade och lågupplösta strukturell strategi kan beskriva flexibla system alltifrån oordnade loopar och termini till egensäkra oordnade proteiner12,15,16. Med tanke på den är kompatibel med ett brett spektrum av partikel storlekar12, kan SAXS arbeta synergistiskt med kristallografi att öka utbudet av biologiska frågor som kan lösas av strukturella studier.

Nsa1 är lämplig för en hybrid strukturell strategi eftersom det innehåller en väl strukturerad WD40 domän följt av en funktionell, men flexibel C-terminus som inte är mottagliga för röntgenkristallografi metoder. Följande är ett protokoll för kloning, uttryck och rening av S. cerevisiae Nsa1 för hybrid strukturella bestämning av röntgenkristallografi och SAXS. Detta protokoll kan anpassas för att studera strukturerna av andra proteiner som består av en kombination av beställda och störda områden.

Protocol

1. rekombinant proteinproduktion och rening av Nsa 1 Nsa1 uttryck Plasmid Design och kloning Få eller köpa S. cerevisiae genomiskt DNA. PCR förstärker de mål sekvenserna av Nsa1 (Nsa1FL, rester 1-463) och C-terminal trunkeras Nsa1 (Nsa1ΔC, rester 1-434) med lämplig grundfärg med genomiskt DNA isolerade från S. cerevisiae och en smälttemperatur cirka 60 ° C med en förlängning på 1-2 min. Följande grundfärger användes för att förstärka…

Representative Results

Nsa1 var PCR amplifierats från S. cerevisiae genomiskt DNA och subcloned i en vektor innehållande en N-terminal 6 x-histidin affinitet tagg följt av MBP och en TEV proteas webbplats. Nsa1 förvandlades till E. coli BL21(DE3) celler och hög avkastning i proteinuttryck erhölls efter induktion med IPTG och tillväxt vid 25 ° C över natten (figur 1A). Nsa1 var affinitet-renat på immobiliserade kobolt affinitet harts, följt av MBP klyvni…

Discussion

Användning av detta protokoll, genererades rekombinant Nsa1 från S. cerevisiae för strukturella studier av både röntgenkristallografi och SAXS. Nsa1 var skötsam i lösning och kristalliserade i flera crystal former. Under optimering av dessa kristaller upptäckte att C-terminus av Nsa1 var känsliga för proteas nedbrytning. Den höga upplösningen, ortorombiskt kristallform kunde endast dupliceras med C-terminal trunkering varianter av Nsa1, sannolikt eftersom flexibla C-terminus av Nsa1 hindrade crystal …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diffraktion data samlades in på southeasten regionala samarbete tillgång Team (SER-CAT) 22-ID och 22-BM linjer på Advanced Photon Source (APS), Argonne National Laboratory. SAXS data samlades in på den SIBYLS beamline på förhand ljus källa (ALS), Lawrence Berkeley National Laboratory. Vi vill tacka Personalen på den SIBYLS beamline för hjälp med remote datainsamling och bearbetning. Vi är tacksamma för nationella Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) Mass Spectrometry forskning och stödgruppen för hjälp med att avgöra protein domän gränserna. Detta arbete fick stöd av oss nationella institutet för hälsa intramurala forskningsprogrammet; US National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) (ZIA ES103247 till R. E. S.) och kanadensiska institut för hälsoforskning (CIHR, 146626 till M.C.P). Användning av APS stöddes av oss Department of Energy, Office of Science, kontor av grundläggande Energivetenskaper under Kontraktsnr W-31-109-Eng-38. Användning av avancerade ljus källa (ALS) stöddes av direktören, Office of Science, kontor av grundläggande Energivetenskaper, av US Department of Energy under Kontraktsnr DE-AC02-05CH11231. Ytterligare stöd för den SIBYLS SAXS beamline kommer från National Institute of Health projektet MINOS (R01GM105404) och en High-End Instrumentation Grant S10OD018483. Vi vill också tacka Andrea Moon och Dr Sara Andres för deras kritisk läsning av detta manuskript.

Materials

Molecular Cloning of Nsa1
pMBP2 parallel vector Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999) We used a modified version of pMBP2 which included an N-terminal His-tag (pHMBP)
S. cerevisiae genomic DNA ATCC 204508D-5
Primers for cloning Nsa1
SC_Nsa1_FLFw IDT CGC CAA AGG CCT
ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT
GGATAG
SC_Nsa1_FLRv IDT AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT
GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC
AGC
SC_Nsa1_DeltaCFw IDT GGGCGCCATGGGATCCATGAGG
TTACTAGTCAGCTGTGTGG
SC_Nsa1_DeltaCRv IDT GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC
CTTCCTTTTTTGCTTCCC
Recombinant Protein Production and Purification of Nsa1
Escherichia coli BL21 (DE3) Star Cells Invitrogen C601003
pMBP- NSA1 and various truncations Lo et al., 2017
Selenomethionine Molecular Dimensions MD12-503B
IPTG, Dioxane-Free Promega V3953
EDTA Free Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich 4693159001
Sodium Chloride Caledon Laboratory Chemicals 7560-1-80
Magnesium Chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
Tris Buffer, 1 M pH7.5 KD Medical RGF-3340
Glycerol Invitrogen 15514-029
beta-mercaptoethanol Sigma M6250
1M Imidazole, pH 8.0 Teknova I6980-06
Talon Affinity Resin Clonetech 635503
Amicon Ultra 15 mL Centrifugal Filter (MWCO 10K) Millipore UFC901024
HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade Gel Filtration Column GE-Healthcare 28989335
TEV Protease Prepared by NIEHS Protein Expression Core Expression plasmid provided by NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009)
4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels BioRad 456-8056
Crystallization, Proteolytic Screening
Crystal Screen Hampton Research HR2-110
Crystal Screen 2 Hampton Research HR2-112
Salt Rx Hampton Research HR2-136
Index  Screen Hampton Research HR2-144
PEG/Ion Screen Hampton Research HR2-139
JCSG+ Molecular Dimensions MD1-37
Wizard Precipitant Synergy  Molecular Dimensions MD15-PS-T
Swissci 96-well 3-drop UVP sitting drop plates TTP Labtech 4150-05823
3inch Wide Crystal Clear Sealing Tape Hampton Research HR4-506
Proti-Ace Kit Hampton Research HR2-429
PEG 1500 Molecular Dimensions MD2-100-6
PEG 400 Molecular Dimensions MD2-100-3
HEPES/sodium hydroxide pH 7.5 Molecular Dimensions MD2-011-
Sodium Citrate tribasic Molecular Dimensions MD2-100-127
22 mm x 0.22 mm Siliconized Coverslides Hampton Research HR3-231
24 Well Plates with sealant (VDX Plate with Sealant) Hampton Research HR3-172
 18 mM Mounted Nylon Loops (0.05 mm to 0.5 mM) Hampton Research HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971
Seed Bead Kit Hampton Research HR2-320
Magnetic Crystal Caps Hampton Research HR4-779
Magnetic Cryo Wand Hampton Research HR4-729
Cryogenic Foam Dewar Hampton Research HR4-673
Crystal Puck System MiTeGen M-CP-111-021
Full Skirt 96 well Clear Plate VWR 10011-228
AxyMat Sealing Mat VWR 10011-130
Equipment
UVEX-m JAN Scientific, Inc.
Nanodrop Lite Spectrophotometer Thermo-Fisher
Mosquito Robot TTP Labtech
Software/Websites
HKL2000 Otwinoski and Minor, 1997
Phenix Adams et al., 2010
Coot Emsley et al., 2010
ATSAS Petoukhov et al., 2012 https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/
Scatter Rambo and Tainer, 2013
Pymol The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schrödinger, LLC.
BUNCH Petoukhov and Svergun, 2005
CRYSOL Svergun et al, 1995
PRIMUS Konarev et al, 2003
EOM Tria et al, 2015
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thomson, E., Ferreira-Cerca, S., Hurt, E. Eukaryotic ribosome biogenesis at a glance. J Cell Sci. 126 (Pt 21), 4815-4821 (2013).
  2. Woolford, J. L., Baserga, S. J. Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).
  3. Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. A Puzzle of Life: Crafting Ribosomal Subunits. Trends Biochem Sci. , (2017).
  4. Tomecki, R., Sikorski, P. J., Zakrzewska-Placzek, M. Comparison of preribosomal RNA processing pathways in yeast, plant and human cells – focus on coordinated action of endo- and exoribonucleases. FEBS Lett. , (2017).
  5. Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. Driving ribosome assembly. Biochim Biophys Acta. 1803 (6), 673-683 (2010).
  6. Kressler, D., Roser, D., Pertschy, B., Hurt, E. The AAA ATPase Rix7 powers progression of ribosome biogenesis by stripping Nsa1 from pre-60S particles. J Cell Biol. 181 (6), 935-944 (2008).
  7. Hiraishi, N., Ishida, Y., Nagahama, M. AAA-ATPase NVL2 acts on MTR4-exosome complex to dissociate the nucleolar protein WDR74. Biochem Biophy Res Co. 467 (3), 534-540 (2015).
  8. Maserati, M., et al. Wdr74 is required for blastocyst formation in the mouse. PLoS One. 6 (7), e22516 (2011).
  9. Weinhold, N., Jacobsen, A., Schultz, N., Sander, C., Lee, W. Genome-wide analysis of noncoding regulatory mutations in cancer. Nat Genet. 46 (11), 1160-1165 (2014).
  10. Lo, Y. H., Romes, E. M., Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Structural Analysis Reveals Features of Ribosome Assembly Factor Nsa1/WDR74 Important for Localization and Interaction with Rix7/NVL2. Structure. 25 (5), 762-772 (2017).
  11. Lander, G. C., Saibil, H. R., Nogales, E. Go hybrid: EM, crystallography, and beyond. Curr Opin Struc Biol. 22 (5), 627-635 (2012).
  12. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Q Rev Biophys. 40 (3), 191-285 (2007).
  13. Jaskolski, M., Dauter, Z., Wlodawer, A. A brief history of macromolecular crystallography, illustrated by a family tree and its Nobel fruits. FEBS J. 281 (18), 3985-4009 (2014).
  14. Zheng, H., et al. X-ray crystallography over the past decade for novel drug discovery – where are we heading next?. Expert Opin Drug Dis. 10 (9), 975-989 (2015).
  15. Kikhney, A. G., Svergun, D. I. A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins. FEBS Lett. 589 (19 Pt A), 2570-2577 (2015).
  16. Bernado, P., Mylonas, E., Petoukhov, M. V., Blackledge, M., Svergun, D. I. Structural characterization of flexible proteins using small-angle X-ray scattering. J Am Chem Soc. 129 (17), 5656-5664 (2007).
  17. Sheffield, P., Garrard, S., Derewenda, Z. Overcoming expression and purification problems of RhoGDI using a family of “parallel” expression vectors. Protein Expres Purif. 15 (1), 34-39 (1999).
  18. Doublie, S. Preparation of selenomethionyl proteins for phase determination. Methods Enzymol. 276, 523-530 (1997).
  19. Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).
  20. Wlodawer, A., Minor, W., Dauter, Z., Jaskolski, M. Protein crystallography for aspiring crystallographers or how to avoid pitfalls and traps in macromolecular structure determination. FEBS J. 280 (22), 5705-5736 (2013).
  21. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Macromolecular Crystallography, Pt A. 276, 307-326 (1997).
  22. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).
  23. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr D. 67 (Pt 4), 235-242 (2011).
  24. Terwilliger, T. C., et al. Decision-making in structure solution using Bayesian estimates of map quality: the PHENIX AutoSol wizard. Acta Crystallographica Section D. 65, 582-601 (2009).
  25. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  26. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallogr D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
  27. McCoy, A. J. Solving structures of protein complexes by molecular replacement with Phaser. Acta Crystallogr D. 63 (Pt 1), 32-41 (2007).
  28. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. J Appl Crystallogr. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
  29. Dyer, K. N., et al. High-throughput SAXS for the characterization of biomolecules in solution: a practical approach. Methods Mol Biol. 1091, 245-258 (2014).
  30. Forster, S., Apostol, L., Bras, W. Scatter: software for the analysis of nano- and mesoscale small-angle scattering. J Appl Crystallogr. 43, 639-646 (2010).
  31. Petoukhov, M. V., et al. New developments in the ATSAS program package for small-angle scattering data analysis. J Appl Crystallogr. 45, 342-350 (2012).
  32. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. J Appl Crystallogr. 36, 1277-1282 (2003).
  33. Svergun, D. I. Determination of the Regularization Parameter in Indirect-Transform Methods Using Perceptual Criteria. J Appl Crystallogr. 25, 495-503 (1992).
  34. Rambo, R. P., Tainer, J. A. Accurate assessment of mass, models and resolution by small-angle scattering. Nature. 496 (7446), 477-481 (2013).
  35. Petoukhov, M. V., Svergun, D. I. Global rigid body modeling of macromolecular complexes against small-angle scattering data. Biophys J. 89 (2), 1237-1250 (2005).
  36. Tria, G., Mertens, H. D., Kachala, M., Svergun, D. I. Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering. IUCrJ. 2 (Pt 2), 207-217 (2015).
  37. Svergun, D., Barberato, C., Koch, M. H. J. CRYSOL – A program to evaluate x-ray solution scattering of biological macromolecules from atomic coordinates. J Appl Crystallogr. 28, 768-773 (1995).
  38. . The PyMOL Molecular Graphics System Version 1.8 Available from: https://pymol.org (2015)
  39. Pelikan, M., Hura, G. L., Hammel, M. Structure and flexibility within proteins as identified through small angle X-ray scattering. Gen Physiol Biophys. 28 (2), 174-189 (2009).
  40. Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. Protein stability: a crystallographer’s perspective. Acta Crystallogr F. 72 (Pt 2), 72-95 (2016).
  41. Hinsen, K. Structural flexibility in proteins: impact of the crystal environment. Bioinformatics. 24 (4), 521-528 (2008).
  42. Shtykova, E. V., et al. Structural analysis of influenza A virus matrix protein M1 and its self-assemblies at low pH. PLoS One. 8 (12), e82431 (2013).
  43. Mallam, A. L., et al. Solution structures of DEAD-box RNA chaperones reveal conformational changes and nucleic acid tethering by a basic tail. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12254-12259 (2011).
  44. Papaleo, E., et al. The Role of Protein Loops and Linkers in Conformational Dynamics and Allostery. Chem Rev. 116 (11), 6391-6423 (2016).
  45. Rozycki, B., Boura, E. Large, dynamic, multi-protein complexes: a challenge for structural biology. J Phys Condens Matter. 26 (46), 463103 (2014).
  46. Schlundt, A., Tants, J. N., Sattler, M. Integrated structural biology to unravel molecular mechanisms of protein-RNA recognition. Methods. 118, 119-136 (2017).
  47. Thompson, M. K., Ehlinger, A. C., Chazin, W. J. Analysis of Functional Dynamics of Modular Multidomain Proteins by SAXS and NMR. Methods Enzymol. 592, 49-76 (2017).

Tags

X-ray CrystallographySmall Angle X-ray Scattering (SAXS)Structural AnalysisProtein StructureRecombinant ProteinUnstructured RegionsNsa1S. CerevisiaeHybrid Structural AnalysisProtein FunctionProtein DynamicsProtein AggregationPurificationAffinity ChromatographyGel FiltrationSDS-PAGETEV ProteaseCentrifugal Filtration

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Lo, Y., Pillon, M. C., Stanley, R. E. Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae. J. Vis. Exp. (131), e56953, doi:10.3791/56953 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image