Denna metod beskriver kloning, uttryck och rening av rekombinant Nsa1 för strukturella bestämning av röntgenkristallografi och small-angle X-ray scattering (SAXS), och är tillämplig för hybrid strukturell analys av andra proteiner som innehåller både beställde och andningsstörningar domäner.
Bestämning av Ribosomen församlingen faktor Nsa1 från Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) fullängds struktur är utmanande på grund av den oordnade och proteashämmare labila C-terminus av protein. Detta manuskript beskrivs metoder för att rena rekombinant Nsa1 från S. cerevisiae för strukturanalys av både röntgenkristallografi och SAXS. Röntgenkristallografi utnyttjades för att lösa strukturen av Nsa1 välordnad N-terminala WD40 domän, och sedan SAXS användes för att lösa C-terminus av Nsa1 struktur i lösning. Lösning scattering data samlades in från fullängds Nsa1 i lösning. De teoretiska scattering amplituderna beräknades från högupplösta kristallstrukturen i WD40 domänen, och sedan en kombination av stel kropp och rättsverkan modellering visade C-terminus av Nsa1. Genom denna hybrid strategi rekonstruerades den Kvartära strukturen av hela proteinet. De metoder som presenteras här bör vara allmänt tillämpliga för hybrid strukturella bestämning av andra proteiner som består av en blandning av strukturerad och ostrukturerad domäner.
Ribosomer är stora ribonukleoprotein maskiner som utför viktiga roll att översätta mRNA till proteiner i alla levande celler. Ribosomerna består av två subenheter som produceras i en komplex process som kallas ribosom biogenes1,2,3,4. Eukaryota Ribosomen församling är beroende av hjälp av hundratals väsentliga ribosomal församlingen faktorer2,3,5. Nsa1 (Nop7 tillhörande 1) är en faktor av eukaryota Ribosomen-församlingen som särskilt krävs för produktionen av den stora ribosomal subunit6, och är känd som WD-repeat som innehåller 74 (WDR74) i högre organismer7. WDR74 har visat sig krävas för blastocyst bildandet i möss8och WDR74 arrangören är ofta muterad i cancer celler9. Funktion och exakta mekanismer av Nsa1/WDR74 i Ribosomen församling är dock fortfarande till stor del okända. Till att börja med att avslöja Nsa1/WDR74 roll under eukaryota Ribosomen mognad utfördes flera strukturella analyser, inklusive röntgenkristallografi och små angle X-ray scattering (SAXS)10.
Röntgenkristallografi, kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi, elektronmikroskopi och SAXS finns alla viktiga tekniker för att studera makromolekylära struktur. Storlek, form, tillgänglighet och stabilitet av makromolekyler influenser strukturbiologi metoden som en särskild makromolekyl blir bäst lämpade, men kombinerar flera tekniker genom en s.k. ”hybrid” strategi blir en allt mer fördelaktigt verktyg11. Röntgenkristallografi och SAXS är särskilt kraftfull och kompletterande metoder för strukturella bestämning av makromolekyler12.
Kristallografi ger högupplösta atomära strukturer alltifrån små molekyler till stora cellulära maskineriet såsom Ribosomen, och har lett till många genombrott i förståelsen av de biologiska funktionerna av proteiner och andra makromolekyler13. Dessutom utnyttjar strukturbaserad design kraften i kristallen strukturerar för molekylär dockning av beräkningsmetoder, lägga till en kritisk dimension i drug discovery och utveckling14. Trots dess breda tillämplighet är flexibel och oordnade system utmanande att bedöma av kristallografi sedan crystal packning kan hindras eller electron densitet kartor kan vara ofullständig eller av dålig kvalitet. Omvänt, SAXS är en lösning-baserade och lågupplösta strukturell strategi kan beskriva flexibla system alltifrån oordnade loopar och termini till egensäkra oordnade proteiner12,15,16. Med tanke på den är kompatibel med ett brett spektrum av partikel storlekar12, kan SAXS arbeta synergistiskt med kristallografi att öka utbudet av biologiska frågor som kan lösas av strukturella studier.
Nsa1 är lämplig för en hybrid strukturell strategi eftersom det innehåller en väl strukturerad WD40 domän följt av en funktionell, men flexibel C-terminus som inte är mottagliga för röntgenkristallografi metoder. Följande är ett protokoll för kloning, uttryck och rening av S. cerevisiae Nsa1 för hybrid strukturella bestämning av röntgenkristallografi och SAXS. Detta protokoll kan anpassas för att studera strukturerna av andra proteiner som består av en kombination av beställda och störda områden.
Användning av detta protokoll, genererades rekombinant Nsa1 från S. cerevisiae för strukturella studier av både röntgenkristallografi och SAXS. Nsa1 var skötsam i lösning och kristalliserade i flera crystal former. Under optimering av dessa kristaller upptäckte att C-terminus av Nsa1 var känsliga för proteas nedbrytning. Den höga upplösningen, ortorombiskt kristallform kunde endast dupliceras med C-terminal trunkering varianter av Nsa1, sannolikt eftersom flexibla C-terminus av Nsa1 hindrade crystal …
The authors have nothing to disclose.
Diffraktion data samlades in på southeasten regionala samarbete tillgång Team (SER-CAT) 22-ID och 22-BM linjer på Advanced Photon Source (APS), Argonne National Laboratory. SAXS data samlades in på den SIBYLS beamline på förhand ljus källa (ALS), Lawrence Berkeley National Laboratory. Vi vill tacka Personalen på den SIBYLS beamline för hjälp med remote datainsamling och bearbetning. Vi är tacksamma för nationella Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) Mass Spectrometry forskning och stödgruppen för hjälp med att avgöra protein domän gränserna. Detta arbete fick stöd av oss nationella institutet för hälsa intramurala forskningsprogrammet; US National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) (ZIA ES103247 till R. E. S.) och kanadensiska institut för hälsoforskning (CIHR, 146626 till M.C.P). Användning av APS stöddes av oss Department of Energy, Office of Science, kontor av grundläggande Energivetenskaper under Kontraktsnr W-31-109-Eng-38. Användning av avancerade ljus källa (ALS) stöddes av direktören, Office of Science, kontor av grundläggande Energivetenskaper, av US Department of Energy under Kontraktsnr DE-AC02-05CH11231. Ytterligare stöd för den SIBYLS SAXS beamline kommer från National Institute of Health projektet MINOS (R01GM105404) och en High-End Instrumentation Grant S10OD018483. Vi vill också tacka Andrea Moon och Dr Sara Andres för deras kritisk läsning av detta manuskript.
Molecular Cloning of Nsa1 | |||
pMBP2 parallel vector | Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999) | We used a modified version of pMBP2 which included an N-terminal His-tag (pHMBP) | |
S. cerevisiae genomic DNA | ATCC | 204508D-5 | |
Primers for cloning Nsa1 | |||
SC_Nsa1_FLFw | IDT | CGC CAA AGG CCT ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT GGATAG |
|
SC_Nsa1_FLRv | IDT | AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC AGC |
|
SC_Nsa1_DeltaCFw | IDT | GGGCGCCATGGGATCCATGAGG TTACTAGTCAGCTGTGTGG |
|
SC_Nsa1_DeltaCRv | IDT | GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC CTTCCTTTTTTGCTTCCC |
|
Recombinant Protein Production and Purification of Nsa1 | |||
Escherichia coli BL21 (DE3) Star Cells | Invitrogen | C601003 | |
pMBP- NSA1 and various truncations | Lo et al., 2017 | ||
Selenomethionine | Molecular Dimensions | MD12-503B | |
IPTG, Dioxane-Free | Promega | V3953 | |
EDTA Free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | |
Sodium Chloride | Caledon Laboratory Chemicals | 7560-1-80 | |
Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
Tris Buffer, 1 M pH7.5 | KD Medical | RGF-3340 | |
Glycerol | Invitrogen | 15514-029 | |
beta-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
1M Imidazole, pH 8.0 | Teknova | I6980-06 | |
Talon Affinity Resin | Clonetech | 635503 | |
Amicon Ultra 15 mL Centrifugal Filter (MWCO 10K) | Millipore | UFC901024 | |
HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade Gel Filtration Column | GE-Healthcare | 28989335 | |
TEV Protease | Prepared by NIEHS Protein Expression Core | Expression plasmid provided by NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009) | |
4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BioRad | 456-8056 | |
Crystallization, Proteolytic Screening | |||
Crystal Screen | Hampton Research | HR2-110 | |
Crystal Screen 2 | Hampton Research | HR2-112 | |
Salt Rx | Hampton Research | HR2-136 | |
Index Screen | Hampton Research | HR2-144 | |
PEG/Ion Screen | Hampton Research | HR2-139 | |
JCSG+ | Molecular Dimensions | MD1-37 | |
Wizard Precipitant Synergy | Molecular Dimensions | MD15-PS-T | |
Swissci 96-well 3-drop UVP sitting drop plates | TTP Labtech | 4150-05823 | |
3inch Wide Crystal Clear Sealing Tape | Hampton Research | HR4-506 | |
Proti-Ace Kit | Hampton Research | HR2-429 | |
PEG 1500 | Molecular Dimensions | MD2-100-6 | |
PEG 400 | Molecular Dimensions | MD2-100-3 | |
HEPES/sodium hydroxide pH 7.5 | Molecular Dimensions | MD2-011- | |
Sodium Citrate tribasic | Molecular Dimensions | MD2-100-127 | |
22 mm x 0.22 mm Siliconized Coverslides | Hampton Research | HR3-231 | |
24 Well Plates with sealant (VDX Plate with Sealant) | Hampton Research | HR3-172 | |
18 mM Mounted Nylon Loops (0.05 mm to 0.5 mM) | Hampton Research | HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971 | |
Seed Bead Kit | Hampton Research | HR2-320 | |
Magnetic Crystal Caps | Hampton Research | HR4-779 | |
Magnetic Cryo Wand | Hampton Research | HR4-729 | |
Cryogenic Foam Dewar | Hampton Research | HR4-673 | |
Crystal Puck System | MiTeGen | M-CP-111-021 | |
Full Skirt 96 well Clear Plate | VWR | 10011-228 | |
AxyMat Sealing Mat | VWR | 10011-130 | |
Equipment | |||
UVEX-m | JAN Scientific, Inc. | ||
Nanodrop Lite Spectrophotometer | Thermo-Fisher | ||
Mosquito Robot | TTP Labtech | ||
Software/Websites | |||
HKL2000 | Otwinoski and Minor, 1997 | ||
Phenix | Adams et al., 2010 | ||
Coot | Emsley et al., 2010 | ||
ATSAS | Petoukhov et al., 2012 | https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/ | |
Scatter | Rambo and Tainer, 2013 | ||
Pymol | The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schrödinger, LLC. | ||
BUNCH | Petoukhov and Svergun, 2005 | ||
CRYSOL | Svergun et al, 1995 | ||
PRIMUS | Konarev et al, 2003 | ||
EOM | Tria et al, 2015 |