Summary

הכנת פרוסות דג זברה למבוגרים עבור לשעבר Vivo הדמיה ניסויים ברשתית טריים

Published: May 09, 2018
doi:

Summary

הדמיה רקמת רשתית יכול לספק מידע מתא בודד לא יכול להיות שנאספו שיטות ביוכימיות מסורתיות. פרוטוקול זה מתאר הכנה של הרשתית פרוסות דג זברה הדמיה קונפוקלי. פלורסנט מקודדים גנטית חיישנים או מחוון צבע לאפשר הדמיה של תהליכים ביולוגיים רבים סוגי תאים ברשתית ברורים.

Abstract

הרשתית היא רקמה מורכבת יוזם ו משתלב הצעדים הראשונים של חזון. תפקוד לקוי של תאים ברשתית מהווה סימן היכר של מחלות רבות מסנוור, טיפולים עתידיים-טיבית ההבנות הבסיסיות על הרשתית כמה שונה התאים לתפקד כרגיל. צובר מידע כזה עם שיטות ביוכימיות הוכיחו קשה כי תרומות של סוגי תאים מסוים הם הצטמצמו בחצרו תאים ברשתית. הדמיה רשתית חיה יכול לספק תצוגה של תהליכים ביולוגיים רבים על רמה של subcellular, בזכות מספר גדל והולך של מקודדים גנטית ביולוגיים פלורסנט. עם זאת, טכניקה זו כה הוגבלה ראשנים של הזחלים דג זברה, שכבות הרשתית החיצונית ביותר של הרשתיות מבודד, או הדמיה ברזולוציה נמוכה יותר של הרשתית בבעלי חיים. כאן אנו מציגים שיטה ליצירת חיים שמחוץ ברשתית פרוסות של דג זברה למבוגרים עבור הדמיה בשידור חי דרך מיקרוסקופיה קונפוקלית. הכנה זו מניבה פרוסות רוחבי עם כל שכבות הרשתית ואת רוב סוגי תאים גלויים לביצוע ניסויים הדמיה קונאפוקלית באמצעות זלוף. דג זברה מהונדס לביטוי החלבונים פלורסנט או ביולוגיים סוגי תאים ברשתית מסוימים או organelles משמשים כדי לחלץ מידע מתא בודד רשתית העין שלמות. בנוסף, ניתן לטעון פרוסות ברשתית עם צבעי פלורסנט מחוון, הוספת צדדיות של השיטה. פרוטוקול זה פותחה עבור הדמיה Ca2 + בתוך דג זברה חרוט photoreceptors, אבל עם סמנים תקין זה יכול להיות מותאם למדוד Ca2 + או מטבוליטים של תאים, התאים הפרעה דו קוטבית או אופקי, מיקרוגלייה, תאי אמקרין או רשתית מולר תאי גנגליון. אפיתל הפיגמנט ברשתית יוסר פרוסות כך שיטה זו אינה מתאימה ללמוד את סוג התא. בפועל, זה ניתן להפיק פרוסות טורי מחיה לחיה לניסויים מרובים. טכניקה זו הסתגלות מספק כלי רב עוצמה עבור לענות על שאלות רבות אודות ביולוגיה של התא רשתית, Ca2 +אנרגיה הומאוסטזיס.

Introduction

דג זברה (רזבורה rerio) להיות בשימוש נרחב רפואי ומחקר מדעי בסיסי1, בשל גודלו הקטן, פיתוח מהיר ומערכות איברים חוליות. השקיפות הטבעית של הזחלים דג זברה בשילוב עם שיטות הוקמה transgenesis אפשרו ויזואליזציה מפורטת של תהליכים תאיים בחיים. מספר של מקודדים גנטית ביולוגיים פלורסנט סומנו כמטרות לתאים דג זברה ספציפי כדי לזהות Ca2 + 2, מימן על-חמצני3, מוות הפעלה4 ו- ATP5

In vivo הדמיה של דג זברה הזחלים הוביל פריצת דרך בתחום של מדעי המוח, כולל מיפוי של המוח המעגלים6 , פיתוח תרופות עבור מערכת העצבים המרכזית הפרעות7. דג זברה מתאימים היטב לחקר הראייה שלהם כוללים את מבנה למינריות והסוגים נוירון של חולייתנים הגבוהים, הם מציגים התנהגויות חזותיים חזקים8,9. מספר סוגים של הרשתית degenerations מקביל מחלות אנושיות המודל בהצלחה ולמד דג זברה10,11, כולל הדמיה חיה של הפרט photoreceptors מושחת בתוך הרשתית2, 12.

בעוד ויוו דג זברה זחל הדמיה הוא כלי רב ערך, הוא הופך להיות יותר מאתגר כמו דגים לגדול ולהתפתח פיגמנטציה, טיפולי תרופתי כלשהו לא יכול לחדור חיה שלמה. יתר על כן, תהליכים תאיים מסוימים לשנות עם הגיל, ופיתוח עושה מאוחר יותר נקודות זמן קריטי עבור הפונקציה להבנה, התקדמות המחלה בבעלי חיים למבוגרים. שיטות ביוכימיות כגון immunoblot, quantitiative ה-PCR, צריכת2 O ניתוחים metabolomic יכול לספק רמזים חשובים על הביולוגיה של הרשתית בכללותה, אך קשה להבחין תרומות של סוגי תאים בודדים מושפע המחלה. הדמיה רקמת רשתית מבודד שמחוץ עוקף בעיות אלה, בעוד הדמיה במול הרשתיות הנטען מעניק תצוגה של הרשתית החיצונית13, תכונות ברשתית פנימי עמוק יותר מטושטשות. אופסין # רטינל רוחבי פרוסות, כגון אלה הציג באופן קבוע ניתוחים immunohistochemical, מאפשרים תצוגה ברורה של כל שכבות וסוגי תא אלא מציעים רק תמונה אחת של תהליכים דינמיים מעורב תפקוד תקין ומחלות.

כאן, אנו מציגים שיטה ליצירת שמחוץ רוחבי ברשתית פרוסות של דג זברה למבוגרים עבור הדמיה. זה דומה שיטות להכנת פרוסות ברשתית דו-חיים, דג זברה מחקרים אלקטרופיזיולוגיות מורפולוגי14,15, עם שינויים חשובים עבור זמן לשגות הדמיה שמחוץ באמצעות קונפוקלי מיקרוסקופ. קרינה פלואורסצנטית תגובות ביולוגיים או צבעי פרוסות מנוטרים בזמן אמת עם מיקרוסקופ קונפוקלי תוך אספקת סוכנים תרופתי באמצעות זלוף. בעוד השיטה פותחה עבור הדמיה photoreceptors, זה יכול להיות אפשרי להשתמש בו ליצירת אפקטים של תאים, תאים דו-קוטביים, תאים אופקיים, תאי אמקרין או תאי גנגליון מולר עם סמנים פלורסנט המתאים. בנוסף, ניתן לטעון פרוסות עם צבעי פלורסנט תא חדיר דוח תא הכדאיות, תחבורה vesicular, הפונקציה מיטוכונדריאלי או מצב חמצון-חיזור. בתכשיר רב תכליתי מאפשר הדמיה של מגוון רחב של תהליכים subcellular לאורך הרשתית, כולל Ca2 + דינמיקה, אותות, מצב מטבולי.

Protocol

ניסויים בבעלי חיים כל אושרו על ידי אוניברסיטת וושינגטון אכפת חיה המוסדית והוועדה שימוש. 1. הכנת בעלי חיים וציוד הערה: אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) הוא גיליון כהה של רקמות המקיפים את החלק החיצוני של הרשתית פיגמנטציה של מי יכול לטשטש תכונות ברשתית ונזק הרקמה כאשר קונ…

Representative Results

מיצוב יציב והכיוון רוחבי של פרוסות הם המפתח הדמיה מוצלח עם זריקה או זלוף של סוכנים תרופתי. לבחון ותמקם בזהירות פרוסות לפני קונאפוקלית הדמיה לפי הצורך כדי להבטיח שכל השכבות ברשתית הם גלויים (איור 2 א, הפרוסה השנייה). אם פרוסה מסובבים מעט קדימה (אי…

Discussion

Ex-vivo הדמיה של דג זברה טריות פרוסות ברשתית הוכיחה להיות כלי רב-תכליתי ללמוד קולט אור ביולוגיה20,21,22, הוא ייחודי בכך שהוא מאפשר ניתוח של תאים בודדים בבוגרת, באופן מלא הרשתית הבדיל. בפועל, זה אפשרי לערוך ניסויים מרובים עם רקמת מדג יחיד, אפי…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים ראלף נלסון, דניאל Possin להדרכה מתחשב תוך פיתוח זה פרוטוקול, אווה, ג’ורג. אשלי, ואשתו, גייל סטנטון לדור של קווים דג זברה מהונדס יציב. העבודה נתמכה על ידי ה-NSF 2013158531 GRFP ל מ. ג, 5T32EY007031 NIH NEI ג’אקוזי, מ. ג, EY026020 ג’יי-אייץ, ס.

Materials

zebrafish Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility stocks maintained in-house as stable transgenic lines
petroleum jelly Fisher Scientific 19-090-843 for petroleum jelly syringe
3-mL slip tip syringe Fisher Scientific 14-823-436 for petroleum jelly syringe
20g 3.8 cm slip tip needle Fisher Scientific 14-826-5B for petroleum jelly syringe
plain 7 cm X 2.5 cm microscope slide Fisher Scientific 12-550-A3 for eyecup dissection, slicing chamber
Seche Vite clear nail polish Amazon B00150LT40 for slicing chamber
18 mm X 18 mm #1 glass coverslips Fisher Scientific 12-542A for imaging ladders
unflavored dental wax Amazon B01K8WNL5A for imaging ladders
double edge razor blades Stoelting 51427 for tissue slicing
tissue slicer with digital micrometer Stoelting 51415 for tissue slicing
filter paper – white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 µm pore size EMD Millipore HAWG01300 filter paper for mounting retinas
10 cm petri dish Fisher Scientific FB0875712 for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly
15 cm plain-tipped wood applicator stick Fisher Scientific 23-400-112 for wire eye loop tool
30g (0.25 mm diameter) tungsten wire Fisher Scientific AA10408G6 for wire eye loop tool
D-glucose Sigma Aldrich G8270 component of supplement stock solution
sodium L-lactate Sigma Aldrich L7022 component of supplement stock solution
sodium pyruvate Sigma Aldrich P2256 component of supplement stock solution
L-glutamine Sigma Aldrich G3126 component of supplement stock solution
 L-glutathione, reduced Sigma Aldrich G4251 component of supplement stock solution
L-ascorbic acid Sigma Aldrich A5960 component of supplement stock solution
NaCl Sigma Aldrich S7653 component of Ringer's solution
KCl Sigma Aldrich P9333 component of Ringer's solution
CaCl2 · 2H2O Sigma Aldrich C3881 component of Ringer's solution
NaH2PO4 Sigma Aldrich S8282 component of Ringer's solution
MgCl2 · 6H2O Sigma Aldrich M0250 component of Ringer's solution
HEPES Sigma Aldrich H3375 component of Ringer's solution
Tris base Fisher Scientific BP152 component of Na+-free Ringer's solution
6 N HCl Fisher Scientific 02-003-063 component of Na+-free Ringer's solution
KH2PO4 Sigma Aldrich P5655 component of Na+-free Ringer's solution
50 mL conical centrifuge tube Denville Scientific C1062-P container for Ringer's solution
Vannas scissors – 8 cm, angled 5 mm blades World Precision Instruments 501790 micro-scissors for eyecup dissection
Swiss tweezers – #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tips World Precision Instruments 504510 fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation
single edge razor blades Fisher Scientific 12-640 for eyecup dissection and trimming filter paper
EMD Millipore filter forceps Fisher Scientific XX6200006P flat forceps for handling wet filter paper
C12 558/568 BODIPY Fisher Scientific D3835 stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 15 min at room temperature
propidium iodide (PI) Fisher Scientific P3566 stains dead cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature
Hoechst 33342 Fisher Scientific 62249 stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature
Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM) Fisher Scientific T668 stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature
tissue perfusion chamber Cell MicroControls BT-1-18/BT-1-18BV [-SY] imaging chamber for injection or perfusion
2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG) Fisher Scientific N13195 fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia
Olympus laser scanning confocal microscope Olympus FV1000 confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution
Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) Sigma Aldrich C2759 experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 µM
miniature aspirator positioner Cell MicroControls FL-1 for perfusion
perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holder Warner Instruments various for perfusion

References

  1. Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
  2. Ma, E., et al. Loss of Pde6 reduces cell body Ca2+ transients within photoreceptors. Cell Death Dis. 4 (9), e797 (2013).
  3. Niethammer, P., Grabher, C., Look, A., Mitchison, T. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
  4. Andrews, N., et al. Visualising apoptosis in live zebrafish using fluorescence lifetime imaging with optical projection tomography to map FRET biosensor activity in space and time. J. Biophotonics. 9 (4), 414-424 (2016).
  5. Kioka, H., et al. Evaluation of intramitochondrial ATP levels identifies G0/G1 switch gene 2 as a positive regulator of oxidative phosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (1), 273-278 (2014).
  6. Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-Time Visualizationof Neuronal Activity during Perception. Curr. Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
  7. Stewart, A., Braubach, O., Spitsbergen, J., Gerlai, R., Kalueff, A. Zebrafish models for translational neuroscience research: from tank to bedside. Trends Neurosci. 37 (5), 264-278 (2014).
  8. Zou, S. -. Q., Yin, W., Zhang, M. -. J., Hu, C. -. R., Huang, Y. -. B., Hu, B. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J. Vis. Exp. (36), e1742 (2010).
  9. Neuhauss, S. Behavioral genetic approaches to visual system development and function in zebrafish. J. Neurobiol. 54 (1), 148-160 (2002).
  10. Stearns, G., Evangelista, M., Fadool, J., Brockerhoff, S. A Mutation in the Cone-Specific pde6 Gene Causes Rapid Cone Photoreceptor Degeneration in Zebrafish. J. Neurosci. 27 (50), 13866-13874 (2007).
  11. Gross, J., Perkins, B. Zebrafish mutants as models for congenital ocular disorders in humans. Mol. Reprod. Dev. 75 (3), 547-555 (2007).
  12. Lewis, A., Williams, P., Lawrence, O., Wong, R., Brockerhoff, S. Wild-Type Cone Photoreceptors Persist Despite Neighboring Mutant Cone Degeneration. J. Neurosci. 30 (1), 382-389 (2010).
  13. Wang, T. -. M., Holzhausen, L., Kramer, R. Imaging an optogenetic pH sensor reveals that protons mediate lateral inhibition in the retina. Nat. Neurosci. 17 (2), 262-268 (2014).
  14. Van Hook, M., Thoreson, W. Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation. J. Vis. Exp. (76), e50007 (2013).
  15. Connaughton, V. Zebrafish retinal slice preparation. Meth. Cell Sci. 25 (1/2), 49-58 (2003).
  16. Kennedy, B., et al. Identification of a zebrafish cone photoreceptor-specific promoter and genetic rescue of achromatopsia in the nof mutant. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (2), 522-529 (2007).
  17. George, A., et al. Synaptojanin 1 is required for endolysosomal trafficking of synaptic proteins in cone photoreceptor inner segments. PLoS ONE. 9 (1), e84394 (2014).
  18. Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases. Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).
  19. Giarmarco, M., Lindsay, K., Du, J., Cleghorn, W., Brockerhoff, S., Hurley, J. Imaging Real-time Glucose Uptake Reveals Distinct Transport Among Cell Types. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. , (2015).
  20. Kanow, M., et al. Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye. eLife. 6, (2017).
  21. Giarmarco, M., Cleghorn, W., Sloat, S., Hurley, J., Brockerhoff, S. Mitochondria Maintain Distinct Ca2+ Pools in Cone Photoreceptors. J. Neurosci. 37 (8), 2061-2072 (2017).
  22. Uckermann, O., et al. Selective staining by vital dyes of Müller glial cells in retinal wholemounts. Glia. 45 (1), 59-66 (2003).
  23. Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Current protocols in cytometry. , (2012).
  24. Kulkarni, M., et al. Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (99), (2015).

Play Video

Cite This Article
Giarmarco, M. M., Cleghorn, W. M., Hurley, J. B., Brockerhoff, S. E. Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments. J. Vis. Exp. (135), e56977, doi:10.3791/56977 (2018).

View Video