Summary

إعداد شرائح الشبكية الطازجة من الزرد الكبار السابقين فيفو التصوير تجارب

Published: May 09, 2018
doi:

Summary

التصوير نسيج الشبكية يمكن أن توفر معلومات الخلايا المفردة التي لا يمكن جمعها من الطرق الكيميائية الحيوية التقليدية. ويصف هذا البروتوكول إعداد الشرائح الشبكية من الزرد لتصوير [كنفوكل]. فلوري وراثيا ترميز أجهزة الاستشعار أو الأصباغ مؤشر يسمح التصور للعديد من العمليات البيولوجية في أنواع مختلفة من الخلايا الشبكية.

Abstract

شبكية العين هي نسيج معقد يبدأ ويدمج الخطوات الأولى للرؤية. الخلل الوظيفي للخلايا الشبكية سمة مميزة للكثير من الأمراض المسببة للعمى، والعلاجات المستقبل يتوقف على التفاهمات الأساسية حول كيفية مختلفة الشبكية خلايا تعمل بشكل طبيعي. قد ثبتت صعوبة الحصول على مثل هذه المعلومات مع أساليب الكيمياء الحيوية نظراً لأن هي تناقص المساهمات لأنواع معينة من الخلايا في الوسط الخلية الشبكية. تصوير الشبكية حية يمكن أن توفر طريقة عرض للعديد من العمليات البيولوجية على المستوى سوبسيلولار، بفضل عدد متزايد من أجهزة استشعار العوامل البيولوجية الفلورسنت وراثيا المرمزة. ومع ذلك، هذه التقنية كانت حتى الآن محدودة للضفادع الصغيرة واليرقات الزرد، طبقات الشبكية الأبعد من شبكية العين المعزولة، أو تصوير القرار أقل من شبكية العين في الحيوانات الحية. هنا نقدم طريقة لتوليد يعيش السابقين فيفو الشرائح الشبكية من الزرد الكبار لتصوير مباشر عن طريق الفحص المجهري [كنفوكل]. هذا الإعداد غلة شرائح عرضية مع جميع طبقات الشبكية، ومعظم أنواع الخلايا المرئية لأداء تجارب التصوير [كنفوكل] استخدام التروية. إذ تعرب عن بروتينات الفلورسنت الزرد المحورة وراثيا أو أجهزة استشعار العوامل البيولوجية في أنواع محددة من الخلايا الشبكية أو العضيات تستخدم لاستخراج المعلومات خلية واحدة من شبكية سليمة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحميل الشرائح الشبكية مع الأصباغ الفلورية المؤشر، إضافة إلى براعة في الأسلوب. تم تطوير هذا البروتوكول للتصوير Ca2 + داخل photoreceptors مخروط الزرد، ولكن بعلامات مناسبة فإنه يمكن تكييفها لقياس Ca2 + أو نواتج الأيض في الخلايا أو الخلايا الأفقية والقطبين، microglia، الخلايا أماكريني أو الشبكية مولر خلايا العقدة. تتم إزالة ظهارة صباغ الشبكية من شرائح حتى هذه الطريقة ليست مناسبة لدراسة هذا النوع من الخلايا. مع الممارسة، من الممكن لإنشاء شرائح المسلسل من الحيوان واحدة لتجارب متعددة. يوفر هذا الأسلوب يمكن تكييفها أداة قوية للرد على العديد من الأسئلة حول بيولوجيا الخلايا الشبكية، Ca2 +والتوازن الطاقة.

Introduction

الزرد (دانيو rerio) أصبحت تستخدم على نطاق واسع في البحوث العلمية الطبية والأساسية1، نظراً لصغر حجمه، والتطور السريع ونظم الجهاز الفقاريات. الشفافية الطبيعية يرقات الزرد جنبا إلى جنب مع الأساليب المتبعة ترانسجينيسيس مكنت التصور تفصيلية للعمليات الخلوية في الحيوانات حية. استهدفت عددا من أجهزة استشعار العوامل البيولوجية الفلورسنت وراثيا المرمزة إلى خلايا محددة الزرد للكشف عن Ca2 + 2، وفوق أكسيد الهيدروجين3، أبوبتوتيك التنشيط4 و ATP5.

في فيفو تصوير يرقات الزرد أدى إلى اختراقات في مجال علم الأعصاب، بما في ذلك رسم خرائط للدماغ الدوائر6 وتطوير العقاقير للجهاز العصبي المركزي واضطرابات7. الزرد أيضا مناسبة للرؤية للبحث نظراً لأن ميزة شبكية العين على بنية طبقية وأنواع الخلايا العصبية للفقاريات العليا، وأنها عرض السلوكيات بصرية قوية8،9. تم بنجاح على غرار عدة أنواع من تنكسات الشبكية مماثلة للأمراض البشرية ودرس في الزرد10،11، بما في ذلك التصوير الحي من photoreceptors حدة التدهور داخل شبكية2، 12.

بينما في فيفو تصوير الزرد اليرقات أداة قيمة، فإنه يصبح أكثر صعوبة كما الأسماك تنمو وتتطور تصبغ، وبعض العلاجات الدوائية لا تتخلل حيوان كامل. علاوة على ذلك، تغيير بعض العمليات الخلوية مع التنمية، والعمر، مما يجعل لاحق الوقت النقاط الحرجة للدالة التفاهم وتطور المرض في الحيوانات الكبار. أساليب الكيمياء الحيوية مثل إيمونوبلوت، كوانتيتياتيفي بكر واستهلاك2 س وتحليلات metabolomic يمكن أن توفر أدلة هامة حول علم الأحياء الشبكية ككل، ولكن من الصعب أن نتبين إسهامات أنواع الخلايا الفردية تتأثر المرض. التصوير نسيج الشبكية معزولة السابقين فيفو يتجاوز هذه القضايا، وحين التصوير شقة المحملة شبكية العين يتيح عرض شبكية العين الخارجي13، يتم حجب ميزات الشبكية الداخلية أعمق. شرائح عرضية الشبكية، مثل تلك التي قدمت في ثابت تحليلات المناعي، تمكين رؤية واضحة لجميع الطبقات وأنواع الخلايا ولكن لا تقدم سوى لقطة واحدة من العمليات الديناميكية التي ينطوي عليها وظيفة طبيعية والمرض.

نقدم هنا، وسيلة لتوليد السابقين فيفو عرضية الشرائح الشبكية من الزرد الكبار للتصوير. ومشابه لأساليب لإعداد الشرائح الشبكية البرمائية والزرد للدراسات الكهربية والمورفولوجية14،15، مع تعديلات هامة للفاصل الزمني التصوير السابقين فيفو استخدام [كنفوكل] الفحص المجهري. وتراقب الردود الأسفار من أجهزة استشعار العوامل البيولوجية أو الصبغات في شرائح في الوقت الحقيقي مع مجهر [كنفوكل] بينما كان يلقي وكلاء الدوائية باستخدام التروية. بينما وضعت الطريقة للتصوير فوتوريسيبتورس، قد يكون من الممكن استخدامها لتصور الخلايا أو الخلايا ثنائية القطب، أفقي من الخلايا، الخلايا أماكريني أو خلايا الشبكية العقدة مولر مع علامات مضيئة مناسبة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحميل الشرائح مع الفلورية الأصباغ نفاذية الخلية لتقرير جدوى الخلية أو النقل حويصلية، الوظيفة المتقدرية أو حالة الأكسدة والاختزال. يسمح هذا الإعداد تنوعاً تصور طائفة واسعة من العمليات سوبسيلولار في جميع أنحاء الشبكية، بما في ذلك Ca2 + ديناميات وتوصيل الإشارة والدولة الأيضية.

Protocol

ووافقت جامعة واشنطن رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة جميع التجارب على الحيوانات. 1. إعداد الحيوانات والمعدات ملاحظة: ظهارة صباغ الشبكية (RPE) هو ورقة الظلام من الأنسجة المحيطة بالجزء الخارجي الشبكية يمكن أن يحجب ملامح الشبكية التي تصبغ وتلف الأنسجة عند [ك…

Representative Results

مستقرة لتحديد المواقع واتجاه شرائح عرضية هي المفتاح لتصوير ناجحة مع حقن أو نضح من وكلاء الدوائية. بعناية دراسة وتغيير موضع الشرائح قبل تصوير [كنفوكل] حسب الحاجة لضمان جميع طبقات الشبكية هي مرئية (الشكل 2A، شريحة الثاني). إذا كان يتم تدوير شريحة قليلاً إلى ا?…

Discussion

السابقين فيفو تصوير الشرائح الشبكية الزرد الطازجة وقد ثبت أن تكون أداة متعددة الاستخدامات لدراسة علم الأحياء20،،من2122، وهي فريدة من نوعها في ذلك فإنه يمكن تحليل الخلايا المفردة في ناضجة، تماما الشبكية المتباينة. مع الممارسة، من المم…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونشكر رالف نيلسون ودانيال بوثين لتوجيه مدروس أثناء وضع هذا البروتوكول، وايفا Ma وجورج أشلي ستانتون غيل لتوليد خطوط الزرد المعدلة وراثيا مستقرة. وأيده العمل جبهة الخلاص الوطني جرفب 2013158531 للشخص، 5T32EY007031 نيي المعاهد الوطنية للصحة للمراحيض والشخص، و EY026020 إلى J.H. ونشره

Materials

zebrafish Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility stocks maintained in-house as stable transgenic lines
petroleum jelly Fisher Scientific 19-090-843 for petroleum jelly syringe
3-mL slip tip syringe Fisher Scientific 14-823-436 for petroleum jelly syringe
20g 3.8 cm slip tip needle Fisher Scientific 14-826-5B for petroleum jelly syringe
plain 7 cm X 2.5 cm microscope slide Fisher Scientific 12-550-A3 for eyecup dissection, slicing chamber
Seche Vite clear nail polish Amazon B00150LT40 for slicing chamber
18 mm X 18 mm #1 glass coverslips Fisher Scientific 12-542A for imaging ladders
unflavored dental wax Amazon B01K8WNL5A for imaging ladders
double edge razor blades Stoelting 51427 for tissue slicing
tissue slicer with digital micrometer Stoelting 51415 for tissue slicing
filter paper – white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 µm pore size EMD Millipore HAWG01300 filter paper for mounting retinas
10 cm petri dish Fisher Scientific FB0875712 for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly
15 cm plain-tipped wood applicator stick Fisher Scientific 23-400-112 for wire eye loop tool
30g (0.25 mm diameter) tungsten wire Fisher Scientific AA10408G6 for wire eye loop tool
D-glucose Sigma Aldrich G8270 component of supplement stock solution
sodium L-lactate Sigma Aldrich L7022 component of supplement stock solution
sodium pyruvate Sigma Aldrich P2256 component of supplement stock solution
L-glutamine Sigma Aldrich G3126 component of supplement stock solution
 L-glutathione, reduced Sigma Aldrich G4251 component of supplement stock solution
L-ascorbic acid Sigma Aldrich A5960 component of supplement stock solution
NaCl Sigma Aldrich S7653 component of Ringer's solution
KCl Sigma Aldrich P9333 component of Ringer's solution
CaCl2 · 2H2O Sigma Aldrich C3881 component of Ringer's solution
NaH2PO4 Sigma Aldrich S8282 component of Ringer's solution
MgCl2 · 6H2O Sigma Aldrich M0250 component of Ringer's solution
HEPES Sigma Aldrich H3375 component of Ringer's solution
Tris base Fisher Scientific BP152 component of Na+-free Ringer's solution
6 N HCl Fisher Scientific 02-003-063 component of Na+-free Ringer's solution
KH2PO4 Sigma Aldrich P5655 component of Na+-free Ringer's solution
50 mL conical centrifuge tube Denville Scientific C1062-P container for Ringer's solution
Vannas scissors – 8 cm, angled 5 mm blades World Precision Instruments 501790 micro-scissors for eyecup dissection
Swiss tweezers – #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tips World Precision Instruments 504510 fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation
single edge razor blades Fisher Scientific 12-640 for eyecup dissection and trimming filter paper
EMD Millipore filter forceps Fisher Scientific XX6200006P flat forceps for handling wet filter paper
C12 558/568 BODIPY Fisher Scientific D3835 stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 15 min at room temperature
propidium iodide (PI) Fisher Scientific P3566 stains dead cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature
Hoechst 33342 Fisher Scientific 62249 stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature
Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM) Fisher Scientific T668 stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature
tissue perfusion chamber Cell MicroControls BT-1-18/BT-1-18BV [-SY] imaging chamber for injection or perfusion
2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG) Fisher Scientific N13195 fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia
Olympus laser scanning confocal microscope Olympus FV1000 confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution
Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) Sigma Aldrich C2759 experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 µM
miniature aspirator positioner Cell MicroControls FL-1 for perfusion
perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holder Warner Instruments various for perfusion

References

  1. Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
  2. Ma, E., et al. Loss of Pde6 reduces cell body Ca2+ transients within photoreceptors. Cell Death Dis. 4 (9), e797 (2013).
  3. Niethammer, P., Grabher, C., Look, A., Mitchison, T. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
  4. Andrews, N., et al. Visualising apoptosis in live zebrafish using fluorescence lifetime imaging with optical projection tomography to map FRET biosensor activity in space and time. J. Biophotonics. 9 (4), 414-424 (2016).
  5. Kioka, H., et al. Evaluation of intramitochondrial ATP levels identifies G0/G1 switch gene 2 as a positive regulator of oxidative phosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (1), 273-278 (2014).
  6. Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-Time Visualizationof Neuronal Activity during Perception. Curr. Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
  7. Stewart, A., Braubach, O., Spitsbergen, J., Gerlai, R., Kalueff, A. Zebrafish models for translational neuroscience research: from tank to bedside. Trends Neurosci. 37 (5), 264-278 (2014).
  8. Zou, S. -. Q., Yin, W., Zhang, M. -. J., Hu, C. -. R., Huang, Y. -. B., Hu, B. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J. Vis. Exp. (36), e1742 (2010).
  9. Neuhauss, S. Behavioral genetic approaches to visual system development and function in zebrafish. J. Neurobiol. 54 (1), 148-160 (2002).
  10. Stearns, G., Evangelista, M., Fadool, J., Brockerhoff, S. A Mutation in the Cone-Specific pde6 Gene Causes Rapid Cone Photoreceptor Degeneration in Zebrafish. J. Neurosci. 27 (50), 13866-13874 (2007).
  11. Gross, J., Perkins, B. Zebrafish mutants as models for congenital ocular disorders in humans. Mol. Reprod. Dev. 75 (3), 547-555 (2007).
  12. Lewis, A., Williams, P., Lawrence, O., Wong, R., Brockerhoff, S. Wild-Type Cone Photoreceptors Persist Despite Neighboring Mutant Cone Degeneration. J. Neurosci. 30 (1), 382-389 (2010).
  13. Wang, T. -. M., Holzhausen, L., Kramer, R. Imaging an optogenetic pH sensor reveals that protons mediate lateral inhibition in the retina. Nat. Neurosci. 17 (2), 262-268 (2014).
  14. Van Hook, M., Thoreson, W. Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation. J. Vis. Exp. (76), e50007 (2013).
  15. Connaughton, V. Zebrafish retinal slice preparation. Meth. Cell Sci. 25 (1/2), 49-58 (2003).
  16. Kennedy, B., et al. Identification of a zebrafish cone photoreceptor-specific promoter and genetic rescue of achromatopsia in the nof mutant. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (2), 522-529 (2007).
  17. George, A., et al. Synaptojanin 1 is required for endolysosomal trafficking of synaptic proteins in cone photoreceptor inner segments. PLoS ONE. 9 (1), e84394 (2014).
  18. Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases. Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).
  19. Giarmarco, M., Lindsay, K., Du, J., Cleghorn, W., Brockerhoff, S., Hurley, J. Imaging Real-time Glucose Uptake Reveals Distinct Transport Among Cell Types. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. , (2015).
  20. Kanow, M., et al. Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye. eLife. 6, (2017).
  21. Giarmarco, M., Cleghorn, W., Sloat, S., Hurley, J., Brockerhoff, S. Mitochondria Maintain Distinct Ca2+ Pools in Cone Photoreceptors. J. Neurosci. 37 (8), 2061-2072 (2017).
  22. Uckermann, O., et al. Selective staining by vital dyes of Müller glial cells in retinal wholemounts. Glia. 45 (1), 59-66 (2003).
  23. Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Current protocols in cytometry. , (2012).
  24. Kulkarni, M., et al. Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (99), (2015).

Play Video

Cite This Article
Giarmarco, M. M., Cleghorn, W. M., Hurley, J. B., Brockerhoff, S. E. Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments. J. Vis. Exp. (135), e56977, doi:10.3791/56977 (2018).

View Video