Summary

Prepara frescas fatias da retina de adultos do Zebrafish para Ex Vivo experimentos de imagem

Published: May 09, 2018
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Summary

Imagem tecido retinal pode fornecer informações de célula única que não podem ser obtidas por métodos bioquímicos tradicionais. Este protocolo descreve a preparação de fatias da retina de zebrafish para a imagem latente confocal. Indicador de corantes permitem a visualização de numerosos processos biológicos em tipos distintos de células da retina ou fluorescente geneticamente codificado sensores.

Abstract

A retina é um tecido complexo que inicia e integra os primeiros passos da visão. Disfunção das células da retina é uma marca registrada de muitas doenças ofuscante, e terapias futuras dependem de entendimentos fundamentais sobre como diferentes da retina células funcionam normalmente. Ganhar essa informação com métodos bioquímicos provou difícil porque as contribuições dos tipos de célula específica são diminuídas no meio de células da retina. Imagem da retina ao vivo pode fornecer uma visão dos numerosos processos biológicos em nível subcelular, graças a um número crescente de biosensores fluorescentes geneticamente codificados. No entanto, esta técnica tem sido limitada a girinos e larvas de peixe-zebra, as camadas da retina ultraperiféricas da retina isolada, ou imagens de resolução mais baixa da retina em animais vivos. Aqui nós apresentamos um método para gerar ao vivo ex vivo da retina fatias de adultos do zebrafish para geração de imagens ao vivo através de microscopia confocal. Esta preparação rende fatias transversais com todas as camadas da retina e a maioria dos tipos de células visíveis para a realização de experimentos de imagiologia confocal usando a perfusão. Zebrafish transgênicos expressando proteínas fluorescentes ou biossensores em tipos específicos de células da retina ou organelas são usados para extrair informação de célula única de uma retina intacta. Além disso, as fatias da retina podem ser carregadas com corantes fluorescentes indicador, adicionando à versatilidade do método. Este protocolo foi desenvolvido para imagem Ca2 + dentro do zebrafish cones fotorreceptores, mas com marcadores adequadas poderia ser adaptado para medir Ca2 + ou metabolitos em células Müller, células bipolares e horizontais, micróglia, células de amacrine ou da retina células ganglionares. O epithelium retinal do pigment é removido do fatias assim que este método não é adequado para estudar esse tipo de célula. Com prática, é possível gerar seriais fatias de um animal para múltiplas experiências. Esta técnica adaptável fornece uma ferramenta poderosa para responder às muitas perguntas sobre biologia celular da retina, Ca2 +e homeostase de energia.

Introduction

O peixe-zebra (Danio rerio) tem-se amplamente utilizado em pesquisa científica básica e médica1, devido ao seu tamanho pequeno, rápido desenvolvimento e sistemas de órgãos de vertebrados. A transparência natural das larvas de zebrafish combinada com métodos estabelecidos por transgênese permitiram a visualização detalhada dos processos celulares em um animal vivo. Um número de biosensores fluorescentes geneticamente codificados têm sido alvo de células específicas do zebrafish para detectar Ca2 + 2, peróxido de hidrogênio3, apoptotic ativação4 e ATP5.

Na vivo por imagens do zebrafish larvas conduziu a descobertas no campo da neurociência, incluindo o mapeamento do cérebro circuitos6 e7de distúrbios do desenvolvimento de drogas para o sistema nervoso central. Zebrafish são adequados para a pesquisa de visão porque suas retinas apresentam a estrutura laminar e tipos de neurônio de vertebrados superiores, e eles exibem comportamentos visual robusto8,9. Vários tipos dos degenerations retinais análogos à doença humana foram modelados com sucesso e estudados no zebrafish10,11, incluindo imagens ao vivo de fotorreceptores individuais degenerando dentro de uma retina2, 12.

Enquanto na vivo zebrafish larval imagiologia é uma ferramenta valiosa, torna-se mais desafiador como peixe cresce e desenvolver pigmentação, e alguns tratamentos farmacológicos não podem permear um animal inteiro. Além disso, determinados processos celulares mudam com desenvolvimento e idade, fazendo mais tarde pontos de tempo crítico para a função de compreensão e a progressão da doença em animais adultos. Métodos bioquímicos como immunoblot, quantitativo PCR, O consumo de2 e metabolómica análises podem fornecer pistas importantes sobre a biologia da retina como um todo, mas é difícil discernir contribuições de tipos de células individuais afectados pela doença. Imagem tecido retinal isolada ex vivo ignora essas questões e enquanto imagem plana montado as retinas proporciona uma vista sobre a retina exterior13, características da retina interiores mais profundas são obscurecidas. Fatias transversais da retina, como aqueles apresentados no fixo análises imuno-histoquímica, permitem uma visão clara de todas as camadas e tipos de células, mas apenas oferecem um único instantâneo dos processos dinâmicos envolvidos na doença e função normal.

Aqui, apresentamos um método para gerar ex vivo transversais da retina fatias de zebrafish adulto para a imagem latente. É semelhante aos métodos para a preparação de anfíbios e zebrafish fatias da retina para14,Estudos eletrofisiológicos e morfológicos15, com importantes modificações para o lapso de tempo de imagem ex vivo usando confocal microscopia. Respostas de fluorescência de biosensores ou corantes em fatias são monitoradas em tempo real com um microscópio confocal ao entregar agentes farmacológicos usando a perfusão. Enquanto o método foi desenvolvido por fotorreceptores de imagem, ela pode ser viável usá-lo para a visualização de células Müller, células bipolares, células horizontais, amacrine células ou células ganglionares da retina com marcadores fluorescentes apropriados. Além disso, as fatias podem ser carregadas com corantes fluorescentes de célula-permeável a viabilidade celular de relatório, transporte vesicular, função mitocondrial ou estado de redox. Esta preparação versátil permite a visualização de uma ampla gama de processos subcelulares ao longo da retina, incluindo Ca2 + dinâmica, transdução de sinal e estado metabólico.

Protocol

Todos os experimentos com animais foram aprovados pela Universidade de Washington institucional Animal cuidados e Comissão de utilização. 1. preparar o equipamento e animais Nota: O epithelium retinal do pigment (RPE) é uma folha escura de tecido circundante fora da retina cuja pigmentação pode obscurecer as características da retina e danificar o tecido quando confocal de imagem ex vivo. Na escuridão, o RPE de zebrafish está retraída longe da retin…

Representative Results

Posicionamento estável e orientação transversal de fatias são chave para o sucesso de imagem com injeção ou perfusão de agentes farmacológicos. Cuidadosamente examine e reposicionar fatias antes da imagem latente confocal conforme necessário para garantir que todas as camadas da retina são visíveis (Figura 2A, fatia ii). Se uma fatia é girada ligeiramente para a frente (Fig. 2A, fatia iii), feixes de segmentos exterio…

Discussion

Ex vivo por imagens do zebrafish frescos fatias da retina tem provado para ser uma ferramenta versátil para estudar fotorreceptoras biologia20,21,22e é o única que permite a análise de células individuais em um maduro, totalmente diferenciada de retina. Com prática, é possível realizar várias experiências com tecido de um único peixe, mesmo usando seriais fatias da mesma região da retina. Além dos desafios …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos Ralph Nelson e Daniel Possin pensativa orientação durante o desenvolvimento deste protocolo e Eva Ma, Ashley George e Gail Stanton para geração de linhas de zebrafish transgênicos estável. O trabalho foi apoiado pela NSF GRFP 2013158531 de M.G., NIH NEI 5T32EY007031 de W.C. e M.G. e EY026020 de J.H. e S.B.

Materials

zebrafish Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility stocks maintained in-house as stable transgenic lines
petroleum jelly Fisher Scientific 19-090-843 for petroleum jelly syringe
3-mL slip tip syringe Fisher Scientific 14-823-436 for petroleum jelly syringe
20g 3.8 cm slip tip needle Fisher Scientific 14-826-5B for petroleum jelly syringe
plain 7 cm X 2.5 cm microscope slide Fisher Scientific 12-550-A3 for eyecup dissection, slicing chamber
Seche Vite clear nail polish Amazon B00150LT40 for slicing chamber
18 mm X 18 mm #1 glass coverslips Fisher Scientific 12-542A for imaging ladders
unflavored dental wax Amazon B01K8WNL5A for imaging ladders
double edge razor blades Stoelting 51427 for tissue slicing
tissue slicer with digital micrometer Stoelting 51415 for tissue slicing
filter paper – white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 µm pore size EMD Millipore HAWG01300 filter paper for mounting retinas
10 cm petri dish Fisher Scientific FB0875712 for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly
15 cm plain-tipped wood applicator stick Fisher Scientific 23-400-112 for wire eye loop tool
30g (0.25 mm diameter) tungsten wire Fisher Scientific AA10408G6 for wire eye loop tool
D-glucose Sigma Aldrich G8270 component of supplement stock solution
sodium L-lactate Sigma Aldrich L7022 component of supplement stock solution
sodium pyruvate Sigma Aldrich P2256 component of supplement stock solution
L-glutamine Sigma Aldrich G3126 component of supplement stock solution
 L-glutathione, reduced Sigma Aldrich G4251 component of supplement stock solution
L-ascorbic acid Sigma Aldrich A5960 component of supplement stock solution
NaCl Sigma Aldrich S7653 component of Ringer's solution
KCl Sigma Aldrich P9333 component of Ringer's solution
CaCl2 · 2H2O Sigma Aldrich C3881 component of Ringer's solution
NaH2PO4 Sigma Aldrich S8282 component of Ringer's solution
MgCl2 · 6H2O Sigma Aldrich M0250 component of Ringer's solution
HEPES Sigma Aldrich H3375 component of Ringer's solution
Tris base Fisher Scientific BP152 component of Na+-free Ringer's solution
6 N HCl Fisher Scientific 02-003-063 component of Na+-free Ringer's solution
KH2PO4 Sigma Aldrich P5655 component of Na+-free Ringer's solution
50 mL conical centrifuge tube Denville Scientific C1062-P container for Ringer's solution
Vannas scissors – 8 cm, angled 5 mm blades World Precision Instruments 501790 micro-scissors for eyecup dissection
Swiss tweezers – #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tips World Precision Instruments 504510 fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation
single edge razor blades Fisher Scientific 12-640 for eyecup dissection and trimming filter paper
EMD Millipore filter forceps Fisher Scientific XX6200006P flat forceps for handling wet filter paper
C12 558/568 BODIPY Fisher Scientific D3835 stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 15 min at room temperature
propidium iodide (PI) Fisher Scientific P3566 stains dead cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature
Hoechst 33342 Fisher Scientific 62249 stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature
Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM) Fisher Scientific T668 stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature
tissue perfusion chamber Cell MicroControls BT-1-18/BT-1-18BV [-SY] imaging chamber for injection or perfusion
2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG) Fisher Scientific N13195 fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia
Olympus laser scanning confocal microscope Olympus FV1000 confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution
Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) Sigma Aldrich C2759 experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 µM
miniature aspirator positioner Cell MicroControls FL-1 for perfusion
perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holder Warner Instruments various for perfusion

References

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Cite This Article
Giarmarco, M. M., Cleghorn, W. M., Hurley, J. B., Brockerhoff, S. E. Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments. J. Vis. Exp. (135), e56977, doi:10.3791/56977 (2018).

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