Förbereda färska Retinal skivor från vuxna zebrafiskar för Ex Vivo Imaging experiment
Summary
Imaging retinala vävnaden kan ge encelliga information som inte kan samlas in från traditionella biokemiska metoder. Det här protokollet beskriver beredning av retinal skivor från zebrafisk för confocal imaging. Fluorescerande kodade genetiskt sensorer eller indikator färgämnen tillåta visualisering av många biologiska processer i olika retinala celltyper.
Abstract
Näthinnan är en komplex vävnad som initierar och integrerar de första stegen av vision. Dysfunktion av näthinnans celler är ett kännetecken för många förblindande sjukdomar och framtida terapier gångjärn på grundläggande överenskommelser om hur olika retinala celler fungera normalt. Att få sådan information med biokemiska metoder har visat sig svårt eftersom bidrag särskilt celltyper minskas i näthinnans cell miljö. Levande retinal imaging kan ge en bild av många biologiska processer på en subcellulär nivå, tack vare ett växande antal genetiskt kodade fluorescerande biosensorer. Denna teknik har dock hittills begränsats till grodyngel och zebrafiskar larver, de yttersta retinala lagrarna av isolerade näthinnor, eller lägre upplösning imaging av näthinnor med levande djur. Här presenterar vi en metod för att skapa levande ex vivo retinal skivor från vuxna zebrafiskar för levande imaging via konfokalmikroskopi. Detta preparat ger tvärgående skivor med alla retinala lagren och de flesta celltyper som är synliga för att utföra confocal imaging experiment med perfusion. Transgena Sebrafisken uttrycker fluorescerande proteiner eller biosensorer i specifik retinal celltyper eller organeller används för att extrahera encelliga information från en intakt näthinnan. Dessutom, kan retinal skivor läsas med fluorescerande indikator färgämnen, lägga till metodens mångsidighet. Detta protokoll utvecklades för imaging Ca2 + inom zebrafiskar kon fotoreceptorer, men med ordentlig markörer kan det anpassas för att mäta Ca2 + eller metaboliter i Müller celler, bipolär och horisontella celler, mikroglia, amakrina celler eller retinal ganglionceller. Pigmentepitelet tas bort från skivor så denna metod inte är lämplig för att studera denna celltyp. Med praxis är det möjligt att generera serial skivor från ett djur för flera experiment. Denna anpassningsbar teknik erbjuder ett kraftfullt verktyg för att svara på många frågor om retinal cellbiologi, Ca2 +och energi homeostas.
Introduction
Zebrafiskar (Danio rerio) har blivit allmänt används i medicinska och grundläggande vetenskaplig forskning1, på grund av dess liten storlek, snabb utveckling och ryggradsdjur organsystem. Naturliga insyn i zebrafiskar larver kombinerat med etablerade metoder för genmodifiering har aktiverat detaljerad visualisering av cellulära processer i ett levande djur. Ett antal genetiskt kodade fluorescerande biosensorer har varit riktad till specifika zebrafiskar celler att upptäcka Ca2 + 2, väteperoxid3, apoptotiska aktiveringen4 och ATP5.
In vivo imaging av zebrafisk larver har lett till genombrott inom neurovetenskap, inklusive kartläggning av hjärnans kretsar6 och läkemedelsutveckling för centrala nervsystemet sjukdomar7. Zebrafisk är väl lämpade för vision forskning eftersom deras näthinnor har laminär struktur och neuron typer av högre ryggradsdjur, och de visar robust visuella beteenden8,9. Flera typer av retinal degeneration analogt med mänskliga sjukdomar har modellerad framgångsrikt och studerade zebrafiskar10,11, inklusive levande avbildning av enskilda fotoreceptorer urartar inom en näthinnan2, 12.
I vivo larval zebrafiskar imaging är ett värdefullt verktyg, blir det mer utmanande som fisken växa och utveckla pigmentering, och vissa farmakologiska behandlingar inte kan genomsyra hela djur. Vidare, vissa cellulära processer förändras med utvecklingen och ålder, att göra senare tidpunkter kritiska för förståelse funktion och utvecklingen av sjukdom hos vuxna djur. Biokemiska metoder såsom immunoblot, quantitiative PCR, O2 konsumtion och metabolomiska analyser kan ge viktiga ledtrådar om biologi av näthinnan som helhet, men det är svårt att urskilja bidrag enskilda celltyper som påverkas av sjukdom. Imaging isolerade retinala vävnaden ex vivo kringgår dessa frågor, och medan imaging platt monterade näthinnor ger en vy av den yttersta näthinnan13, djupare inre retinal funktioner döljs. Tvärgående retinal skivor, såsom de presenteras i fast immunhistokemiska analyser, aktivera en klar bild av alla lager och celltyper men bara erbjuda en enda ögonblicksbild av dynamiska processer i normal funktion och sjukdom.
Här presenterar vi en metod för att generera ex vivo tvärgående retinal skivor från vuxna zebrafiskar för avbildning. Det är liknande metoder för att förbereda amfibie och zebrafiskar retinal skivor elektrofysiologiska och morfologiska studier14,15, med viktiga ändringar för tid förfaller imaging ex vivo på confocal mikroskopi. Fluorescens Svaren av biosensorer eller färgämnen i skivor övervakas i realtid med en confocal Mikroskop samtidigt leverera farmakologiska agenter med perfusion. Medan metoden utvecklades för imaging fotoreceptorer, kan det vara praktiskt att använda den för att visualisera Müller celler, bipolära celler, horisontella celler, amakrina celler eller retinala ganglionceller med lämpliga fluorescerande markörer. Dessutom kan skivor laddas med fluorescerande cell-permeable färgämnen till rapporten cellernas viabilitet, vesikulär transport, mitokondriell funktion eller redox staten. Denna mångsidiga förberedelse kan visualisering av ett brett utbud av subcellulär processer i hela näthinnan, inklusive Ca2 + dynamics, signaltransduktion och metabola tillstånd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ex vivo imaging av färska zebrafiskar retinal skivor har visat sig vara ett mångsidigt verktyg för att studera ljusmätare biologi20,21,22, och är unikt genom att det möjliggör analys av enstaka celler i en mogen, fullt differentierade näthinnan. Med praxis är det möjligt att genomföra flera experiment med vävnad från en enda fisk, även med seriell skivor från samma del av näthinnan. Förutom de utmaninga…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Ralph Nelson och Daniel Possin för vägledning som samtidigt utveckla detta protokoll, och Eva Ma, Ashley George och Gail Stanton för generering av stabil transgena zebrafiskar linjer. Arbetet stöddes av NSF GRFP 2013158531 att M.G., NIH NEI 5T32EY007031 W.C. och M.G. och EY026020 till J.H. och S.B.
Materials
| zebrafish | Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility | stocks maintained in-house as stable transgenic lines | |
| petroleum jelly | Fisher Scientific | 19-090-843 | for petroleum jelly syringe |
| 3-mL slip tip syringe | Fisher Scientific | 14-823-436 | for petroleum jelly syringe |
| 20g 3.8 cm slip tip needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | for petroleum jelly syringe |
| plain 7 cm X 2.5 cm microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for eyecup dissection, slicing chamber |
| Seche Vite clear nail polish | Amazon | B00150LT40 | for slicing chamber |
| 18 mm X 18 mm #1 glass coverslips | Fisher Scientific | 12-542A | for imaging ladders |
| unflavored dental wax | Amazon | B01K8WNL5A | for imaging ladders |
| double edge razor blades | Stoelting | 51427 | for tissue slicing |
| tissue slicer with digital micrometer | Stoelting | 51415 | for tissue slicing |
| filter paper – white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 µm pore size | EMD Millipore | HAWG01300 | filter paper for mounting retinas |
| 10 cm petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly |
| 15 cm plain-tipped wood applicator stick | Fisher Scientific | 23-400-112 | for wire eye loop tool |
| 30g (0.25 mm diameter) tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | for wire eye loop tool |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G8270 | component of supplement stock solution |
| sodium L-lactate | Sigma Aldrich | L7022 | component of supplement stock solution |
| sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P2256 | component of supplement stock solution |
| L-glutamine | Sigma Aldrich | G3126 | component of supplement stock solution |
| L-glutathione, reduced | Sigma Aldrich | G4251 | component of supplement stock solution |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | component of supplement stock solution |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | component of Ringer's solution |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | component of Ringer's solution |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma Aldrich | C3881 | component of Ringer's solution |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | component of Ringer's solution |
| MgCl2 · 6H2O | Sigma Aldrich | M0250 | component of Ringer's solution |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | component of Ringer's solution |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 6 N HCl | Fisher Scientific | 02-003-063 | component of Na+-free Ringer's solution |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5655 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 50 mL conical centrifuge tube | Denville Scientific | C1062-P | container for Ringer's solution |
| Vannas scissors – 8 cm, angled 5 mm blades | World Precision Instruments | 501790 | micro-scissors for eyecup dissection |
| Swiss tweezers – #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tips | World Precision Instruments | 504510 | fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation |
| single edge razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | for eyecup dissection and trimming filter paper |
| EMD Millipore filter forceps | Fisher Scientific | XX6200006P | flat forceps for handling wet filter paper |
| C12 558/568 BODIPY | Fisher Scientific | D3835 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 15 min at room temperature |
| propidium iodide (PI) | Fisher Scientific | P3566 | stains dead cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM) | Fisher Scientific | T668 | stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature |
| tissue perfusion chamber | Cell MicroControls | BT-1-18/BT-1-18BV [-SY] | imaging chamber for injection or perfusion |
| 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG) | Fisher Scientific | N13195 | fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia |
| Olympus laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution |
| Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) | Sigma Aldrich | C2759 | experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 µM |
| miniature aspirator positioner | Cell MicroControls | FL-1 | for perfusion |
| perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holder | Warner Instruments | various | for perfusion |
References
- Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Ma, E., et al. Loss of Pde6 reduces cell body Ca2+ transients within photoreceptors. Cell Death Dis. 4 (9), e797 (2013).
- Niethammer, P., Grabher, C., Look, A., Mitchison, T. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
- Andrews, N., et al. Visualising apoptosis in live zebrafish using fluorescence lifetime imaging with optical projection tomography to map FRET biosensor activity in space and time. J. Biophotonics. 9 (4), 414-424 (2016).
- Kioka, H., et al. Evaluation of intramitochondrial ATP levels identifies G0/G1 switch gene 2 as a positive regulator of oxidative phosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (1), 273-278 (2014).
- Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-Time Visualizationof Neuronal Activity during Perception. Curr. Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
- Stewart, A., Braubach, O., Spitsbergen, J., Gerlai, R., Kalueff, A. Zebrafish models for translational neuroscience research: from tank to bedside. Trends Neurosci. 37 (5), 264-278 (2014).
- Zou, S. -. Q., Yin, W., Zhang, M. -. J., Hu, C. -. R., Huang, Y. -. B., Hu, B. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J. Vis. Exp. (36), e1742 (2010).
- Neuhauss, S. Behavioral genetic approaches to visual system development and function in zebrafish. J. Neurobiol. 54 (1), 148-160 (2002).
- Stearns, G., Evangelista, M., Fadool, J., Brockerhoff, S. A Mutation in the Cone-Specific pde6 Gene Causes Rapid Cone Photoreceptor Degeneration in Zebrafish. J. Neurosci. 27 (50), 13866-13874 (2007).
- Gross, J., Perkins, B. Zebrafish mutants as models for congenital ocular disorders in humans. Mol. Reprod. Dev. 75 (3), 547-555 (2007).
- Lewis, A., Williams, P., Lawrence, O., Wong, R., Brockerhoff, S. Wild-Type Cone Photoreceptors Persist Despite Neighboring Mutant Cone Degeneration. J. Neurosci. 30 (1), 382-389 (2010).
- Wang, T. -. M., Holzhausen, L., Kramer, R. Imaging an optogenetic pH sensor reveals that protons mediate lateral inhibition in the retina. Nat. Neurosci. 17 (2), 262-268 (2014).
- Van Hook, M., Thoreson, W. Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation. J. Vis. Exp. (76), e50007 (2013).
- Connaughton, V. Zebrafish retinal slice preparation. Meth. Cell Sci. 25 (1/2), 49-58 (2003).
- Kennedy, B., et al. Identification of a zebrafish cone photoreceptor-specific promoter and genetic rescue of achromatopsia in the nof mutant. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (2), 522-529 (2007).
- George, A., et al. Synaptojanin 1 is required for endolysosomal trafficking of synaptic proteins in cone photoreceptor inner segments. PLoS ONE. 9 (1), e84394 (2014).
- Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases. Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).
- Giarmarco, M., Lindsay, K., Du, J., Cleghorn, W., Brockerhoff, S., Hurley, J. Imaging Real-time Glucose Uptake Reveals Distinct Transport Among Cell Types. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. , (2015).
- Kanow, M., et al. Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye. eLife. 6, (2017).
- Giarmarco, M., Cleghorn, W., Sloat, S., Hurley, J., Brockerhoff, S. Mitochondria Maintain Distinct Ca2+ Pools in Cone Photoreceptors. J. Neurosci. 37 (8), 2061-2072 (2017).
- Uckermann, O., et al. Selective staining by vital dyes of Müller glial cells in retinal wholemounts. Glia. 45 (1), 59-66 (2003).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Current protocols in cytometry. , (2012).
- Kulkarni, M., et al. Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (99), (2015).
