Summary
我々は、1)レンチまたはレトロウイルス伝達のための磁気ナノ粒子を使用して腸内オルガノイドを効率的に設計し、2)工学的オルガノイドから凍結切片を生成するステップバイステップの指示を説明する。このアプローチは、下流の効果を調査するためにオルガノイドの遺伝子発現を効率的に変更するための強力なツールを提供します。
Abstract
腸内オルガノイド培養は、インビトロで腸幹細胞と暗号生物学を調べるユニークな機会を提供しますが、オルガノイドの遺伝子発現を操作する効率的なアプローチは、この分野で限られた進歩を遂げています。CRISPR/Cas9技術は、オルガノイド生成のための細胞の正確なゲノム編集を可能にしますが、この戦略は、時間とコストの両方である配列分析による広範な選択とスクリーニングを必要とします。ここでは、腸内オルガノイドの効率的なウイルス伝達のための詳細なプロトコルを提供する。このアプローチは迅速かつ高効率であるため、CRISPR/Cas9テクノロジーに固有の時間と費用を削減できます。また、遺伝子発現やサイレンシングを確認するために使用できる免疫組織化学的または免疫蛍光染色を用いたさらなる分析のために、無傷のオルガノイド培養物から凍結切片を生成するプロトコルを提示する。遺伝子発現またはサイレンシングのためのウイルスベクターの正常な伝達が達成された後、腸幹細胞および暗号機能を迅速に評価することができる。ほとんどのオルガノイド研究はインビトロアッセイを採用していますが、オルガノイドは生体内機能解析のためにマウスに送達することもできます。また、現在利用可能な治療法は、ゲノムを変えるのではなく遺伝子発現やタンパク質機能を調節することによって一般的に機能するため、薬剤に対する治療応答を予測する上で有利です。
Introduction
マウスまたはヒトの暗号を小腸または結腸から長期間にわたって3次元(3D)オルガノイドとして培養する能力は、これらの培養物が生体内の腸上皮の特徴を定義するので、大きなブレークスルーを提供した1,2,3.原発性暗号に由来するオルガノイドは、自己更新および自己組織化が可能であり、起源の組織と同様の細胞機能を示す。実際、オルガノイドは、生体内のクリプトの構造組織だけでなく、多くの分子特徴を要約し、正常な生物学や疾患状態を研究するのに有用なツールを提供します。例示するために、オルガノイド研究は、組織再生1、2、3、4、5だけでなく、機能を増強することができる薬物に関与する新しい分子経路を明らかにした病理学的設定6、7で。
腸幹細胞の研究は、腸内層が最も再生性の高い哺乳類組織の一つであるため、特に興味深いものであり、細菌、毒素、およびその他の病原体から生物を保護するために3〜5日ごとに更新する腸の内気。腸幹細胞(ISC)は、この顕著な再生能力を担い、成人幹細胞機能1、2を研究するためのユニークなパラダイムを提供します。マウスの系統トレース実験は、単離されたLgr5陽性幹細胞を培養して、3Dオルガノイドまたは「ミニ腸」をインビトロで生成し、インビボに近い形でそれらが密接にミラーリングできることを実証した。オルガノイド培養はまた、前駆体、ISC、およびパネス細胞からなる腸暗号細胞単離物から導き出され、後者は生体内の上皮ニッチ細胞を構成する。実際、原発性腸暗号細胞からのオルガノイド培養は、広く利用可能な試薬を使用してほとんどの実験室で実装しやすい比較的日常的な技術に進化しています。このモデルはまた、質量分析、免疫組織化学、または免疫蛍光染色2、4、8によるRNAシーケンシング(RNA-Seq)およびタンパク質による遺伝子発現の定量分析にも適している。さらに、機能遺伝学は、機能ゲイン(活性化変異遺伝子の遺伝子過剰発現または発現)または機能喪失(遺伝子サイレンシングまたは機能喪失変異体の発現)アプローチ2を用いて研究することができる。
重要なことに、ポリブレンを用いた標準的なプラスミドDNAまたはウイルス伝達プロトコルの低効率および高毒性は、この分野における大きなハードルのままである。CRISPR/Cas9技術は正確なゲノム編集を可能にしますが、このアプローチでは、シーケンス検証9に続いて時間のかかる選択が必要です。ここでは、磁気ナノ粒子への結合と磁場の応用によりウイルス粒子の送達を最適化する一次腸内オルガノイドのウイルス伝達プロトコルを提示する。以前のプロトコル4、5、10、11、12、13および効率を高めるための推奨事項に対する主要な変更が提供される。また、免疫組織化学または免疫蛍光染色を用いたさらなる分析のために、3Dマトリゲル(以下、地下膜マトリックスまたはマトリックスと呼ばれる)で培養された無傷のオルガノイドから凍結切片を生成するアプローチについても説明する。
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Protocol
このプロトコルは、ジョンズ・ホプキンス医療機関動物ケア・使用委員会(IACUC)によって承認されました。このプロトコルは、以前に公開された方法10、11、12、13から変更されます。
1. 試薬の調製
- 新鮮な293T培地を数時間前に準備し、水浴中37°Cまで少なくとも10分間温めます(表1)。
- ウイルス包装用のプラスミドDNA2、13、14を調出す。(表2)。
- その他すべての必要な資料(材料の表)を取得します。
2. レンチウイルスまたはレトロウイルス粒子産生
- ヒト胚腎臓(HEK)293T細胞播種(1日目)
- リン酸緩衝生理食べ物(PBS;10 mL/皿)に溶解した50μg/mLポリD-リジンを室温(RT)で1時間に塗布し、150mm培養皿を150mmの培養皿に加えます。
- リン酸緩衝生理食生(PBS)/ポリD-リジンを取り出し、5 mL PBSで塗った皿を2回洗います。
- 種子293T細胞(8\u201210 x10 6)を293T培地(表1)で15mLの総容積にする。
- 標準的な組織培養インキュベーターで一晩293T細胞を培養(37°C、5%CO2)。
- HEK 293T細胞トランスフェクション(2日目)
- 細胞が70-80%の合流に達したらトランスフェクションを行う(通常、シード後約24時間8\u201210 x 106細胞)。
- 市販のカチオン性リポソーム製剤(表1\u20122、材料の表)2などの効率的なアプローチを使用してトランスフェクション混合物を調製する。
- 希釈レンチウイルスDNAは、トランスフェクション培地の1.2mLで12(合計〜24μgプラスミドDNA、表2)を構築し、1.5mLチューブ(材料の表)でRTで5分間インキュベートする。
- トランスフェクションリージェント(36μL)を1.2mLのトランスフェクション培地(材料表)で希釈し、メーカーの指示に従って5mLチューブで5分間インキュベートします。
- トランスフェクション試薬(ステップ2.2.2.2)にレンチウイルス試薬(ステップ2.2.2.1)を追加し、5 mLピペを使用して上下にゆっくりとピペッティングして穏やかに混合します。
- RTで20分間混合物をインキュベートします。
- トランスフェクション培地の5mLで293T細胞を穏やかに洗浄し、トランスフェクション培地の10 mLに置き換えます。
- DNA脂質複合体(ステップ2.2.2.3から)を293T細胞の培地に滴下し、各皿のDNA脂質複合体の均等な分布を確保するために、水平方向と垂直方向に移動して培養皿内の培地を慎重に混合します。
- 標準的な組織培養インキュベーター(37°C、5%CO2)で6時間インキュベートする。
- インキュベーション後、培地を20mLの新鮮なウイルス採取培地に置き換える(表1)。
- ウイルス収集 (日 3\u20125)
- 50mLチューブでウイルス媒体を回収し、さらに濃縮するために4°Cの冷蔵庫に保管してください。
- 新鮮なウイルス収集培地を24時間毎に20mLに置き換え、一晩培養(~24時間)を行います。次の 2 日間にメディア コレクションを繰り返します (日 4\u20125)。
- 5日目以降に回収された培地の総体積が~60 mL(20 mL/日×3日)であることを確認してください。
- ウイルス濃度(5日目)
- 収集したメディア (60 mL) を 400 x g で 5 分間遠心分離します。次に、フィルター(0.45 μmの細孔)を通して上清を通過し、細胞の破片を除去します。
- 遠心フィルターユニット(材料の表)に15mLの濾過ウイルス培地を加えてウイルスを濃縮する。4 °Cで15分間2,500 x gの遠心分離機。ウイルスは、このフィルタを通過することができないので、それはフィルタの上部の部屋に集中されます。
- チューブ(底部室)からの流れを吸引し、同じ遠心フィルターユニットに残りのウイルス収集培メディア上清の別の15 mLを追加します。上記のように遠心分離機(4°Cで15分間2,500 x g)上清から追加のウイルスを濃縮する。
- 所望の濃度(~100倍)に達するまで、単一の変圧プレートから60 mL培地に対して同じフィルタを使用してプロセスを繰り返します。
注:我々は通常、約600 μLにウイルス収集培地の〜60 mLを濃縮します。 - 1 mLピペを使用してフィルターの上部のチャンバから濃縮ウイルスを取り出し、アリコートを1.5mLチューブ(50\u201260 μL/チューブ)で後で使用します。濃縮粒子を最大6\u201212ヶ月間保存します。
3. クリプトの分離
- 地元のIACUCガイドラインに従ってCO2を用いてマウスを安楽死させる。
- 安楽死した動物を背中に置き、70%のエタノールを噴霧して腹部を洗います。
- 胸骨から鼠径部への縦方向中線切開を行い、まず皮膚を切開し、次に皮下組織を切開する。
- 胃から盲腸に小腸を取り除きます。
- 小腸内の関心のある領域を識別します。;暗号は十二指腸、済腸および回腸から隔離することができる。
- 10 mL注射器を使用して、10cm組織培養皿(表)で、分離された小腸を暗号解離バッファー(1mMジチオスレイトール(DTT)を含む予め冷やされたPBS)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Ca 2+およびMg 2+)で洗い流す(1)
- 末梢脂肪組織を取り除き、無菌ガラス板(15cm x 15cm)で腸組織を縦方向に開いたり「フィレット」したりします。
- 細胞スクレーパーを使用して腸上皮絨毛をそっと掻き取る。
- 小腸を2\u20123 cmの長さのセクションに切ります。
- 平らな鉗子(116 mm)を使用して、予め冷やされたPBSを含む15 mLチューブに組織を移します。組織断片を手で激しく振って~30秒間(チューブを反対方向に~60回動かす)で洗います。
- PBSをリフレッシュし、PBSが明らかになるまで洗浄を繰り返します。
注: 通常、フラグメントを 2\u20123 回洗浄します。 - PBSが明確になったら、中速で軌道シェーカーで4°Cで10mLの暗号解離バッファー(表1)を含む15mL円錐管で組織をインキュベートする。
- 約30秒間手でチューブを激しく振り(反対方向≥60回)し、平らな鉗子を用いて組織を10mLの暗号解離バッファーを含む別の15mL円錐管に移す。氷の上にこの分数をインキュベートします。それは主にビリヤードが含まれているので、オルガノイド培養のための最初の分数を使用しないでください。
- 手順 3.11\u20123.13 を 3\u20124 回繰り返し、各分数を収集して氷の上に置きます。
- 反転顕微鏡(4倍)の下で各画分から200 μLサンプルをスキャンすることにより、腸の暗号の割合が最も高い分数で濃縮された分数を選択します。前述のように典型的な形態によって暗号を識別する (図 1A)10.
注:それらは形の円形または楕円形に現れ、造粒されたパエス細胞を含んでいる。対照的に、villiは粒状のパレス細胞を欠く指状の構造である(図1B)。 - 必要に応じて、40 μm セル ストレーナーを通して選択した画分を渡し、必要に応じて同様のサイズの暗号を取得します。あるいは、マウスがEGFP-Lgr5+背景またはLgr5+細胞2の同定を可能にする別の適切なモデルに交差した場合、緑色蛍光タンパク質(GFP)のフローサイトメトリーに基づいてLgr5+幹細胞を単離する。
- 選択した分数の暗号の合計数を次のようにカウントします。
- 選択した画分のピペット50 μLをヘモサイトメーターにし、反転光顕微鏡(4倍)を用いて暗号の数を数える。48ウェルプレートを使用する場合は、遺伝子サイレンシングまたは過剰発現の実験条件ごとに3\u20126ウェルをトランスメーションするトランスダクション実験を可能にするために、ウェルあたり約100のクリプトを配置します。
- 50 μL あたりの暗号数に基づいて、必要な暗号解離バッファーの体積を計算し、その体積を 1.5 mL チューブに転送します。
注: たとえば、50 μL あたり 10 のクリプトがカウントされ、300 μL には 6 x 50 μL または 300 μL が必要です。
- 1.5 mL チューブの暗号を 300 x gで 5 分間遠心分離します。
- 上清を上流液層からゆっくりとピペッティングして慎重に廃棄し、成長因子の100μLでペレットを再懸濁し、氷上の基底膜マトリックスを減少させます(材料の表)。
- マトリックス含有クリプトを37°C予温めた48ウェルプレート(30μL/ウェル、約100°c/ウェル)にシードします。標準的な組織培養インキュベーターでプレートを5\u201215分間インキュベートし、マトリックスゲル化を可能にします(37°C、5%CO2)。
- 250 μLオルガノイド培地(ENR)培地(表1)で各ゲルをオーバーレイし、48ウェルプレートを標準組織培養インキュベーター(37°C、5%CO2)に戻します。24時間後に小さく、丸い、嚢胞性の形に暗号組織のための文化をチェックしてください。芽は2\u20125日後に形成されます。
- ENRメディアを3日ごとにゆっくりと交換してください。穏やかな吸引で古いENRメディアを取り外し、メディアを交換する際にマトリックスに触れないように注意してください。
- 前述の11日のように4\u20127日ごとに経過オルガノイド培養.
4. オルガノイド断片調製
- トランスデュースオルガノイドは、一度形成される(1\u20122週以内)か、または通過後にオルガノイドをトランスデュースする。単一のトランスダクション実験では、2\u20123ウェルを、実験伝達条件ごとに〜100\u2012200オルガノイド/ウェルまたは〜200\u2012600オルガノイドを条件ごとに48ウェルプレートで調製します。
- 250 μL経電媒体(表1)と3日以上、またはオルガノイドが嚢胞性形態を採用するまで、経度培地中の培養物と交換する。Wnt3aおよびROCK阻害剤(Y27632)の両方をトランスダクション培地に含め、幹細胞およびペネス細胞の数を増やす。ニコチンアミド(Nic)は培養効率を向上させる(表1の経度誘導媒体を参照)。
- 1 mLピペットを使用して、メディアとピペット先端を用いてドーム状の地下膜マトリックス構造を機械的に破裂させる。
- オルガノイドと培媒体を無菌の1.5 mLチューブに移します。
- 200 μL ピペット~10\u201215 回のピペッティングによってマトリックスをさらに機械的に破壊します。
- RTでオルガノイ片を5分間500xgで遠心分離します。
- ピペットを使用して上清を慎重に廃棄し、1 mL DMEM/F12培地でペレットを再懸濁します(表1)。
- ディスパセI(10mg/mLで6μL)とDNase I(10mg/mLで2.5 μL)を追加します。1 mLピペを使用してゆっくりとピペッティングしてよく混ぜます。
- 1.5 mLチューブで20分間37°Cでオルガノイドをインキュベートします。
- 解離反応を終了するためにENR培地の500 μLを追加します。ENRの血清は反応を終了する。
- オルガノイド細胞を20μmの細胞ストレーナーを通して渡し、オルガノイド断片を400 x gで5分間遠心分離します。
- 150 μL 経度伝達媒体を使用してオルガノイド断片を再中断する(表1)。
5. ウイルス伝達によるオルガノイドまたは暗号細胞の遺伝子工学
注:図 2を参照してください。
- 200 μLの経電培地を48ウェルプレートで培養し、標準組織培養インキュベーター(37°C、5%CO2)でインキュベートする種子オルガノイド細胞クラスター。あるいは、48ウェルプレートに200μLの経電培地/ウェルに新たに単離したクリプト細胞(〜1,000クリプト)を入れ、標準的な組織培養インキュベーター(37°C、5%CO2)でインキュベートする。
- トランスダクション用ウイルスのバイアルを解凍し、48ウェルプレートで各ウェルの伝達に対して約50μLの濃縮ウイルスを可能にし、24ウェルプレートでウェル当たり約100μLの濃縮ウイルスを使用します。
- 1.5 mLチューブ(表3)でRTで15分間12μLの磁気ナノ粒子溶液を用くウイルスをインキュベートする。
- 磁性ナノ粒子溶液/ウイルス混合物を加電する細胞に添加する。
- 細胞培養プレートを磁気プレート上に置き、標準組織培養インキュベーター(37°C、5%CO2)で少なくとも2時間(および最大約6時間)インキュベートする。
6. 感染したオルガノイド断片の播種
- 感染したオルガノイド細胞クラスターとトランスダクションメディアを各ウェルから1.5 mLチューブに移します。
- 500 x gで 5 分間遠心分離機。
- 穏やかな吸引で上清を廃棄し、5分間氷の上にペレットを含むチューブを冷却します。
- 120 μLの地下膜マトリックスを追加し、ゆっくりと上下にピペッティングしてペレットを再サスペンドします。
- マトリックス細胞混合物の種子30μL滴を新しい48ウェルプレートに入れます。
- マトリックスが固まるまで、プレートを37°Cで5\u201215分間インキュベートします。
- 各ウェルに経誘導培地を追加し、3\u20124日(37°C、5%CO2)の標準的な組織培養インキュベーターでインキュベートする。
- 3\u20124日後、光顕微鏡(10倍)で培養物を検査し、細胞クラスターをオルガノイ構造に組織することを確認します。次に、トランスダクションメディアを250 μL ENR培地でゆっくりと交換します。
- 3\u20124 日ごとにメディアを交換してください。
7. 選択(該当する場合)
- 2\u20123日後,該当する場合はトランスダクション培地に選択するための関連する抗生物質またはホルモンを追加します。
注:プラスミドはピューロマイシン耐性遺伝子2、14を保有していたため、レンチビリアル伝達の選択にピューロマイシン(2μg/mL)を用いた。
8. 正常な伝達および遺伝子発現またはサイレンシングの確認
- FUGWレンチウイルス2、14を用いる場合、蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーを介してGFP信号を測定することにより、経流効率を推定する。
- コントロールおよび実験オルガノイド培養におけるmRNAの定量的比較のために、定量的な逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を用いて遺伝子過剰発現またはサイレンシングを検証する。
- ウェスタンブロットまたは免疫染色2によるタンパク質コード遺伝子発現またはサイレンシングのタンパク質レベルを確認する。
9. 基体膜マトリックスにおけるオルガノイド凍結切除
注:図 3を参照してください。
- 穏やかな吸引によってENR培地を取り除き、地下膜マトリックスを乱しないように注意し、PBSの500 μLで1回穏やかに洗浄する。
- 4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液(材料の表)の1.0 mLでオルガノイドを30分間RTで固定します。
- 吸引によりPFAを取り出し、1mL PBSで2回静かに洗浄します。
- 吸引によってPBSを取り除き、各サンプルに30%のスクロースバッファーの1.0 mLを加える。スクロースの固定オルガノイドを、冷蔵庫、冷蔵庫、または氷の上で1時間、スクロースにインキュベートしてサンプルを脱水します。
- 吸引によってスクロースバッファーを除去し、各ウェルにマトリックス層(〜300 μL/ウェル)をカバーするのに十分な埋め込み化合物(材料のテーブル)を追加します。
- RTで5分間インキュベートします。
- -80 °Cの冷凍庫に10分間、または埋め込み化合物が固体と白に変わるまでサンプルを置きます。
- 端に沿って化合物の最小限の融解を可能にするためにRTで冷凍埋め込み化合物で皿を置きます。井戸の壁からブロックを分離するためにメスを使用してください。
- 鉗子を使用してマトリックス埋め込み複合ブロックを取り除き、試料ブロック(例えば凍結)に入れ、溶融を防ぐために迅速に働きます。
- 埋め込み化合物で完全に金型を充填し、-80 °Cで30分間凍結します。
- ブロックを使用すると、さらに使用するために-80 °C冷凍庫で断面または保管用です。
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Representative Results
ここでは、磁場にさらされた磁性ナノ粒子を利用して、目的の細胞にレンチウイルスを届ける、迅速かつ効率的なトランスダクション技術について述べる。容易に入手可能なツールを用いて、新たに単離されたクリプト細胞(図1A)をトランスデュースするだけでなく、オルガノイド(図2)やより日常的なトランスダクションアプローチに難治性である他の細胞にもこのアプローチを適用しました。レンチウイルス粒子は、磁性ナノ粒子に容易に結合することができ、得られたウイルスナノ粒子複合体は、磁気プレートを使用して磁場を適用することにより効率的に送達されます。このアプローチを最適化するために、まずGFPにリンクされたレンチウイルスベクターを試験し、GFPを使用して蛍光顕微鏡でトランスプリケートされた細胞を同定しました。GFPは、細胞を嚢胞状の構造に組織化する初期の段階(図4A)、またはオルガノイドが芽を形成する後の時点(図4B)を含む、オルガノイド発達の各段階で可視化することができる。正常に変換された腸内オルガノイドは、細胞膜と核を染色して、リゾザイムなどの系統マーカーに加えて総細胞数を列挙して、ペネス細胞を同定することで、発達の変化に対する機能解析を受けることができる(図4C)。
遺伝子組み換えオルガノイドは、ここで概説されているように凍結切片を生成することによって、さらなる分析に使用することができます(図3)。オルガノイドを埋め込んだ後、凍結したブロックを保存し、後で将来の研究のために切り分けることができます。このアプローチはまた、効率的である(総オルガノイドに対するGFP(+)オルガノイドの割合に基づいて〜95%であると推定される)。このアプローチは、標準的な実験室試薬で行うことができ、したがって、細胞数、細胞の運命、および特定のタンパク質の存在およびレベルを含む多様な調査に適した組織を提供する2。例えば、凍結切片と免疫蛍光染色を用いて、個々の細胞を同定し、細胞型を確認した(図4C)。
図1:典型的な形態を示す漫画を持つ孤立した地下室とビリヤード。(A) 孤立した暗号は円形または楕円形の構造を形成する。(B) Villiは指のような構造として識別される。スケールバー = 50 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:磁気ナノ粒子を用いたオルガノイドのウイルス伝達の概略図と磁場への曝露トランスダクション プロトコルの最も重要な手順を示します。(A) 1.5 mLチューブでRTで15分間ウイルスおよび磁気ナノ粒子溶液をインキュベートする。(B) 磁性ナノ粒子/ウイルス混合物を加圧する細胞に添加する。(C) 細胞培養プレートを磁気プレート上に置き、標準組織培養インキュベーターで2時間インキュベートする。より長いインキュベーション時間はまた使用することができる(〜6時間);。代表井戸は磁気プレート上にここに示されています。(D)ウイルスおよび磁気ナノ粒子で移圧される細胞が示されている。(E) 感染したオルガノイド細胞クラスターとトランスダクション媒体を各ウェルから1.5mLチューブに移し、遠心分離機を500×5分で5分間放置し、ペレットを含むチューブを5分間冷却する(F)追加120 μLの地下膜マトリックスを、ゆっくりと上下にピペッティングしてペレットを再サスペンドします。(G)新しい48ウェルプレート内の各ウェルにマトリックス細胞混合物を含む30μLの種子滴。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:3Dマトリックスにおけるオルガノイドの凍結断面図の概略図。フリーズされた断面化プロトコルの最も重要な手順が示されています。(A)24ウェル細胞培養プレート内の単一のウェルが図示される。(B) マトリックス層(~300 μL/ウェル)をカバーするのに十分な埋め込み化合物を追加し、RTで5分間インキュベートします(C)サンプルを冷凍庫に-80 Cに10分間、または埋め込み化合物が固体と白に変わるまで置きます。次に、RTに皿を置き、サンプルの縁に沿ってわずかに溶け込むことを可能にします。(D) メスを使用して、井戸の壁からブロックを分離します。(E) 鉗子を使用してマトリックス埋め込み複合ブロックを取り出し、組織を凍結するための適切な浅い容器または金型に入れます。埋め込み化合物(OCT)で金型を完全に充填します。(F) 30分間冷凍庫で-80 Cでブロックを凍結する (G) ブロックは、さらに使用するために-80 C冷凍庫で断面または保管する準備ができています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:トランスネクト腸オルガノイドの代表画像。(A)蛍光顕微鏡下の小腸オルガノイドの代表的な画像(左)蛍光顕微鏡、および、(右)トランスジーン発現(EGFP)の標準顕微鏡検査(EGFP)経度転換後3日目。スケールバー= 50 μm. (B) 磁気ナノ粒子を用いて転写後のオルガノイド中のGFPをコードする遺伝子の過剰発現の例。オルガノイド細胞は、GFP(FUGW;)を発現するレンチウイルスでトランスネクシスした。上)またはレンチウイルス過剰発現Hmga1(FUGW-Hmga1; 下)は、経度後12日目に示すように。スケールバー = 50 μm. (C) ホルマリン固定凍結部オルガノイドの免疫蛍光イメージング.オルガノイド切片(4μm)を抗リゾザイム(赤色)、抗EpCAM(緑色)及びDAPI(青)で染色した。EpCAMは細胞境界を区切り、DAPIは個々の核を示し、リザイムはペネス細胞を染色する。スケールバー = 50 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| オルガノイド培養培地(ENR) | 100 mL |
| DMEM/F12+ | 96 mL |
| L-アラニル-L-グルタミンジペプチドサプリメント(例えばグルタマックス) | 1 mL |
| ネア | 1 mL |
| ペン/ストレップ | 1 mL |
| Hepes | 1 mL |
| EGF (100 μg/ mL) | 5 μL |
| ノギン (100 μg/ mL) | 10 μL |
| R-スポンジン (100 μg/ mL) | 10 μL |
| またはR-スポンディン条件媒体(CM) | 20 mL |
| ヒト組換えインスリン (10 mg/ mL) | 5 μL |
| トランスダクション媒体 | 5 mL |
| ENR 媒体 | 2.4 mL |
| Wnt 条件媒体 (CM) | 2.5 mL |
| ニコチンアミド (1M) | 100 μL |
| Y27632 (10 μM) | 10 μL |
| 解離バッファをクリプトする | 100 mL |
| PBS (Ca2+なし, Mg2+) | 99 mL |
| ペン/ストレップ | 1 mL |
| 0.5 M エダ | 100 μL |
| 0.1 M DTT (ジチオスレイトール) | 100 μL |
| 293T媒体 | 100 mL |
| DMEM | 90 mL |
| Fbs | 10 mL |
| ウイルス収集媒体 | 100 mL |
| DMEM | 99 mL |
| Fbs | 1 mL |
| オルガノイド消化バッファー | 1 mL |
| DMEM/F12+ | 1 mL |
| ディスパーゼ I (10 mg/ mL) | 6 μL |
| DNASE I (10 mg/ mL) | 2.5 μL |
表 1: プロトコルで使用されるメディア。
| プレート | 10センチメートル | 15センチメートル |
| レンチウイルストランスデュースベクター | 6 μg | 9 μg |
| CMVΔR8.91 | 8 μg | 12 μg |
| Md。G | 2 μg | 3 μg |
| ベクトルの合計 | ≤16 μg | ≤24 μg |
表2:トランスフェクション用プラスミドDNAの量
| プレート | 磁気ビーズ(μL) | ウイルスの体積(μL) | 最終経度量(μL) |
| 48ウェル | 6 | 50歳 | 250名 |
| 24ウェル | 12歳 | 100人 | 500名 |
表3:磁気ビーズ溶液およびベクトルの体積。
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Discussion
オルガノイドとしての成人腸上皮の一次培養は、幹細胞機能、腸上皮恒常性、病理1、2、3、病理学に関与する分子機構を研究するための強力なツールを提供する。 4.CRISPR/Cas9技術は、遺伝子操作可能なオルガノイド9に使用できますが、所望の遺伝的変化に対する配列解析に基づく広範なスクリーニングと選択の必要性によって制限されます。このプロトコルの目的は、腸オルガノイドへのレンチまたはレトロウイルスの磁気ナノ粒子送達のためのビデオベースのチュートリアルで明確かつ簡潔な指示を提供し、続いて凍結断面を提供してさらなる分析を行う。
このプロトコルは、腸内オルガノイドを遺伝子操作し、凍結した切片からの遺伝子過剰発現またはサイレンシングの結果を分析するための迅速かつ効率的な方法です。重要な手順の概要を図2、図 3に示します。この戦略は、腸幹細胞における遺伝的変化(過剰発現またはサイレンシング)および3D条件2,13下で培養された子孫の生物学的意義の調査を可能にする。我々はまた、異なる一次細胞2、13におけるインビトロでの細胞伝達およびトランスジーン発現を増強するために、ウイルスベクターのこの磁気ナノ粒子ベースの送達を使用した。
このアプローチでは、ウイルス粒子を磁性ナノ粒子で被覆し、磁場に曝露して細胞に送達する。双生細胞の有無にかかわらずポリブレンなどの現在の伝達方法と比較して、遺伝物質の取り込みはエンドサイトシスによって媒介されるため、磁気ナノ粒子ウイルス複合体は細胞に対する毒性が低く、ピノサイトシスは、細胞膜に重大な損傷を引き起こさない2つの自然発生生物学的プロセスである。これにより、細胞の生存率と経度効率の両方が高められる。経誘導効率は、以前に報告されたより大きな暗号または全体のオルガノイドの代わりに、小さな暗号断片または単一細胞(ステップ4.8を参照)を用いてさらに増加してもよい。磁気的に導導かれたナノ粒子送達は、標的細胞2、13へのウイルスベクターの急速な蓄積、浸透、および取り込みをもたらす。磁性ナノ粒子は、完全に生分解性であり、特定の独自のカチオン分子でコーティングされた酸化鉄で作られています。ウイルスベクターとのナノ粒子の関連は、塩誘発コロイド凝集および静電相互作用によって達成される。ナノ粒子は、次いで、培養皿の下に置かれた磁気プレートによって生成される外部磁場によって細胞に濃縮される。経誘導効率は95%に近づくが、すべての細胞がトランスデュースされるわけではないが、これはこの技術の限界である。さらに、CRISPR/Cas9アプローチと同様に、内因性発現遺伝子は変化しない。
遺伝子の過剰発現またはサイレンシングに続いて、オルガノイドは、遺伝子発現の分析、細胞内のプロテオミズム変化、細胞によって分泌される、代謝変化、および科学的目的に応じて、無数の研究に使用することができます。形態学的変化。生体組織と同様に、転写因子、細胞質分子、細胞表面マーカーなどの特定のタンパク質の免疫組織化学および免疫蛍光研究のために凍結切片を得ることができます。私たちの記事は、3D文化における彼らの位置と組織を妨げることなく、オルガノイドから凍結セクションを得るための効果的なアプローチが含まれています。これは、以前の技術が16を凍結する前に地下膜マトリックスからオルガノイドを除去する必要があるため有利である。マトリックスからの除去によるオルガノイドの処理は、インビトロの成長と発達を反映するのではなく、オルガノイドの構造組織を破壊する可能性がある。
このプロトコルは、腸内オルガノイドを遺伝子操作することも、他の細胞ベースのモデルおよびオルガノイド系を研究するように適合させることができる。例えば、膵臓、結腸、肝、心臓、および脳オルガノイド系は、このアプローチでトランスケートすることができる。より標準的な培養技術の下で成長する細胞でさえ、ナノ粒子技術に適しています。さらに、このアプローチは、幹細胞由来オルガノイド系の文脈だけでなく、腫瘍オルガノイドにおいても、疾患の分子機構を研究するために適用することができる。
要約すると、腸内オルガノイド研究のためのこれらのプロトコルに記載されている主要な変更は、うまくいけば、腸幹細胞の生物学とその子孫に関与する重要な要因と下流経路の役割を解明する科学者を支援します.これらのアプローチは、生理学的および病理学的条件の両方下で、自己再生、細胞運命決定、組織恒常性、および腸上皮再生の基礎となる分子メカニズムについてより多くを学ぶ手段を提供すべきである。
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Disclosures
著者は開示するものが何もない
Acknowledgments
この研究は、国立衛生研究所(R01DK102943、R03CA182679、R03CA191621)、メリーランド幹細胞研究基金(2015-MSCRFE-1759、2017-MSCRFD-3934)、米国肺協会、アレニー・ネットワーク・ジョンからの助成金によって支援されました。ホプキンス研究基金とホプキンス消化器病基礎研究センター
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Base medium for 293T cells |
| DMEM/F12+ | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer |
| OPTI-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Virus plasmids transfection medium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | Component of virus collection medium and 293T medium |
| Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer |
| PBS (without Ca2+, Mg2+) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | A wash buffer and component of crypt dissociation buffer |
| Mem-NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Component of organoid culture medium |
| GlutamaxII | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Component of organoid culture medium |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Component of organoid culture medium |
| EGF | Millipore Sigma | E9644 | Component of organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 250-38 B | Component of organoid culture medium |
| R-spondin | R&D | 7150-RS-025/CF | Component of organoid culture medium |
| Human recombinant insulin | Millipore Sigma | I9278-5ml | Component of organoid culture medium |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N3376-100G | Component of Transduction medium |
| Wnt3A | R&D | 5036-WN-010 | Component of Transduction medium |
| Y27632 | Millipore Sigma | Y0503-1MG | Component of Transduction medium |
| 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Component of Crypts dissociation buffer |
| DTT (dithiothreitol) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | Component of Crypts dissociation buffer |
| Dispase I | Millipore Sigma | D4818-2MG | Component of organoid digestion buffer |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Component of organoid digestion buffer |
| matrigel(Growth factor reduced) | Corning | 356231 | Used as a matrix to embed organoids |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Medium for transfection in viral production |
| ViralMag R/L | Oz Biosiences | RL40200 | Magnetic particles of viral transduction |
| Magnetic plate | Oz Biosiences | MF10000 | Magnetic plate to facilitate viral transduction |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Transfection agent in viral production |
| Poly-D-Lysine | Millipore Sigma | A-003-E | Coating for plates before seeding 293T cells |
| 4% Formaldehyde Solution | Boster | AR1068 | Solution to fix organoids |
| O.C.T embedding compound | Thermo Fisher Scientific | 4583S | For embedding of the the organoids |
| 5 mL Falcon polystyrene tubes | Corning | 352054 | |
| 50 mL Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.100 | |
| Orbitron rotator II Rocker Shaker | Boekel Scientific | 260250 | |
| Olympus Inverted microscop CK30 | Olympus | CK30 | for scanning and counting crypts |
| Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence | Nikon | Axiovert 200 | for viewing fluorescence in the crypts |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane | Milipore Sigma | UFC910024 | For concentrating viruses |
| pluriStrainer 20 µm (Cell Strainer) | pluriSelect | SKU 43-50020 | For preparing organoid fragments |
| Falcon Cell Strainer | Fisher Scientific | 352340 | For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid) | Millipore Sigma | M8937-100EA | ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments |
| Animal strain: C57BL/6J | Jackson Lab | #000664 | For organoid culture |
References
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