Summary
Vi beskriver steg-för-steg-instruktioner för att: 1) effektivt iscensätta intestinala organoider med hjälp av magnetiska nanopartiklar för lenti-eller antiretrovirala transduktion, och, 2) generera frysta sektioner från konstruerade organoider. Detta tillvägagångssätt ger ett kraftfullt verktyg för att effektivt förändra genuttryck i organoider för utredning av nedströms effekter.
Abstract
Intestinala Organoid kulturer ger en unik möjlighet att undersöka intestinal stamceller och crypt biologi in vitro, även om effektiva metoder för att manipulera genuttryck i organoider har gjort begränsade framsteg på denna Arena. Medan CRISPR/Cas9 teknik möjliggör exakt genom redigering av celler för Organoid generation, kräver denna strategi omfattande urval och screening av sekvens analys, vilket är både tidskrävande och kostsamt. Här ger vi ett detaljerat protokoll för effektiv viral transduktion av intestinala organoider. Denna metod är snabb och mycket effektiv, vilket minskar den tid och kostnader som är förknippade med CRISPR/Cas9 teknik. Vi presenterar också ett protokoll för att generera frysta sektioner från intakt Organoid kulturer för vidare analys med immunohistokemisk eller Immunofluorescerande färgning, som kan användas för att bekräfta genuttryck eller ljuddämpning. Efter lyckad transduktion av virala vektorer för genuttryck eller ljuddämpning uppnås, kan intestinal Stem cell och crypt funktion snabbt bedömas. Även om de flesta Organoid studier använder in vitro-analyser, kan organoider också levereras till möss för in vivo funktionella analyser. Dessutom, våra metoder är fördelaktiga för att förutsäga terapeutiska svar på läkemedel eftersom närvarande tillgängliga terapier i allmänhet fungerar genom att modulera genuttryck eller proteinfunktion snarare än att förändra genomet.
Introduction
Förmågan att odla mus eller mänskliga kryptor celler som tredimensionell (3D) organoider från tunntarmen eller tjocktarmen under längre tidsperioder som ett stort genombrott eftersom dessa kulturer Visa definierande egenskaper av intestinal epitel in vivo 1 , 2 , 3. organoider som härrör från primära kryptor kan själv förnyas och självorganisering, uppvisar cellulära funktioner som liknar deras vävnader av ursprung. Faktum organoider recapitulate inte bara strukturell organisation av kryptor in vivo, men också många molekylära funktioner, vilket ger användbara verktyg för att studera normal biologi och sjukdomstillstånd. För att illustrera, Organoid studier har avslöjat nya molekylära vägar involverade i vävnadsregenerering1,2,3,4,5 samt läkemedel som kan förbättra funktionen i patologisk inställningar6,7.
Studiet av tarm stamceller är av särskilt intresse eftersom tarmslemhinnan är bland de mest regenerativa däggdjursvävnader, förnya sig varje 3-5 dagar för att skydda organismen från bakterier, toxiner och andra patogener inom tarm lumen. Intestinala stamceller (iSCS) är ansvariga för denna anmärkningsvärda regenerativ förmåga och därmed ge en unik paradigm för att studera vuxna stamceller funktion1,2. Försök med härstamnings spårning hos möss visade att isolerade Lgr5-positiva stamceller kan odlas för att generera 3D-organoider eller "mini-Guts" in vitro där de nära speglar deras in vivo motsvarigheter. Organoid kulturer kan också härledas från intestinal crypt cell isolat består av progenitorer, ISCs, och Paneth celler, den senare som utgör epiteliala nisch celler in vivo. I själva verket, Organoid kultur från primära tarm kryptan celler har utvecklats till en relativt rutinmässig teknik som är lätt att genomföra i de flesta laboratorier med allmänt tillgängliga reagenser. Denna modell är också mottaglig för kvantitativ analys av genuttryck genom RNA-sekvensering (RNA-SEQ) och proteiner med masspektrometri, immunohistokemi, eller Immunofluorescerande färgning2,4,8. Dessutom kan funktionell genetik studeras med hjälp av Gain-of-funktion (genöveruttryck eller uttryck för en aktiverande mutantgen) eller förlust-av-funktion (gen ljuddämpning eller uttryck för en förlust-av-funktion Mutant) närmar2.
Viktigt, låg verkningsgrad och hög toxicitet av standard plasmid DNA eller viral signaltransduktion protokoll med polybrene förbli ett stort hinder i området. Även om CRISPR/Cas9-tekniken möjliggör exakt genom redigering, kräver denna metod tidskrävande val följt av sekvensvalidering9. Här presenterar vi en viral signaltransduktion protokoll för primära intestinala organoider som optimerar leveransen av virala partiklar genom konjugering till magnetiska nanopartiklar och tillämpning av ett magnetfält. Viktiga ändringar av tidigare protokoll4,5,10,11,12,13 och rekommendationer för att öka effektiviteten tillhandahålls. Vi beskriver också en metod för att generera frysta sektioner från intakta organoider odlade i 3D-matrigel (hädanefter kallad basalmembran Matrix eller Matrix) för vidare analys med immunohistokemi eller Immunofluorescerande färgning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll godkändes av Johns Hopkins Medical institutioners djuromsorg och användning kommittén (IACUC). Detta protokoll har modifierats från tidigare publicerade metoder10,11,12,13.
1. beredning av reagenser
- Förbered färskt 293T-medium flera timmar i förväg och Värm till 37 ° c i ett vattenbad i minst 10 minuter före användning (tabell 1).
- Förbered plasmid DNA2,13,14 för viral förpackning. (Tabell 2).
- Inhämta alla andra material som krävs (tabell över material).
2. lentivirus eller retrovirus partikel produktion
- Human embryo njure (HEK) 293T cell seedning (Dag 1)
- Förbered 1 150 mm kultur skålen genom beläggning med 50 μg/mL Poly-D-lysin upplöst i fosfatbuffrad saltlösning (PBS; 10 mL/fat) för 1 h vid rumstemperatur (RT).
- Ta bort fosfatbuffrad saltlösning (PBS)/Poly-d-lysin och tvätta den belagda skålen två gånger med 5 mL PBS.
- Seed 293T-celler (8 \ u201210 x 106) i 293t-medium (tabell 1) till en total volym på 15 ml.
- Kultur 293T-celler över natten i en standard inkubator för vävnadsodling (37 ° c, 5% CO2).
- HEK 293T cell transfektion (dag 2)
- Utför transfektion när celler har uppnått 70-80% sammanflödet (vanligtvis cirka 24 h efter sådd 8 \ u201210 x 106 celler).
- Förbered transfektion blandning med ett effektivt tillvägagångssätt såsom en kommersiell katjoniska Liposom formulering (tabeller 1 \ u20122, tabell över material)2.
- Späd lentivirus DNA konstruktioner12 (totalt ~ 24 μg plasmid DNA, tabell 2) i 1,2 ml av transfektion medium och inkubera i 5 min vid RT i 1,5 ml rör (tabell över material).
- Späd transfektionregent (36 μL) i 1,2 mL transfektionsmedium (tabell över material) och inkubera i 5 ml-rör i 5 minuter enligt tillverkarens anvisningar.
- Tillsätt lentivirusreagenset (steg 2.2.2.1) till transfektionreagens (steg 2.2.2.2) och blanda försiktigt genom långsam pipettering upp och ned med 5 mL pipet.
- Inkubera blandningen i 20 minuter vid RT.
- Tvätta försiktigt 293T-celler med 5 mL transfektionsmedium och Ersätt med 10 mL transfektionsmedium.
- Tillsätt DNA-lipid komplex (från steg 2.2.2.3) droppvis till mediet 293t celler och noggrant blanda media i kulturen rätter genom att flytta i horisontella och vertikala riktningar för att säkerställa lika fördelning av DNA-lipid komplex i varje maträtt.
- Inkubera i 6 timmar i en standard inkubator för vävnadsodling (37 ° c, 5% CO2).
- Efter inkubering, Byt ut mediet med 20 mL färskt virus uppsamlings medium (tabell 1).
- Virus insamling (dagar 3 \ u20125)
- Samla in virusmedia i 50 mL rör, och förvara i en 4 ° c kylskåp för ytterligare koncentration.
- Ersätt 20 mL färskt virus uppsamlings medium varje 24 h och kultur över natten (~ 24 h). Upprepa medie insamlingen under de kommande 2 dagarna (dagar 4 \ u20125).
- Se till att den totala mängden medium som samlats in efter dag 5 är ~ 60 mL (20 mL/dag x 3 dagar).
- Virus koncentration (dag 5)
- Centrifugera de insamlade medierna (60 mL) i 5 minuter vid 400 x g. Sedan passera supernatanten genom ett filter (0,45 μm porer) för att ta bort alla cellulära skräp.
- Koncentrera viruset genom att tillsätta 15 mL filtrerat virus medium i en centrifugalfilterenhet (tabell över material). Centrifugera vid 2 500 x g i 15 min vid 4 ° c. Eftersom viruset inte kan passera genom detta filter, kommer det att koncentreras i den övre kammaren av filtret.
- Aspirera flödet genom röret (botten kammaren) och tillsätt ytterligare 15 mL återstående viral Collection Media supernatanten till samma centrifugalfilter enhet. Centrifugera enligt ovan (2 500 x g i 15 min vid 4 ° c) för att koncentrera ytterligare virus från supernatanten.
- Upprepa processen med samma filter för 60 ml-media från en enda sensorik platta tills önskad koncentration uppnås (~ 100-faldigt).
Anmärkning: vi koncentrerar vanligtvis ~ 60 mL av virus samling media till ~ 600 μL. - Avlägsna det koncentrerade viruset från den övre kammaren av filtret med hjälp av en 1 mL pipet, sedan alikvot och förvara i 1,5 mL rör (50 \ u201260 μL/rör) vid-80 ° c för senare användning. Förvara koncentrerade partiklar i upp till 6 \ u201212 månader.
3. isolerar kryptor
- Euthanize möss som använder CO2 enligt lokala IACUC riktlinjer.
- Placera det euthanized djuret på ryggen och tvätta buken genom att spraya med 70% etanol.
- Utför en längsgående mittlinjen snitt från bröstbenet till ljum, av huden först, och sedan subkutan vävnad.
- Ta bort tunntarmen från magen till blindtarmen.
- Identifiera områden av intresse inom tunntarmen; kryptor kan isoleras från tolvfingertarmen, jejunum och ileum.
- Använd en 10 mL spruta för att spola den isolerade tunntarmen med krypto dissociationbuffert (pre-kyld PBS innehållande 1 mM ditiothreitol (DTT), 1% penicillin/streptomycin (ingen ca2 + och mg2 +)) i en 10 cm vävnad kultur skålen (tabell 1)
- Ta bort perifer fettvävnad, och öppna eller "Filé" av Tarmvävnaden längsled på en steril glasplatta (15 cm x 15 cm).
- Försiktigt skrapa bort tarmen epitelial villi med hjälp av en cell skrapa.
- Skär tunntarmen i 2 \ u20123 cm längd-Wise sektioner.
- Överför vävnaden till ett 15 mL-rör som innehåller förkyld PBS med platttång (116 mm). Tvätta vävnads fragmenten genom att skaka kraftigt för hand för ~ 30 s (flytta röret i motsatt riktning ~ 60 gånger).
- Uppdatera PBS och upprepa tvätt tills PBS blir klar.
Anmärkning: Vi tvättar vanligtvis fragment 2 \ u20123 gånger. - Inkubera vävnaden i ett 15 mL koniskt rör som innehåller 10 mL krypto dissociationbuffert (tabell 1) i 10 min vid 4 ° c i orbitalskakor vid medelhög hastighet när PBS är klar.
- Skaka röret kraftigt för hand för ~ 30 s (motsatta riktningar ≈ 60 gånger) och överför vävnaden med hjälp av platta tång till ett annat 15 mL koniskt rör som innehåller 10 mL krypta dissociationbuffert. Inkubera denna fraktion på is. Använd inte den första fraktionen för Organoid kultur eftersom den innehåller främst villi.
- Upprepa steg 3.11 \ u 20123.13 för 3 \ u20124 gånger, samla varje fraktion och placera dem på is.
- Välj det bråk som är berikat med den högsta andelen intestinala kryptor genom att skanna 200 μL prover från varje fraktion under ett inverterat Mikroskop (4x). Identifiera kryptor med den typiska morfologin som beskrivits tidigare (figur 1a)10.
Anmärkning: De kommer att visas runda eller ovala i form och innehåller granulerade Paneth celler. Däremot är villi finger-liknande strukturer som saknar de granulat Paneth celler (figur 1b). - Passera den valda fraktionen genom en 40 μm cell sil för att få kryptor av liknande storlek om det behövs. Alternativt, isolera Lgr5 + stamceller baserade på flödescytometri för grönt fluorescerande protein (GFP) om möss passeras på EGFP-Lgr5 + bakgrund eller en annan lämplig modell som möjliggör identifiering av Lgr5 + celler2.
- Räkna det totala antalet kryptor i det valda fraktionen enligt följande.
- Pipettera 50 μL av den valda fraktionen till en hemocytometern och räkna antalet kryptor med ett inverterat ljusmikroskop (4x). Placera ~ 100 kryptor per brunn när du använder en 48-brunn plattan för att möjliggöra signaltransduktion experiment där 3 \ u20126 brunnar kommer att vara sensorik per försöks tillstånd för gentystning eller överuttryck.
- Baserat på antalet kryptor per 50 μL, beräkna volymen av crypt dissociation buffert behövs och överföra denna volym till en 1,5 mL tub.
Anmärkning: till exempel, 10 kryptor per 50 μL räknas, 6 x 50 μL eller 300 μL behövs för 300 kryptor.
- Centrifugera krypterna i 1,5-mL-rören vid 300 x g i 5 min.
- Kasta försiktigt supernatanten genom att försiktigt Pipettera av det övre vätskeskiktet och Omsuspendera pelleten i 100 μL tillväxtfaktor reducerad basalmembran matris på is (tabell över material).
- Utsäde Matrix-innehållande kryptor i en 37 ° c förvärmda 48-brunn tallrik (30 μL/brunn, ~ 100 kryptor/brunn). Inkubera plattan i en standard vävnadsodling inkubator för 5 \ u201215 min för att möjliggöra Matrix gelation (37 ° c, 5% CO2).
- Överlagra varje gel med 250 μL Organoid kultur (ENR) medium (tabell 1) och placera 48-brunnen plattorna tillbaka till en standard vävnadsodling inkubator (37 ° c, 5% Co2). Kontrollera kulturer för crypt organisation i små, runda, cystiska former efter 24 h; knoppar kommer att bildas efter 2 \ u20125 dagar.
- Byt försiktigt ut ENR Media var tredje dag. Ta bort gamla ENR-media med skonsam sugning och var försiktig så att du inte vidrör matrisen vid byte av media.
- Passage Organoid kulturer var 4 \ u20127 dagar som tidigare beskrivits11.
4. beredning av Organoid fragment
- Transduce organoider när de bildas (inom 1 \ u20122 veckor) eller efter att ha passaged. För en enda transduktion experiment, förbereda 2 \ u20123 brunnar av odlade organoider i en 48-brunn tallrik per skick med ~ 100 \ u2012200 organoider/brunn eller ~ 200 \ u2012600 organoider per experimentell signaltransduktion skick.
- Utbyte ENR med 250 μl signaltransduktion media (tabell 1) och kultur i transduktionmedia för 3 eller flera dagar eller tills organoider anta en cystisk morfologi. Inkludera både Wnt3a och ROCK inhibitor (Y27632) i transduktionmediet för att öka antalet stamceller och Paneth celler; Nikotinamid (NIC) förbättrar odlings effektiviteten (se transduktionmedlet i tabell 1).
- Mekaniskt bristning den kupolliknande källaren membran matris struktur med media och en Pipettera spets med en 1 ml Pipettera.
- Överför organoider och media till ett sterilt 1,5 mL-rör.
- Mekaniskt störa matrisen ytterligare genom att Pipettera med en 200 μL Pipettera ~ 10 \ u201215 gånger.
- Centrifugera Organoid fragment vid RT på 500 x g i 5 min.
- Kassera supernatanten försiktigt med en pipett och Omsuspendera pelleten i 1 mL DMEM/F12-medium (tabell 1).
- Tillsätt Dispase I (6 μL vid 10 mg/mL) och DNase I (2,5 μL vid 10 mg/mL). Blanda väl genom att Pipettera försiktigt med en 1 mL pipet.
- Inkubera organoider vid 37 ° c i 20 min i 1,5 mL-röret.
- Tillsätt 500 μL ENR-media för att avsluta dissociationreaktionen. serumet i ENR avslutar reaktionen.
- Passera Organoid cellerna genom en 20 μm cell sil och centrifugera Organoid fragment på 400 x g i 5 min.
- Omsuspendera Organoid fragment med 150 μL transduktionmedium (tabell 1).
5. genteknik av Organoider eller crypt celler genom viral transduktion
Anmärkning: Se figur 2.
- Utsäde Organoid cell kluster med 200 μl signaltransduktion medium/brunn i en 48-brunn tallrik och inkubera i en standard vävnadsodling inkubator (37 ° c, 5% Co2). Alternativt, placera nyligen isolerade crypt celler (~ 1 000 kryptor) i 200 μl signaltransduktion medium/brunn i en 48-väl tallrik och inkubera i en standard vävnadsodling inkubator (37 ° c, 5% Co2).
- Tina injektionsflaskor med virus för transduktion möjliggör ~ 50 μL koncentrerat virus för transduktion av varje brunn i 48-bra tallrikar eller ~ 100 μL av koncentrerat virus per brunn i 24-bra tallrikar.
- Inkubera viruset med 12 μL magnetisk nanopartikellösning i 15 minuter vid RT i en 1,5 mL tub (tabell 3).
- Tillsätt magnetisk nanopartikel lösning/virus blandning till cellerna som ska transduced.
- Placera cell odlingsplattan på en magnetisk platta och inkubera i minst 2 h (och upp till ~ 6 h) i en standard inkubator för vävnadsodling (37 ° c, 5% CO2).
6. sådd av infekterade Organoid fragment
- Överför de infekterade Organoid cell kluster och transduktionsmedia från varje brunn till en 1,5 mL tub.
- Centrifugera vid 500 x g i 5 min.
- Kassera supernatanten med skonsam sugning och kyl röret som innehåller pelleten på isen i 5 min.
- Tillsätt 120 μL basalmembran mat ris och Omsuspendera pelleten genom att Pipettera långsamt upp och ner.
- Utsäde 30 μL droppar av Matrix-cell blandningen i en ny 48-brunn tallrik.
- Inkubera plattan vid 37 ° c i 5 u201215 min tills matrisen stelnar.
- Lägg till transduktionmedium till varje brunn och inkubera i en standardinkubator för vävnadsodling i 3 \ u20124 dagar (37 ° c, 5% CO2).
- Efter 3 \ u20124 dagar, inspektera kulturer under ett ljusmikroskop (10X) för att säkerställa organisationen av cell kluster i Organoid strukturer. Byt sedan försiktigt ut transduktionsmediet med 250 μL ENR-medium.
- Ersätt Media var 3 \ u20124 dagar.
7. val (om tillämpligt)
- Efter 2 \ u20123 dagar, tillsätt relevanta antibiotika eller hormoner för val till transduktionmediet om det är lämpligt.
Anmärkning: Vi använde puromycin (2 μg/ml) för val av lentivrial transduktion eftersom plasmider haruttråkad en puromycin motstånds gen2,14.
8. bekräftelse av lyckad transduktion och genuttryck eller ljuddämpning
- Om du använder fugw lentivirus2,14, uppskatta transduktionseffektivitet genom att mäta GFP-signaler via fluorescerande Mikroskop eller flödescytometri.
- Validera genen överuttryck eller tysta med hjälp av kvantitativ omvänd transkriptase polymeras kedjereaktion (RT-PCR) för kvantitativ jämförelse av mRNA i kontroll och experimentell Organoid kulturer.
- Bekräfta proteinnivåer för protein-kodning genuttryck eller tysta av Western blot eller immunofärgning2.
9. Organoid Cryosection i basalmembran matris
Anmärkning: Se diagram 3.
- Ta bort ENR medium genom skonsam sugning, var noga med att inte stör källaren membran matris och tvätta försiktigt en gång med 500 μl av PBS.
- Fix organoider med 1,0 mL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) lösning (tabell över material) vid RT i 30 min.
- Ta bort PFA genom sug och tvätta försiktigt två gånger med 1 mL PBS.
- Ta bort PBS med sug och tillsätt 1,0 mL 30% sackaros buffert till varje prov. Inkubera fasta organoider i sackaros under 1 h vid 4 ° c i kylrum, kylskåp eller på is för att torka proverna.
- Ta bort sackaros buffert genom sug och tillsätt bara tillräckligt inbäddning förening (tabell över material) för att täcka matrisen lagret (~ 300 μl/brunn) i varje brunn.
- Inkubera vid RT i 5 minuter.
- Placera proverna i en-80 ° c frys i 10 min, eller tills den inbäddade föreningen blir solid och vit.
- Placera skålen med fryst bädda förening vid RT för att möjliggöra minimal smältning av föreningen längs kanterna. Använd en skalpell för att separera blocket från väggarna i brunnen.
- Ta bort Matrix-inbäddning sammansatta blocket med tång och placera den i ett preparat block (t. ex. cryomold), arbetar snabbt för att förhindra smältning.
- Fyll mögel helt med inbäddning förening och frysa vid-80 ° c för 30 min.
- Använd blocket för snittning eller förvaring i-80 ° c frys för vidare användning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här beskriver vi en snabb och mycket effektiv transduktionsteknik som utnyttjar magnetiska nanopartiklar som utsätts för ett magnetfält för att leverera lentivirus till celler av intresse. Med lättillgängliga verktyg har vi tillämpat denna metod inte bara för att transduce nyligen isolerade crypt celler (figur 1a), men också för organoider (figur 2) och andra celler som är refraktära till mer rutinmässig transduktion metoder. Lentivirala partiklar kan lätt konjugeras till magnetiska nanopartiklar och den resulterande virus-nanopartikel komplex levereras effektivt genom att använda ett magnetfält med hjälp av en magnetisk platta. För att optimera denna metod, testade vi först lentivirala vektorer kopplade till GFP så att GFP kunde användas för att identifiera sensorik celler med fluorescens mikroskopi. Den GFP kan visualiseras i varje skede i Organoid utveckling, inklusive tidigt när crypt celler organisera i cysta-liknande strukturer (figur 4a), eller vid senare tidpunkter när organoider form knoppar (figur 4b). Framgångsrikt omvandlas intestinal organoider kan sedan genomgå funktionell analys för förändringar i utvecklingen genom färgning cellmembran och kärnor för att räkna upp totalt antal celler förutom härstamning markörer, såsom lysozym att identifiera Paneth celler ( Figur 4C).
De genetiskt modifierade organoiderna kan användas för ytterligare analys genom att skapa frysta sektioner som beskrivs här (figur 3). Efter inbädda organoider, frysta block kan lagras och senare sektioneras för framtida studier. Detta tillvägagångssätt är också effektivt (beräknas vara ~ 95% baserat på procent av GFP (+) organoider till totala organoider). Denna metod kan utföras med standard laboratoriereagens, vilket ger vävnader som är mottagliga för olika undersökningar, inklusive cell nummer, cell öde, och förekomst och nivåer av specifika proteiner2. Till exempel använde vi frysta sektioner och Immunofluorescerande färgning för att identifiera enskilda celler och kontrollera celltyp (figur 4c).
Figur 1: isolerade kryptor och villi med tecknade serier som visar typisk morfologi. (A) isolerade kryptor bildar runda eller ovala strukturer. B) villi identifieras som Fingerliknande strukturer. Scale bar = 50 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Schematisk viral transduktion av organoider med magnetiska nanopartiklar och exponering för ett magnetfält. De mest kritiska stegen i transduktionprotokollet visas. (A) Inkubera virus och magnetisk nanopartikel lösning i 15 min vid RT i en 1,5 ml tub. (B) tillsätt den magnetiska nanopartiklar/virus blandningen till de celler som ska transdukeras. Cplacera cell odlingsplattan på magnet plattan och inkubera i 2 timmar i en standard inkubator för vävnadsodling. Längre inkubationstider kan också användas (~ 6 h); den representativa brunnen visas här på magnet plattan. Den cell som har omvandlas till viruset och den magnetiska nanopartikeln visas. (E) överföra de infekterade Organoid cell kluster och transduktion media från varje brunn i en 1,5 ml rör och centrifugera vid 500 x g i 5 min. Kassera supernatanten med skonsam sugning och kyl röret som innehåller pelleten på isen i 5 min. (F) tillsätt 120 μL basalmembran mat ris och Omsuspendera pelleten genom att Pipettera långsamt upp och ner. (G) utsäde droppar av 30 μl som innehåller Matrix-cell blandning i varje brunn i en ny 48-brunn tallrik. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Schematisk av fryst snittning av organoider i 3D Matrix. De mest kritiska stegen i det frusna snittnings protokollet visas. Aen enkel brunn inom en 24-och cell odlings platta avbildas. (B) tillsätt precis tillräckligt inbäddnings substans för att täcka mat ris skiktet (~ 300 μl/brunn) och inkubera vid RT i 5 min. (C) placera proverna på-80 C i en frys i 10 min eller tills den inbäddade föreningen blir solid och vit. Därefter placerar du skålen på RT för att möjliggöra lätt smältning längs kanterna av provet. (D) Använd en skalpell att separera blocket från väggarna i brunnen. (E) ta bort sammansatt block Matrix-inbäddning med hjälp av tång och placera i en lämplig grund behållare eller mögel för att frysa vävnader. Fyll formen helt med inbäddning förening (OCT). (F) frys block vid-80 C i frys i 30 min. (G) blocket är redo för snittning eller förvaring i-80 C frys för vidare användning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativa bilder av sensorik intestinala organoider. (A) representativ bild av små intestinala organoider under ljusmikroskop som visar (vänster) fluorescens-mikroskopi, och (höger) standardmikroskopi av transgenexpression (egfp) vid dag 3 efter transduktion. Skalstapel = 50 μm. (B) exempel på överuttryck av gen kodning GFP i Organoid efter transduktion med hjälp av magnetiska nanopartiklar. Organoid celler var sensorik med lentivirus uttrycker GFP (fugw; Top) eller lentivirus överuttrycker Hmga1 (fugw-Hmga1; Botten) som visas på dag 12 efter transduktion. Skalstapel = 50 μm.C) immunofluorescensteknik av formalin fast fryst del av organoider. Organoid sektioner (4 μm) färgas med anti-lysozym (röd), anti-EpCAM (grön) och DAPI (blå). EpCAM avgräntar cellkanter, DAPI indikerade enskilda kärnor, och lysozym fläckar Paneth celler. Scale bar = 50 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Organoid odlingssubstrat (ENR) | 100 mL |
| DMEM/F12 + | 96 mL |
| L-alanyl-L-glutamin dipeptid tillägg (t. ex. Glutamax) | 1 mL |
| NEAA | 1 mL |
| Penna/STREP | 1 mL |
| HEPES | 1 mL |
| EGF (100 μg/mL) | 5 μL |
| Noggin (100 μg/mL) | 10 μL |
| R-spondin (100 μg/mL) | 10 μL |
| eller R-spondin villkora medlet (CM) | 20 mL |
| Rekombinant humant insulin (10 mg/mL) | 5 μL |
| Transduktionsmedium | 5 mL |
| ENR medium | 2,4 mL |
| WNT skick medium (CM) | 2,5 mL |
| Nikotinamid (1M) | 100 μL |
| Y27632 (10 μM) | 10 μL |
| Crypts dissociation buffert | 100 mL |
| PBS (utan ca2 +, mg2 +) | 99 mL |
| Penna/STREP | 1 mL |
| 0,5 M EDTA | 100 μL |
| 0,1 M DTT (ditiothreitol) | 100 μL |
| 293T medium | 100 mL |
| DMEM | 90 mL |
| Fbs | 10 mL |
| Virus samling medium | 100 mL |
| DMEM | 99 mL |
| Fbs | 1 mL |
| Organoid rötnings buffert | 1 mL |
| DMEM/F12 + | 1 mL |
| Dispase I (10 mg/mL) | 6 μL |
| DNase I (10 mg/mL) | 2,5 μL |
Tabell 1: medier som används i protokollet.
| Plattor | 10 cm | 15 cm |
| Lentivirus transducing vektor | 6 μg | 9 μg |
| CMVΔR 8.91 | 8 μg | 12 μg |
| Md. G | 2 μg | 3 μg |
| Totala vektorer | ≤ 16 μg | ≤ 24 μg |
Tabell 2: mängd plasmid-DNA för transfektion.
| Plattan | Magnetiska pärlor (μL) | Volym av virus (μL) | Slutlig Transduktionvolym (μL) |
| 48-Tja | 6 | 50 | 250 |
| 24-well | 12 | 100 | 500 |
Tabell 3: volym av magnetisk pärllösning och vektor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Primär kultur av vuxna intestinal epitel som organoider ger ett kraftfullt verktyg för att studera molekylära mekanismer som är involverade i stamcells funktion, intestinal epitelial homeostas, och patologi1,2,3, 4. Även om CRISPR/Cas9 teknik kan användas för att genetiskt iscensätta organoider9, är det begränsat av behovet av omfattande screening och urval baserat på sekvensanalys för de önskade genetiska förändringarna. Målet med detta protokoll är att ge tydliga och koncisa instruktioner med video-baserade tutorials för magnetisk nanopartikel leverans av lenti-eller retrovirus till intestinala organoider, följt av frysta snittning för vidare analys.
Detta protokoll är en snabb och effektiv metod för att genetiskt iscensätta intestinala organoider och analysera konsekvenserna av genöveruttryck eller tysta från frysta sektioner. Kritiska steg beskrivs i figur 2, figur 3. Denna strategi möjliggör utredning av den biologiska betydelsen av genetiska förändringar (överuttryck eller ljuddämpning) i tarm stamceller och deras avkomma odlade under 3D-villkor2,13. Vi har också använt denna magnetiska nanopartikel-baserade leverans av virala vektorer för att förbättra celltransduktion och transgenens uttryck in vitro i olika primära celler2,13.
Med detta tillvägagångssätt, är virala partiklar belagda med magnetiska nanopartiklar och levereras till celler genom exponering för ett magnetfält. Jämfört med aktuella transduktionmetoder, såsom polybrene med eller utan spinokulation10,15, är magnetiska nanopartikel-virala komplex mindre giftiga för celler eftersom upptaget av det genetiska materialet förmedlas genom endocytos och pinocytosis, två naturligt förekommande biologiska processer som inte inducerar betydande skador på cellmembran. Således förstärks både cellernas lönsamhet och transduktionseffektiviteten. Transduktionseffektiviteten kan ökas ytterligare med hjälp av små krypfragment eller enstaka celler (se steg 4,8) istället för större kryptor eller hela organoider som tidigare rapporterats2,10,13,16. Magnetiskt styrd nanopartikel leverans resulterar i snabb ackumulering, penetration, och upptag av virala vektorer i målceller2,13. De magnetiska nanopartiklarna är gjorda av järnoxid, som är helt biologiskt nedbrytbar och belagd med specifika egenutvecklade katjoniska molekyler. Nanopartikel Association med virala vektorer uppnås genom salt-inducerad kolloidal aggregation och elektrostatiska interaktioner. Nanopartiklarna koncentreras sedan till celler av ett externt magnetfält som genereras av magnet plattan som placeras under kultur skålen. Medan signaltransduktion effektivitet närmar sig 95%, inte alla celler är transduced, vilket är en begränsning till denna teknik. I tillägg, endogent uttryckta gener av intresserar ändras inte som med CRISPR/Cas9 tillvägagångssätt.
Efter gen överuttryck eller ljuddämpning kan organoider användas för en myriad av studier, beroende på de vetenskapliga målen, inklusive analys av genuttryck, proteomiska förändringar i celler eller utsöndras av celler, metaboliska förändringar och morfologiska förändringar. Som med levande vävnader, frysta sektioner kan erhållas för immunohistokemiska och immunofluorescensstudier av specifika proteiner såsom transkriptionsfaktorer, cytoplasmiska molekyler, eller cell ytan markörer. Vår artikel innehåller ett effektivt sätt att få frysta sektioner från organoider utan att störa deras ställning och organisation i 3D-kulturen. Detta är fördelaktigt eftersom tidigare tekniker kräver avlägsnande av Organoid från basalmembran matris innan frysning16. Bearbetning av organoider genom avlägsnande från matrisen kan störa den strukturella organisationen av Organoid snarare än återspegla in vitro-tillväxt och utveckling.
Detta protokoll till genetiskt iscensätta intestinala organoider kan också anpassas för att studera andra cellbaserade modeller och Organoid system. Till exempel, bukspottskörteln, kolon, lever, kardiell, och cerebral Organoid system kan vara sensorik med denna metod. Även celler som växer under mer vanliga kultur tekniker är mottagliga för nanopartikel-teknik. Dessutom kan denna metod tillämpas för att studera de molekylära mekanismerna för sjukdomar, inte bara i samband med stamceller härledda Organoid system, men också i tumör organoider.
Sammanfattningsvis kommer de viktigaste modifikationerna som beskrivs i dessa protokoll för intestinala Organoid-studier att ge forskarna möjlighet att belysa betydelsen av viktiga faktorer och nedströmsvägar som är involverade i tarmstamcellernas biologi och deras avkomma . Dessa metoder bör ge möjlighet att lära sig mer om molekylära mekanismer bakom självförnyelse, cell ödet bestämning, vävnad homeostas, och intestinal epitelial förnyelse, under både fysiologisk och patologiska tillstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från National Institute of Health (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), Maryland stamcells forskningsfond (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), American lung Association, den Allegheny Health Network-Johns Hopkins forskningsfond och Hopkins matsmältningsorganen grundforskning kärna centrum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Base medium for 293T cells |
| DMEM/F12+ | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer |
| OPTI-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Virus plasmids transfection medium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | Component of virus collection medium and 293T medium |
| Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer |
| PBS (without Ca2+, Mg2+) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | A wash buffer and component of crypt dissociation buffer |
| Mem-NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Component of organoid culture medium |
| GlutamaxII | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Component of organoid culture medium |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Component of organoid culture medium |
| EGF | Millipore Sigma | E9644 | Component of organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 250-38 B | Component of organoid culture medium |
| R-spondin | R&D | 7150-RS-025/CF | Component of organoid culture medium |
| Human recombinant insulin | Millipore Sigma | I9278-5ml | Component of organoid culture medium |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N3376-100G | Component of Transduction medium |
| Wnt3A | R&D | 5036-WN-010 | Component of Transduction medium |
| Y27632 | Millipore Sigma | Y0503-1MG | Component of Transduction medium |
| 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Component of Crypts dissociation buffer |
| DTT (dithiothreitol) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | Component of Crypts dissociation buffer |
| Dispase I | Millipore Sigma | D4818-2MG | Component of organoid digestion buffer |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Component of organoid digestion buffer |
| matrigel(Growth factor reduced) | Corning | 356231 | Used as a matrix to embed organoids |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Medium for transfection in viral production |
| ViralMag R/L | Oz Biosiences | RL40200 | Magnetic particles of viral transduction |
| Magnetic plate | Oz Biosiences | MF10000 | Magnetic plate to facilitate viral transduction |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Transfection agent in viral production |
| Poly-D-Lysine | Millipore Sigma | A-003-E | Coating for plates before seeding 293T cells |
| 4% Formaldehyde Solution | Boster | AR1068 | Solution to fix organoids |
| O.C.T embedding compound | Thermo Fisher Scientific | 4583S | For embedding of the the organoids |
| 5 mL Falcon polystyrene tubes | Corning | 352054 | |
| 50 mL Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.100 | |
| Orbitron rotator II Rocker Shaker | Boekel Scientific | 260250 | |
| Olympus Inverted microscop CK30 | Olympus | CK30 | for scanning and counting crypts |
| Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence | Nikon | Axiovert 200 | for viewing fluorescence in the crypts |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane | Milipore Sigma | UFC910024 | For concentrating viruses |
| pluriStrainer 20 µm (Cell Strainer) | pluriSelect | SKU 43-50020 | For preparing organoid fragments |
| Falcon Cell Strainer | Fisher Scientific | 352340 | For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid) | Millipore Sigma | M8937-100EA | ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments |
| Animal strain: C57BL/6J | Jackson Lab | #000664 | For organoid culture |
References
- Cheung, E. C., et al. TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis. Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).
- Xian, L., et al. HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche. Nature Comm. , (2017).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).
- Kabiri, Z., et al. Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts. Development. 141, 2206-2215 (2014).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. J Vis Exp. (120), (2017).
- Muñoz, J., et al. The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent '+4' cellmarkers. EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).
- Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture. J Vis Exp. (90), e51765 (2014).
- Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).
- Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells. Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Tesfaye, A., et al. The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis. Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).
- Haim, H., et al. Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus. J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).
- Xue, X., Shah, Y. M. In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors. J Vis Exp. (75), e50210 (2013).
