Summary
Vi beskriver trinnvise instruksjoner til: 1) effektivt ingeniør intestinal organoids ved hjelp av magnetiske nanopartikler for Lenti-eller retroviral Transduction, og, 2) generere frosne seksjoner fra konstruert organoids. Denne tilnærmingen gir et kraftig verktøy for å effektivt endre genuttrykk i organoids for etterforskning av nedstrøms effekter.
Abstract
Intestinal organoid kulturer gir en unik mulighet til å undersøke intestinal stilk cellen og krypten biologi in vitro, men effektive tilnærminger til å manipulere genuttrykk i organoids har gjort begrenset fremgang i denne arenaen. Mens CRISPR/Cas9 teknologi gjør det mulig for presis Genova redigering av celler for organoid generasjon, denne strategien krever omfattende utvalg og screening av sekvens analyse, som er både tidkrevende og kostbart. Her gir vi en detaljert protokoll for effektiv viral Transduction av intestinal organoids. Denne tilnærmingen er rask og svært effektiv, og dermed redusere tid og kostnader iboende i CRISPR/Cas9 teknologi. Vi presenterer også en protokoll for å generere frosne seksjoner fra intakte organoid kulturer for videre analyse med immunhistokjemiske eller immunofluorescent farging, som kan brukes til å bekrefte genuttrykk eller stanse. Etter vellykket Transduction av viral vektorer for genuttrykk eller deaktivering er oppnådd, intestinal stilk cellen og krypten funksjonen kan raskt vurderes. Selv om de fleste organoid studiene benytter in vitro-analyser, kan organoids også leveres til mus for in vivo funksjonell analyse. Videre er våre tilnærminger fordelaktig for å forutsi terapeutiske reaksjoner på narkotika fordi tiden tilgjengelig behandling generelt funksjon av modulerende genuttrykk eller protein funksjon snarere enn å endre det Genova.
Introduction
Evnen å kulturen musen eller Human Krypter celler idet tredimensjonal (3D) organoids fra det liten tarmen eller kolon over lengre tid perioder forsynt en større gjennombruddet fordi disse kulturen utfoldelse definerende vise egenskaper av intestinal epitel inne vivo 1 den andre , 2 andre priser , 3. Organoids avledet fra primære Krypter er i stand til selv-fornyelse og selv-organisasjon, viser cellulære funksjoner som ligner på deres vev opprinnelse. Faktisk, organoids recapitulate ikke bare den strukturelle organiseringen av Krypter in vivo, men også mange molekylære funksjoner, og dermed gi nyttige verktøy for å studere normal biologi og sykdom tilstander. For å illustrere, har organoid studier avdekket romanen molekylære trasé involvert i vev gjenfødelse1,2,3,4,5 samt medikamenter som kan forbedre funksjon i patologisk innstillinger6,7.
Studiet av tarm stamceller er av spesiell interesse fordi intestinal fôr er blant de mest regenererende pattedyr vev, fornye seg hver 3-5 dager for å beskytte organismen fra bakterier, toksiner og andre patogener i tarm lumen. Intestinal stamceller (ISCs) er ansvarlig for denne bemerkelsesverdige regenererende evne og dermed gi et unikt paradigme for å studere voksen stilk cellen funksjon1,2. Lineage-tracing eksperimenter i mus demonstrerte at isolerte Lgr5-positive stamceller kan bli kultivert å generere 3D-organoids eller "mini-guts" in vitro der de tett speile sine in vivo kolleger. Organoid kulturer kan også være avledet fra intestinal krypten celle isolerer består av forfedre, ISCs, og Paneth celler, sistnevnte som utgjør epitel nisje celler i vivo. Faktisk har organoid kultur fra primære intestinal krypten celler utviklet seg til en relativt rutinemessig teknikk som er lett å implementere i de fleste laboratorier ved hjelp av allment tilgjengelige reagenser. Denne modellen er også mottagelig for kvantitativ analyse av genuttrykk av RNA-sekvensering (RNA-SEQ) og proteiner av masse massespektrometri, immunhistokjemi, eller immunofluorescent farging2,4,8. I tillegg kan funksjonell genetikk bli studert ved hjelp av gevinst-av-funksjon (Gen overuttrykte eller uttrykk for et aktiverings mutant gen) eller taps-av-funksjon (Gen-deaktivering eller uttrykk for en tap-of-Function-mutant) tilnærminger2.
Viktigere, lav effektivitet og høy toksisitet av standard plasmider DNA eller viral Transduction protokoller med polybrene fortsatt et stort hinder i feltet. Selv om CRISPR/Cas9-teknologien gjør det mulig for presise Genova redigering, krever denne tilnærmingen tidkrevende valg etterfulgt av sekvens validering9. Her presenterer vi en viral Transduction protokoll for primære intestinal organoids som optimaliserer levering av virale partikler ved Bøyning til magnetiske nanopartikler og anvendelse av et magnetisk felt. Viktige endringer i tidligere protokoller4,5,10,11,12,13 og anbefalinger for å forbedre effektiviteten er gitt. Vi beskriver også en tilnærming for å generere frosne seksjoner fra intakt organoids kultivert i 3D-matrigel (heretter referert til som kjeller membran matrise eller matrise) for videre analyse med immunhistokjemi eller immunofluorescent farging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen ble godkjent av Johns Hopkins Medical institusjoner Animal Care og use Committee (IACUC). Denne protokollen er endret fra en tidligere publiserte metoder10,11,12,13.
1. utarbeidelse av reagenser
- Forbered frisk 293T mellom flere timer på forhånd og varm til 37 ° c i et vannbad i minst 10 minutter før bruk (tabell 1).
- Forbered plasmider DNA2,13,14 for viral emballasje. (Tabell 2).
- Anskaffe alle andre nødvendige materialer (tabell av materialer).
2. lentivirus eller retrovirus partikkel produksjon
- Human embryo nyre (HEK) 293T celle seeding (Dag 1)
- Forbered 1 150 mm kultur rett ved belegg med 50 μg/mL Poly-D-lysin oppløst i fosfat bufret saltvann (PBS; 10 mL/parabol) for 1 time ved romtemperatur (RT).
- Fjern fosfat bufret saltvann (PBS)/poly-D-lysine og vask belagt parabolen to ganger med 5 mL PBS.
- Seed 293T celler (8 \ u201210 x 106) i 293T medium (tabell 1) til et total volum på 15 ml.
- Kultur 293T celler over natten i en standard vev kultur inkubator (37 ° c, 5% CO2).
- HEK 293T celle transfeksjoner (dag 2)
- Utfør transfeksjoner når cellene har nådd 70-80% samløpet (vanligvis om 24 h etter seeding 8 \ u201210 x 106 celler).
- Forbered transfeksjoner blanding ved hjelp av en effektiv tilnærming, for eksempel en kommersiell kationiske liposome formulering (tabell1 \ u20122, materialfortegnelsen)2.
- Fortynne lentivirus DNA-konstruksjoner12 (totalt ~ 24 ΜG plasmider DNA, tabell 2) i 1,2 ml transfeksjoner medium og ruge i 5 min ved RT i 1,5 ml rør (tabell med materialer).
- Fortynne transfeksjoner Regent (36 μL) i 1,2 mL transfeksjoner medium (tabell av materialer) og ruge i 5-ml rør i 5 min i henhold til produsentens instruksjoner.
- Legg den lentivirus reagens (trinn 2.2.2.1) til transfeksjoner reagens (trinn 2.2.2.2) og bland forsiktig ved langsom pipettering opp og ned ved hjelp av en 5 mL Pipet.
- Ruge blandingen i 20 min ved RT.
- Vask forsiktig 293T celler med 5 mL transfeksjoner medium og Erstatt med 10 mL transfeksjoner medium.
- Tilsett DNA-lipid komplekser (fra trinn 2.2.2.3) dråpevis til mediet 293T celler og nøye blande Media i kulturen retter ved å flytte i horisontal og vertikal retninger for å sikre lik fordeling av DNA-lipid komplekser i hver tallerken.
- Ruge for 6 timer i en standard vevs kultur inkubator (37 ° c, 5% CO2).
- Etter inkubasjons, Bytt ut mediet med 20 mL fersk virus samle medium (tabell 1).
- Virus samling (dager 3 \ u20125)
- Samle virus medier i 50 mL rør, og oppbevar i et kjøleskap på 4 ° c for ytterligere konsentrasjon.
- Erstatt 20 mL fersk virus samle medium hver 24 h og kultur over natten (~ 24 h). Gjenta mediesamlingen i løpet av de neste to dagene (dager 4 \ u20125).
- Kontroller at det totale volumet av medium innsamlet etter dag 5 er ~ 60 mL (20 mL/dag x 3 dager).
- Virus konsentrasjon (dag 5)
- Sentrifuger de innsamlede mediene (60 mL) i 5 min ved 400 x g. Deretter passerer supernatanten gjennom et filter (0,45 μm porer) for å fjerne eventuelle cellulære rusk.
- Konsentrer viruset ved å legge 15 mL av filtrert virus Media i en sentrifugal Filterenhet (tabell av materialer). Sentrifuger ved 2 500 x g for 15 min ved 4 ° c. Fordi viruset ikke kan passere gjennom dette filteret, vil det være konsentrert i øvre kammeret av filteret.
- Aspirer fra røret (nederst kammer) og tilsett ytterligere 15 mL gjenværende viral samling Media supernatanten til samme sentrifugal Filterenhet. Sentrifuger som ovenfor (2 500 x g i 15 min ved 4 ° c) for å konsentrere ytterligere virus fra supernatanten.
- Gjenta prosessen med det samme filteret for 60 mL medium fra en enkelt transduced plate til den ønskede konsentrasjonen er nådd (~ 100-fold).
Merk: vi konsentrerer vanligvis ~ 60 mL virus innsamlings medier til ~ 600 μL. - Fjern det konsentrerte viruset fra øvre kammer av filteret ved hjelp av en 1 mL Pipet, deretter alikvot og oppbevar i 1,5 mL rør (50 \ u201260 μL/tube) ved-80 ° c for senere bruk. Oppbevar konsentrerte partikler i opptil 6 \ u201212 måneder.
3. isolere Krypter
- Euthanize mus bruker CO2 i henhold til lokale IACUC retningslinjer.
- Plasser euthanized dyret på ryggen og vask magen ved sprøyting med 70% etanol.
- Utfør en langsgående midtlinjen snitt fra brystbenet til lysken, incising huden først, og deretter under Huds vevet.
- Fjern tynntarmen fra magen til cecum.
- Identifiser områder av interesse i tynntarmen; Krypter kan isoleres fra tolvfingertarmen, jejunum og ileum.
- Ved hjelp av en 10 mL sprøyte, skyll den isolerte tynntarmen med krypten dissosiasjon buffer (pre-kjølt PBS inneholder 1 mM dithiotreitol (DTT), 1% penicillin/Streptomycin (ingen ca2 + og mg2 +)) i en 10 cm vev kultur parabolen (tabell 1en)
- Fjern perifere fettvev, og åpne eller "filet" tarm vevet lengderetningen på en steril glassplate (15 cm x 15 cm).
- Skrape forsiktig av intestinal epitel Villi ved hjelp av en celle skraper.
- Skjær tynntarmen i 2 \ u20123 cm lengde-klok seksjoner.
- Overfør vevet til en 15 mL rør som inneholder pre-kjølt PBS bruker flat tang (116 mm). Vask vevet fragmenter ved risting kraftig for hånd for ~ 30 s (flytte røret i motsatt retning ~ 60 ganger).
- Oppdater PBS og gjenta vask til PBS blir klar.
Merk: vi vasker vanligvis fragmentene 2 \ u20123 ganger. - Ruge vevet i et 15 mL konisk rør som inneholder 10 mL av krypten dissosiasjon buffer (tabell 1) i 10 min ved 4 ° c på en orbital shaker på middels hastighet når PBS er klar.
- Kraftig riste røret for hånd for ~ 30 s (motsatte retninger ≈ 60 ganger) og overføre vevet ved hjelp av flat tang til en annen 15 mL konisk rør som inneholder 10 mL av krypten dissosiasjon buffer. Ruge denne fraksjonen på is. Ikke bruk den første fraksjonen for organoid kultur fordi den inneholder hovedsakelig Villi.
- Gjenta trinn 3.11 \ u 20123.13 for 3 \ u20124 ganger, samle hver brøk og plassere dem på isen.
- Velg Brøkdelen som er beriket med den høyeste prosentandelen av intestinal Krypter ved å skanne 200 μL prøver fra hver brøk under et invertert mikroskop (4X). Identifiser Krypter ved den typiske morfologi som tidligere beskrevet (figur 1a)10.
Merk: De vil vises rund eller oval i form og inneholder kornete Paneth celler. I kontrast, Villi er finger-lignende strukturer mangler kornet Paneth cellene (figur 1B). - Passere den valgte fraksjonen gjennom en 40 μm celle sil for å oppnå Krypter av tilsvarende størrelse hvis nødvendig. Alternativt kan du isolere Lgr5 + stamceller basert på strømnings flowcytometri for grønt fluorescerende protein (GFP) hvis mus krysses på EGFP-Lgr5 + bakgrunnen eller en annen passende modell som muliggjør identifisering av Lgr5 + celler2.
- Tell det totale antallet Krypter i den valgte fraksjonen som følger.
- Pipetter 50 μL av den valgte fraksjonen i en hemocytometer og Tell antall Krypter ved hjelp av et omvendt lys mikroskop (4X). Plasser ~ 100 Krypter per brønn når du bruker en 48-brønn plate for å muliggjøre Transduction eksperimenter der 3 \ u20126 brønner vil bli transduced per eksperimentell tilstand for gen-deaktivering eller overuttrykte.
- Basert på antall Krypter per 50 μL, beregne volumet av krypten dissosiasjon buffer nødvendig og overføre det volumet til en 1,5 mL tube.
Merk: for eksempel vil 10 Krypter per 50 μL telles, 6 x 50 μL eller 300 μL er nødvendig for 300 Krypter.
- Sentrifuger Krypter i 1,5-mL rør ved 300 x g i 5 min.
- Kast forsiktig supernatanten ved å forsiktig pipettering av det øvre flytende laget og resuspend pellet i 100 av vekst faktoren redusert kjeller membran matrise på is (tabell over materialer).
- Seed matrisen inneholder Krypter i en 37 ° c forvarmet 48-brønn plate (30 μL/brønn, ~ 100 Krypter/brønn). Ruge platen i en standard vev kultur inkubator for 5 \ u201215 min å tillate for matrise gelation (37 ° c, 5% CO2).
- Overlapp hver gel med 250 μL organoid kultur (ENR) medium (tabell 1) og plasser 48-brønn platene tilbake i en standard vevs kultur inkubator (37 ° c, 5% co2). Sjekk kulturer for krypten organisasjonen i små, runde, cystisk figurer etter 24 h; knopper vil danne etter 2 \ u20125 dager.
- Forsiktig erstatte ENR Media hver 3 dager. Fjern gamle ENR medier med milde sug, ta vare ikke røre matrisen når du skifter Media.
- Passage organoid kulturer hver 4 \ u20127 dager som tidligere beskrevet11.
4. forberedelse av Organoid fragment
- Overfører organoids når de danner (innen 1 \ u20122 uker) eller etter å ha blitt passert. For et enkelt Transduction eksperiment, forberede 2 \ u20123 brønner av kultivert organoids i en 48-brønn plate per tilstand med ~ 100 \ u2012200 organoids/brønn eller ~ 200 \ u2012600 organoids per eksperimentell Transduction tilstand.
- Exchange ENR med 250 μL Transduction Media (tabell 1) og kultur i Transduction Media for 3 eller flere dager eller til organoids vedta en cystisk morfologi. Inkluder både Wnt3a og ROCK inhibitor (Y27632) i Transduction medium for å øke antall Stem og Paneth celler; Nikotinamid (NIC) forbedrer kultur effektiviteten (se Transduction medium i tabell 1).
- Mekanisk brudd på dome-lignende kjeller membran matrise struktur med Media og en Pipet spissen ved hjelp av en 1 mL Pipet.
- Overfør organoids og mediene til et sterilt 1,5 mL rør.
- Mekanisk forstyrre matrisen ytterligere ved pipettering med en 200 μL Pipet ~ 10 \ u201215 ganger.
- Sentrifuger organoid fragmenter på RT på 500 x g i 5 min.
- Kast supernatanten forsiktig med en pipette og resuspend pellet i 1 mL DMEM/F12 medium (tabell 1).
- Tilsett Dispase I (6 μL ved 10 mg/mL) og DNase I (2,5 μL ved 10 mg/mL). Bland godt ved å pipettering forsiktig ved hjelp av en 1 mL Pipet.
- Ruge organoids ved 37 ° c i 20 min i 1,5 mL røret.
- Tilsett 500 μL av ENR-medier for å avslutte dissosiasjon reaksjonen; serum i ENR opphører reaksjonen.
- Pass de organoid cellene gjennom 20 μm celle sil og sentrifuger organoid fragmenter på 400 x g i 5 min.
- Resuspend organoid fragmenter med 150 μL Transduction medium (tabell 1).
5. genetisk engineering av Organoids eller Crypt Cells av viral Transduction
Merk: Se figur 2.
- Frø organoid celle klynger med 200 μL Transduction medium/brønn i en 48-brønn plate og ruge i en standard vevs kultur inkubator (37 ° c, 5% CO2). Alternativt kan du plassere fersk isolerte Crypt celler (~ 1 000 Krypter) i 200 μL Transduction medium/brønn i en 48-brønn plate og ruge i en standard vevs kultur inkubator (37 ° c, 5% CO2).
- Tin hetteglass med virus for Transduction som muliggjør ~ 50 μL av konsentrert virus for Transduction av hver brønn i 48-brønn plater eller ~ 100 μL av konsentrert virus per brønn i 24-brønn plater.
- Ruge virus med 12 μL magnetisk nanopartikkel oppløsning i 15 minutter ved RT i et 1,5 mL rør (tabell 3).
- Tilsett magnetisk nanopartikkel løsning/virus blandingen til cellene som skal transduced.
- Plasser cellekultur platen på en magnetisk plate og ruge i minst 2 timer (og opptil ~ 6 t) i en standard vevs kultur inkubator (37 ° c, 5% CO2).
6. seeding av infiserte Organoid fragmenter
- Overfør de infiserte organoid celle klynger og Transduction medier fra hver brønn til en 1,5 mL tube.
- Sentrifuger på 500 x g i 5 min.
- Kast supernatanten med skånsom sug og Avkjøl røret som inneholder pellet på isen i 5 min.
- Tilsett 120 μL av matrise med kjeller membran og resuspend pellet ved å pipettering langsomt opp og ned.
- Seed 30 μL dråper av matrisen celle blandingen inn i en ny 48-brønn plate.
- Ruge platen ved 37 ° c i 5 \ u201215 min til matrisen stivner.
- Legg Transduction medium til hver brønn og ruge i en standard vev kultur inkubator for 3 \ u20124 dager (37 ° c, 5% CO2).
- Etter 3 \ u20124 dager, inspisere kulturer under et lett mikroskop (10x) for å sikre organisering av celle klynger i organoid strukturer. Deretter, forsiktig erstatte Transduction Media med 250 μL ENR medium.
- Erstatt Media hver 3 \ u20124 dager.
7. valg (hvis aktuelt)
- Etter 2 \ u20123 dager, sammenlegge relevant antibiotika eller hormon for utvalg å det Transduction medium hvis passende.
Merk: Vi brukte puromycin (2 μg/ml) for valg av lentivrial Transduction fordi plasmider næret en puromycin resistens gen2,14.
8. bekreftelse på vellykket Transduction og genuttrykk eller deaktivering
- Hvis du bruker FUGW lentivirus2,14, anslå Transduction effektivitet ved å måle GFP signaler via fluorescerende mikroskop eller flow flowcytometri.
- Valider gen overuttrykte eller-deaktivering ved hjelp av kvantitativ omvendt transkriptase polymerase kjedere reaksjon (RT-PCR) for kvantitativ sammenligning av mRNA i kontroll-og eksperimentelle organoid kulturer.
- Bekrefte proteinnivåer for protein-koding genuttrykk eller deaktivere Western Blot eller immunostaining2.
9. Organoid Cryosection i kjeller membran Matrix
Merk: Se Figur 3.
- Fjern ENR medium ved mild sug, vær forsiktig så du ikke forurolige kjelleren membran matrise og forsiktig vask en gang med 500 μL av PBS.
- Fix organoids med 1,0 mL 4% paraformaldehyde (PFA) løsning (tabell av materialer) ved RT for 30 min.
- Fjern PFA ved å suge, og vask forsiktig to ganger med 1 mL PBS.
- Fjern PBS ved å suge og tilsett 1,0 mL av 30% sukrose buffer til hver prøve. Ruge fast organoids i sukrose for 1 t ved 4 ° c i et kaldt rom, kjøleskap, eller på is for å tørke prøver.
- Fjern sukrose buffer ved sug og Legg akkurat nok embedding sammensatte (tabell over materialer) for å dekke matrisen laget (~ 300 μL/Well) i hver brønn.
- Ruge ved RT for 5 min.
- Plasser prøvene i en-80 ° c fryser i 10 min, eller til den innebygde forbindelsen blir solid og hvit.
- Plasser parabolen med frosne embedding sammensatte på RT å tillate minimal smelting av sammensatt langs kantene. Bruk en skalpell til å skille blokken fra veggene i brønnen.
- Fjern matrisen-embedding sammensatte blokken ved hjelp av tang og plassere den i en prøve blokk (f. eks cryomold), arbeider raskt for å hindre smelting.
- Fyll mold helt med embedding sammensatte og fryse ved-80 ° c i 30 min.
- Bruk blokken er for skjæring eller lagring i-80 ° c fryser for videre bruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her beskriver vi en rask og svært effektiv Transduction teknikk som utnytter magnetiske nanopartikler eksponert for et magnetisk felt for å levere lentivirus til celler av interesse. Med lett tilgjengelige verktøy, har vi søkt denne tilnærmingen ikke bare å overfører fersk isolert krypten celler (figur 1a), men også for Organoids (figur 2) og andre celler som er ildfaste til mer rutinemessige Transduction tilnærminger. Lentiviral partikler kan lett bøyes til magnetiske nanopartikler og de resulterende virus-nanopartikkel komplekser er levert effektivt ved å bruke et magnetfelt ved hjelp av en magnetisk plate. For å optimalisere denne tilnærmingen, vi først testet lentiviral vektorer knyttet til GFP slik at GFP kan brukes til å identifisere transduced celler med fluorescens mikroskopi. Den GFP kan visualisere på hvert trinn i organoid utvikling, inkludert tidlig når krypten celler organisere i cyste-lignende strukturer (figur 4a), eller ved senere tidspunkt når organoids form knopper (figur 4b). Vellykket transduced intestinal organoids kan deretter gjennomgå funksjonell analyse for endringer i utviklingen av farging cellemembraner og kjerner for å nummerere totalt celle nummer i tillegg til avstamning markører, for eksempel lysozyme å identifisere Paneth celler ( Figur 4C).
Genetisk konstruerte organoids kan brukes til videre analyse ved å generere frosne seksjoner som beskrevet her (Figur 3). Etter innebygging organoids, frosne blokker kan lagres og senere delt for fremtidige studier. Denne tilnærmingen er også effektiv (anslått til ~ 95% basert på prosentandel av GFP (+) organoids til total organoids). Denne tilnærmingen kan utføres med standard laboratoriereagenser, og dermed gi vev som er mottagelig for ulike undersøkelser, inkludert celle nummer, celle skjebne, og tilstedeværelsen og nivåer av spesifikke proteiner2. For eksempel har vi brukt frosne seksjoner og immunofluorescent flekker for å identifisere enkeltceller og konstatere celle type (figur 4c).
Figur 1: isolerte Krypter og Villi med tegneserier som viser typisk morfologi. (A) isolert Krypter danner runde eller ovale strukturer. (B) Villi er identifisert som finger-lignende strukturer. Scale bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: skjematisk av viral Transduction av organoids ved hjelp av magnetiske nanopartikler og eksponering for et magnetisk felt. De mest kritiske trinnene i Transduction-protokollen vises. (A) ruge virus og magnetisk nanopartikkel løsning i 15 minutter ved RT i et 1,5 ml rør. (B) tilsett magnetiske nanopartikler/virus blandingen til cellene som skal transduced. (C) plasser Cell kultur platen på magnet platen og ruge for 2 t i en standard vev kultur inkubator. Lengre inkubasjons tider kan også brukes (~ 6 h); representative brønnen vises her på magnet platen. (D) en celle som transduced med viruset og magnetisk nanopartikkel vises. (E) Overfør de infiserte organoid celle klynger og Transduction medier fra hver brønn til en 1,5 ml rør og sentrifuger ved 500 x g i 5 min. kast supernatanten med skånsom sug og Avkjøl røret som inneholder pellet på isen i 5 min. (F) Legg til 120 μL av kjeller membran matrise og resuspend pellet ved pipettering langsomt opp og ned. (G) frø dråper på 30 μL med matrise-celle blanding i hver brønn i en ny 48-brønn plate. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: skjematisk av frossen snitting av organoids i 3D-matrise. De mest kritiske trinnene i den frosne skjære protokollen vises. (A) en enkelt brønn innenfor en 24-brønn cellekultur plate er avbildet. (B) Legg til akkurat nok embedding sammensatte å dekke matrisen laget (~ 300 μL/Well) og RUGE ved RT for 5 min. (C) sted prøver på-80 C i en fryser i 10 min eller til embedding sammensatte svinger solid og hvitt. Deretter plasserer parabolen på RT å tillate liten smelting langs kantene av prøven. (D) bruk en skalpell å skille blokken fra veggene i brønnen. (E) Fjern Matrix-embedding sammensatte blokken ved hjelp av tang og plasser i en passende grunne container eller mold for frysing vev. Fyll mold helt med embedding sammensatte (OCT). (F) fryse blokk ved-80 C i en fryser i 30 min. (G) blokken er klar for snitting eller lagring i-80 C fryser for videre bruk. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: representative bilder av transduced intestinal organoids. (A) representativt bilde av små intestinal organoids under lys mikroskop viser (venstre) fluorescens mikroskopi, og (høyre) standard mikroskopi av transgene uttrykk (EGFP) på dag 3 etter Transduction. Scale bar = 50 μm. (B) eksempel på overuttrykte av gen koding GFP i organoid etter Transduction ved hjelp av magnetiske nanopartikler. Organoid celler ble transduced med lentivirus uttrykke GFP (FUGW; Topp) eller lentivirus overexpressing Hmga1 (FUGW-Hmga1; Nederst) som vist på dag 12 etter Transduction. Scale bar = 50 μm. (C) Immunofluorescence avbildning av formalin faste frosne delen av organoids. Organoid seksjoner (4 μm) var farget med anti-lysozyme (rød), anti-EpCAM (grønn) og DAPI (blå). EpCAM demarcates cellekantlinjer, DAPI indikerte individuelle kjerner, og lysozyme flekker Paneth celler. Scale bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Organoid kultur medium (ENR) | 100 mL |
| DMEM/F12 + | 96 mL |
| L-alanyl-L-glutamin dipeptidet supplement (f. eks Glutamax) | 1 mL av |
| NEAA | 1 mL av |
| Penn/strep | 1 mL av |
| HEPES | 1 mL av |
| EGF (100 μg/mL) | 5 μL |
| Noggin (100 μg/mL) | 10 μL |
| R-spondin (100 μg/mL) | 10 μL |
| eller R-spondin tilstand medium (CM) | 20 mL |
| Humant rekombinant insulin (10 mg/mL) | 5 μL |
| Transduction medium | 5 mL |
| ENR medium | 2,4 mL |
| Medium for wnt tilstand (CM) | 2,5 mL |
| Nikotinamid (1M) | 100 μL |
| Y27632 (10 μM) | 10 μL |
| Krypter dissosiasjon buffer | 100 mL |
| PBS (uten ca2 +, mg2 +) | 99 mL |
| Penn/strep | 1 mL av |
| 0,5 M EDTA | 100 μL |
| 0,1 M DTT (dithiotreitol) | 100 μL |
| 293T medium | 100 mL |
| DMEM | 90 mL |
| FBS | 10 mL |
| Virus samling medium | 100 mL |
| DMEM | 99 mL |
| FBS | 1 mL av |
| Organoid fordøyelsen buffer | 1 mL av |
| DMEM/F12 + | 1 mL av |
| Dispase I (10 mg/mL) | 6 μL |
| Dnase I (10 mg/mL) | 2,5 μL |
Tabell 1: medier som brukes i protokollen.
| Plater | 10 cm | 15 cm |
| Lentivirus transducing vektor | 6 μg | 9 μg |
| CMVΔR 8.91 | 8 μg | 12 μg |
| Md. G | 2 μg | 3 μg |
| Totalt vektorer | ≤ 16 μg | ≤ 24 μg |
Tabell 2: mengde plasmider DNA for transfeksjoner.
| Plate | Magnetiske perler (μL) | Volum av virus (μL) | Siste TransductionVolume (μL) |
| 48-brønn | 6 | 50 | 250 |
| 24-Well | 12 | 100 | 500 |
Tabell 3: volum av magnetisk perle løsning og vektor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Primær kultur av voksen intestinal epitel som organoids gir et kraftig verktøy for å studere molekylære mekanismer involvert i Stamcelle funksjon, intestinal epitel homeostase, og patologi1,2,3, firetil. Selv om CRISPR/Cas9-teknologi kan brukes til genetisk ingeniør organoids9, er det begrenset av behovet for omfattende screening og valg basert på sekvens analyse for de ønskede genetiske endringene. Målet med denne protokollen er å gi klare og konsise instruksjoner med video-baserte opplæringsprogrammer for magnetisk nanopartikkel levering av Lenti-eller retrovirus til intestinal organoids, etterfulgt av frossen snitting for videre analyse.
Denne protokollen er en rask og effektiv metode til genetisk ingeniør intestinal organoids og analysere konsekvensene av gen overuttrykte eller stanse fra frosne seksjoner. Kritiske trinn er skissert i figur 2, Figur 3. Denne strategien tillater gransking av den biologiske betydningen av genetiske forandringer (overuttrykte eller demping) i tarm stamceller og deres avkom kultivert under 3D-forhold2,13. Vi har også brukt denne magnetiske nanopartikkel-basert levering av viral vektorer for å forbedre celle Transduction og transgene Expression in vitro i forskjellige primære celler2,13.
Med denne tilnærmingen, virale partikler er belagt med magnetiske nanopartikler og levert til celler ved eksponering til et magnetisk felt. Sammenlignet med dagens Transduction metoder, for eksempel polybrene med eller uten spinoculation10,15, magnetiske nanopartikkel-viral komplekser er mindre giftig for celler fordi opptaket av genetisk materiale er formidlet av endocytose og pinocytosis, to naturlig forekommende biologiske prosesser som ikke induserer betydelig skade på cellemembraner. Dermed forbedres både celle levedyktighet og Transduction effektivitet. Transduction effektivitet kan økes ytterligere ved hjelp av små Crypt fragmenter eller enkeltceller (se trinn 4,8) i stedet for større Krypter eller hele organoids som rapportert tidligere2,10,13,16. Magnetisk guidet nanopartikkel levering resulterer i rask akkumulering, penetrasjon, og opptak av viral vektorer i målcellene2,13. De magnetiske nanopartikler er laget av jernoksid, som er fullstendig biologisk nedbrytbart og belagt med spesifikke proprietære kationiske molekyler. Nanopartikkel forening med viral vektorer oppnås ved salt-indusert kolloidalt aggregering og elektrostatisk samhandling. Nanopartikler blir deretter konsentrert til celler av et eksternt magnetfelt generert av magnet platen plassert under kultur parabolen. Mens Transduction effektivitet tilnærminger 95%, ikke alle celler er transduced, som er en begrensning på denne teknikken. I tillegg endogenously uttrykt gener av interesse er ikke endret som med CRISPR/Cas9 tilnærminger.
Etter gen overuttrykte eller deaktivering, kan organoids brukes til en myriade av studier, avhengig av de vitenskapelige mål, herunder analyse av genuttrykk, Proteomikk endringer i celler eller skilles ut av celler, metabolske endringer, og morfologiske endringer. Som med levende vev, kan frosne seksjoner fås for immunhistokjemiske og immunofluorescence studier av spesifikke proteiner som transkripsjon faktorer, cytoplasmatiske molekyler, eller celleoverflaten markører. Vår artikkel inneholder en effektiv tilnærming for å få frosne seksjoner fra organoids uten å forstyrre deres posisjon og organisasjon i 3D-kultur. Dette er fordelaktig fordi tidligere teknikker krever fjerning av organoid fra kjelleren membran matrise før frysing16. Behandling av organoids ved fjerning fra matrise kan forstyrre den strukturelle organiseringen av organoid i stedet for å reflektere in vitro vekst og utvikling.
Denne protokollen til genetisk ingeniør intestinal organoids kan også tilpasses til å studere andre celle-baserte modeller og organoid systemer. For eksempel, bukspyttkjertel, colonic, lever, CARDIAC, og cerebral organoid systemer kan være transduced med denne tilnærmingen. Selv celler som vokser under mer standard kultur teknikker er mottagelig for nanopartikkel teknologi. Videre kan denne tilnærmingen brukes til å studere den molekylære mekanismer av sykdommer, ikke bare i sammenheng med stilk cellen-avledet organoid systemer, men også i tumor organoids.
Oppsummert, de viktigste endringene som er beskrevet i disse protokollene for intestinal organoid studier vil forhåpentligvis styrke forskere til å belyse rollen som viktige faktorer og nedstrøms trasé involvert i biologi av intestinal stamceller og deres avkom . Disse tilnærmingene bør gi midler til å lære mer om molekylære mekanismer underliggende selv fornyelse, celle skjebne besluttsomhet, vev homeostase, og intestinal epitel regenerering, under både fysiologiske og patologisk forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institute of Health (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), Maryland Stem Cell Research Fund (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), den amerikanske lunge foreningen, The Allegheny Health Network-Johns Hopkins Research Fund og Hopkins fordøyelsessykdommer Basic Research Core Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Base medium for 293T cells |
| DMEM/F12+ | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer |
| OPTI-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Virus plasmids transfection medium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | Component of virus collection medium and 293T medium |
| Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer |
| PBS (without Ca2+, Mg2+) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | A wash buffer and component of crypt dissociation buffer |
| Mem-NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Component of organoid culture medium |
| GlutamaxII | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Component of organoid culture medium |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Component of organoid culture medium |
| EGF | Millipore Sigma | E9644 | Component of organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 250-38 B | Component of organoid culture medium |
| R-spondin | R&D | 7150-RS-025/CF | Component of organoid culture medium |
| Human recombinant insulin | Millipore Sigma | I9278-5ml | Component of organoid culture medium |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N3376-100G | Component of Transduction medium |
| Wnt3A | R&D | 5036-WN-010 | Component of Transduction medium |
| Y27632 | Millipore Sigma | Y0503-1MG | Component of Transduction medium |
| 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Component of Crypts dissociation buffer |
| DTT (dithiothreitol) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | Component of Crypts dissociation buffer |
| Dispase I | Millipore Sigma | D4818-2MG | Component of organoid digestion buffer |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Component of organoid digestion buffer |
| matrigel(Growth factor reduced) | Corning | 356231 | Used as a matrix to embed organoids |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Medium for transfection in viral production |
| ViralMag R/L | Oz Biosiences | RL40200 | Magnetic particles of viral transduction |
| Magnetic plate | Oz Biosiences | MF10000 | Magnetic plate to facilitate viral transduction |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Transfection agent in viral production |
| Poly-D-Lysine | Millipore Sigma | A-003-E | Coating for plates before seeding 293T cells |
| 4% Formaldehyde Solution | Boster | AR1068 | Solution to fix organoids |
| O.C.T embedding compound | Thermo Fisher Scientific | 4583S | For embedding of the the organoids |
| 5 mL Falcon polystyrene tubes | Corning | 352054 | |
| 50 mL Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.100 | |
| Orbitron rotator II Rocker Shaker | Boekel Scientific | 260250 | |
| Olympus Inverted microscop CK30 | Olympus | CK30 | for scanning and counting crypts |
| Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence | Nikon | Axiovert 200 | for viewing fluorescence in the crypts |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane | Milipore Sigma | UFC910024 | For concentrating viruses |
| pluriStrainer 20 µm (Cell Strainer) | pluriSelect | SKU 43-50020 | For preparing organoid fragments |
| Falcon Cell Strainer | Fisher Scientific | 352340 | For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid) | Millipore Sigma | M8937-100EA | ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments |
| Animal strain: C57BL/6J | Jackson Lab | #000664 | For organoid culture |
References
- Cheung, E. C., et al. TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis. Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).
- Xian, L., et al. HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche. Nature Comm. , (2017).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).
- Kabiri, Z., et al. Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts. Development. 141, 2206-2215 (2014).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. J Vis Exp. (120), (2017).
- Muñoz, J., et al. The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent '+4' cellmarkers. EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).
- Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture. J Vis Exp. (90), e51765 (2014).
- Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).
- Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells. Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Tesfaye, A., et al. The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis. Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).
- Haim, H., et al. Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus. J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).
- Xue, X., Shah, Y. M. In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors. J Vis Exp. (75), e50210 (2013).
