Summary
אנו מתארים הוראות צעד אחר צעד ל: 1) ביעילות מהנדס מעיים אורגנואידים באמצעות ננו חלקיקים מגנטיים עבור התמרה-או כפוף, ו, 2) ליצור קטעים קפואים מן הנדסה ארגונית. גישה זו מספקת כלי רב עוצמה כדי לשנות ביעילות ביטוי גנים באורגנואידים לחקירת השפעות במורד הזרם.
Abstract
תרבויות מעיים מספק הזדמנות ייחודית לחקור את תא גזע המעיים וביולוגיה קריפטה בתחום החוץ, למרות שגישות יעילות לתמרן ביטוי גנים באורגנואידים עשו התקדמות מוגבלת בזירה זו. בעוד CRISPR/Cas9 הטכנולוגיה מאפשרת עריכת הגנום מדויק של תאים לדור אורגנואיד, אסטרטגיה זו דורשת בחירה נרחבת והקרנה על ידי ניתוח רצף, אשר הוא גם זמן רב ויקר. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לצורך התמרה ויראלית יעילה של אורגנואידים מעיים. גישה זו מהירה ויעילה מאוד, ובכך מפחית את הזמן ואת ההוצאות הטמונות בטכנולוגיית CRISPR/Cas9. אנו מציגים גם פרוטוקול כדי ליצור קטעים קפואים מן התרבויות אורגנואיד שלמים לניתוח נוסף עם אימונוהיסטוכימיה או אימונוofluorggogtgggg, אשר יכול לשמש כדי לאשר ביטוי גנים או השתקה. לאחר התמרה מוצלחת של וקטורים ויראליות עבור ביטוי גנים או השתקה מושגת, תא גזע המעיים פונקציה קריפטה ניתן להעריך במהירות. למרות מחקרים אורגנואיד ביותר להעסיק בחוץ מבחנה, אורגנואידים יכול גם להיות מועברת עכברים עבור ניתוחים פונקציונליים vivo. יתר על כן, הגישות שלנו הם יתרון לניבוי תגובות טיפוליות לתרופות, כי כיום הטיפולים הזמינים בדרך כלל פונקציה על ידי ביטוי גנים מודולים או פונקציה חלבון ולא שינוי הגנום.
Introduction
היכולת לעכבר התרבות או האדם קריפטים תאים כתלת מימדי (3D) אורגנואידים מן המעיים או המעי הגס על פני תקופות זמן ממושך סיפק פריצת דרך גדולה כי תרבויות אלה להציג תכונות הגדרת אפיתל המעי ב vivo מיכל בן , מיכל השני , 3. אורגנואידים נגזר הקריפטטים הראשוניים מסוגלים לחידוש עצמי וארגון עצמי, המציגות פונקציות סלולריות דומה לרקמות המקור שלהם. אכן, אורגנואידים לאחר מכן לא רק את הארגון המבני של קריפטים בvivo, אלא גם תכונות מולקולריות רבות, ובכך לספק כלים שימושיים כדי ללמוד ביולוגיה נורמלית מדינות המחלה. כדי להמחיש, מחקרים אורגנואיד חשפו מסלולים מולקולריים מעורבים התחדשות רקמות1,2,3,4,5 כמו גם תרופות שיכולות לשפר את הפונקציה בהגדרות הפתולוגיים6,7.
המחקר של תאי גזע מעיים הוא עניין מיוחד, כי רירית המעיים היא בין רקמות המרגליות הגבוהה ביותר, חידוש עצמו כל 3-5 ימים כדי להגן על האורגניזם מפני חיידקים, רעלים, ופתוגנים אחרים בתוך ה מעיים לומן. תאי גזע מעיים (iscs) אחראים ליכולת הרגנרציה המדהימה הזאת ובכך לספק פרדיגמה ייחודית ללימוד הפונקציה של תא גזע מבוגרים1,2. השושלת-מעקב ניסויים בעכברים הפגינו כי מבודדים Lgr5-חיוביים בתאי גזע יכול להיות מתורבת כדי ליצור אורגנואידים 3D או ' מיני מעיים ' בתוך מבחנה אשר הם מקרוב מראה שלהם ב vivo עמיתיהם. תרבויות אורגנואיד יכול גם להיות נגזר של תא מעיים קריפטה מבודד מורכב של ושלתי, ISCs, ו Paneth תאים, האחרון אשר מהווים את התאים נישה אפיתל ב vivo. למעשה, תרבות אורגאידית מתאי המעי הראשי בקריפטה התפתחה לתוך טכניקה שגרתית יחסית קל ליישם ברוב המעבדות באמצעות ריאגנטים זמין נרחב. מודל זה הוא גם מקלה לניתוח כמותי של ביטוי גנים על ידי rna-רצף (rna-Seq) וחלבונים על ידי ספקטרומטר המסה, אימונוהיסטוכימיה, או אימונולואוורסטילהכתמים2,4,8. בנוסף, גנטיקה פונקציונלית ניתן ללמוד באמצעות רווח (ביטוי או הבעה גנים של הפעלת גן מוטציה) או אובדן של פונקציה (גנים השתקה או ביטוי של מוטציה אובדן פונקציה) גישות2.
חשוב מכך, יעילות נמוכה ורעילות גבוהה של דנ א סטנדרטי או פרוטוקולים של התמרה ויראלית עם polybrene להישאר משוכה גדולה בתחום. למרות CRISPR/Cas9 הטכנולוגיה מאפשרת עריכת הגנום מדויק, גישה זו דורשת בחירה גוזלת זמן ואחריו אימות רצף9. כאן, אנו מציגים פרוטוקול נגיפי התמרה עבור אורגנואידים המעי הראשי הממוטב מסירה של חלקיקים ויראלי על ידי הקונקטוחלקיקים מגנטיים ויישום של שדה מגנטי. שינויי מפתח לפרוטוקולים קודמים4,5,10, 11,12,13 והמלצות כדי לשפר את היעילות מסופקים. אנו מתארים גם גישה ליצור קטעים קפואים מן האורגנואידים שלמים תרבותי ב-3D מטריצות (המכונה מעתה מטריקס קרום המרתף מטריצה או מטריצה) לניתוח נוסף עם אימונוהיסטוכימיה או אימונוofor, כתמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה אושר על ידי המוסדות הרפואיים של ג'ונס הופקינס בעלי חיים והוועדה השימוש (IACUC). פרוטוקול זה משתנה משיטות שפורסמו בעבר10,11,12,13.
1. הכנת ריאגנטים
- הכינו 293T מדיום טרי מספר שעות מראש וחמים 37 ° c באמבט מים לפחות 10 דקות לפני השימוש (שולחן 1).
- הכינו את הדנ א הפלסטי2,13,14 לאריזה נגיפית. (שולחן 2).
- לרכוש את כל החומריםהנדרשים האחרים (טבלת חומרים).
2. הפקת וירוס או בייצור חלקיקים רטרו
- כליה העובר האנושי (HEK) 293T שזריעת תאים (יום 1)
- הכנת 1 150 מ"מ צלחת תרבות על ידי ציפוי עם 50 μg/mL פולי-ליזין מומס פוספט מתכלה באגירה (PBS; 10 מ ל/מנה) עבור 1 h בטמפרטורת החדר (RT).
- הסר את תמיסת המלח באגירה (PBS)/Polyt-d-יזין ושטוף את הצלחת מצופה פעמיים עם 5 מ"ל PBS.
- 293T תאים הזרע (8 \ u201210 x 106) ב 293t בינונית (טבלה 1) לנפח כולל של 15 מ ל.
- 293T התרבות תאים לילה בחממה רגילה תרבות רקמה (37 ° c, 5% CO2).
- ה293t תאים של HEK (היום השני)
- ביצוע החצייה פעם תאים הגיעו 70-80% המפגש (בדרך כלל כ 24 שעות לאחר זריעה 8 \ u201210 x 106 תאים).
- הכנת תערובת הזיהום באמצעות גישה יעילה כגון ליפופי מסחרי הניסוח (שולחנות 1 \ u20122, לוח חומרים)2.
- לדלל את מבנה ה-DNA בונה וירוס12 (סך הכל ~ 24 μg בינוני dna, שולחן 2) ב 1.2 ml של מדיום החוצה ו דגירה עבור 5 דקות ב RT ב 1.5 Ml צינורות (לוח חומרים).
- לדלל את העוצר מעצר (36 μL) ב 1.2 מ ל של בינונית (טבלת חומרים) ו-דגירה של 5-ml צינורות עבור 5 דקות על פי הוראות היצרן.
- להוסיף את מגיב הנגיף (שלב 2.2.2.1) כדי מגיב החצייה (שלב 2.2.2.2) ולערבב בעדינות על ידי ליטוף איטי למעלה ולמטה באמצעות 5 מ"ל pipetting.
- מודקון את התערובת עבור 20 דקות ב RT.
- לשטוף בעדינות את התאים 293T עם 5 מ ל של מדיום החצייה ולהחליף עם 10 מ ל של מדיום החצייה.
- הוסף את ה-DNA-ליפיד מתחמי (משלב 2.2.2.3) dropwise למדיום של תאים 293T ובזהירות לערבב את המדיה במנות התרבות על ידי הזזת כיוונים אופקיים ואנכיים כדי להבטיח הפצה שווה של DNA-השומנים מתחמי בכל מנה.
- דגירה של 6 h בחממה סטנדרטית לתרבות רקמות (37 ° c, 5% CO2).
- לאחר דגירה, להחליף את המדיה עם 20 מ"ל וירוסים טריים איסוף בינוני (שולחן 1).
- אוסף וירוסים (ימים 3 \ u20125)
- איסוף מדיה וירוס בצינורות 50 mL, ולאחסן במקרר 4 ° c לריכוז נוסף.
- החלף 20 מ ל של וירוס טרי איסוף בינונית כל 24 h ותרבות לילה (~ 24 h). חזור על אוסף המדיה ביומיים הבאים (ימים 4 \ u20125).
- ודא כי הנפח הכולל של בינוני שנאסף לאחר יום 5 הוא ~ 60 mL (20 מ"ל/day x 3 ימים).
- ריכוז וירוס (יום 5)
- צנטריפוגה את המדיה שנאספו (60 mL) עבור 5 דקות ב 400 x g. ואז, להעביר את supernatant דרך מסנן (0.45 יקרומטר נקבוביות) כדי להסיר את כל הפסולת התאית.
- רכז את הוירוס על-ידי הוספת 15 מ ל של מדיית וירוסים מסוננת ביחידת סינון צנטריפוגלי (רשימת חומרים). צנטריפוגה ב 2,500 x g עבור 15 דקות ב 4 ° c. מכיוון שהוירוס אינו יכול לעבור דרך מסנן זה, הוא יהיה מרוכז בחדר העליון של המסנן.
- משפל את הזרימה-דרך מן הצינור (החדר התחתון) ולהוסיף עוד 15 מ ל של מדיה הנותרים ויראלי אוסף המדיה לאותו יחידת הסינון צנטריפוגלי. צנטריפוגה לעיל (2,500 x g עבור 15 דקות ב -4 ° c) כדי לרכז וירוס נוסף מתוך הסופרנטאנט.
- חזור על התהליך באמצעות אותו מסנן עבור 60 mL מלוחית התמרה אחת עד לקבלת הריכוז הרצוי (~ 100-קיפול).
הערה: אנחנו בדרך כלל להתרכז ~ 60 mL של מדיה אוסף וירוסים כדי ~ 600 μL. - הסר את הווירוס מרוכז מהתא העליון של המסנן באמצעות 1 mL pipet, ולאחר מכן סדרת מחלקים ו לאחסן בצינורות 1.5 mL (50 \ u201260 μl/tube) ב-80 ° צ' לשימוש מאוחר יותר. אחסן חלקיקים מרוכזים עבור עד 6 \ u201212 חודשים.
3. בידוד קריפטטים
- המתת חסד של עכברים באמצעות CO2 על פי הנחיות IACUC מקומיות.
- מניחים את החיה המרדמים על גבו ורוחצים את הבטן על ידי ריסוס עם 70% אתנול.
- לבצע חתך באמצע קו האורך מעצם החזה אל המפשעה, לצמצם את העור הראשון, ולאחר מכן את הרקמה התת עורית.
- להסיר את המעי הדק מהבטן אל cecum.
- זיהוי אזורי עניין במעי הדק; הקריפטטים יכולים להיות מבודדים מן התריסריון, מעי ו ileum.
- באמצעות מזרק 10 מ ל, ריקון המעי הדק מבודד עם מאגר דיסוציאציה קריפטה (מקורר לפני הערוץ המכיל 1 מילימטר dithio, (DTT), 1% פניצילין/סטרפטומיצין (לא Ca2 + ו-Mg2 +)) במנה 10 ס מ רקמות רקמה (שולחן 1משנה לשעה
- הסר את רקמת השומן ההיקפית, ופתח או "פילה" את רקמת המעי longitudinally על צלחת זכוכית סטרילית (15 ס"מ x 15 ס מ).
- מגרדים בעדינות את המעי האפיתל מעיים באמצעות מגרד התא.
- חותכים את המעי הדק לתוך 2 \ u20123 ס מ חלקים מחוכמת אורך.
- העבר את הרקמה לצינור 15 מ"ל המכיל PBS מקורר באמצעות מלקחיים שטוחים (116 מ"מ). לשטוף את שברי הרקמה על ידי טלטול נמרצות ביד עבור ~ 30 s (הזזת הצינור בכיוונים מנוגדים ~ 60 פעמים).
- תרענן את הערוץ הPBS ותחזור. עד שערוץ ההתרמה יתבהר
הערה: אנחנו בדרך כלל לשטוף את השברים 2 \ u20123 פעמים. - מודטת את הרקמה בתוך 15 מ"ל שפופרת חרוטי המכיל 10 מ ל של מאגר דיסוציאציה קריפטה (טבלה 1) עבור 10 דקות ב 4 ° c על שייקר מסלולית במהירות בינונית פעם ה-PBS ברורה.
- במרץ לנער את הצינור ביד עבור ~ 30 s (הכיוונים הפוכים ≈ 60 פעמים) ולהעביר את הרקמה באמצעות מלקחיים שטוח למשנהו 15 מ ל שפופרת חרוט מכיל 10 מ ל של מאגר דיסוציאציה קריפטה. . מחלק את השבר על הקרח אין להשתמש בשבר הראשון עבור תרבות ארגונית מאחר שהוא מכיל בעיקר villi.
- חזור על שלבים 3.11 \ u 20123.13 עבור 3 \ u20124 פעמים, איסוף כל שבריר והצבת אותם על קרח.
- בחר את השבר המועשיר עם האחוז הגבוה ביותר של הקריפטטים מעיים על-ידי סריקת הדגימות של 200 μL מכל שבריר תחת מיקרוסקופ הפוך (4x). זיהוי הקריפטטים לפי מורפולוגיה טיפוסית כפי שמתואר בעבר (איור 1A)10.
הערה: הם יופיעו כעגולים או אובליים בצורה ויכילו תאי Paneth מגורען. לעומת זאת, villi הם מבנים כמו אצבע חסר תאים Paneth הגרגירים (איור 1B). - להעביר את השבר שנבחר באמצעות מסננת תא 40 יקרומטר כדי לקבל קריפטטים בגודל דומה אם נדרש. לחילופין, בודד Lgr5 + בתאי גזע מבוסס על הזרימה cy try עבור חלבון פלורסנט ירוק (GFP) אם עכברים מצטלבים על הרקע EGFP-Lgr5 + או מודל אחר מתאים המאפשר זיהוי של Lgr5 + תאים2.
- ספור את המספר הכולל של הקריפטטים בשבר שנבחר כדלקמן.
- פיפטה 50 μL של השבר הנבחר לתוך היפוך ולספור את מספר הקריפטטים באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך (4x). מקום ~ 100 מקריפטטים גם כאשר משתמשים בצלחת 48-באר כדי לאפשר את הניסויים התמרה שבהם 3 \ u20126 בארות יהיו ממותמרים לכל מצב ניסיוני עבור גנים השתקה או הבעות יתר.
- בהתבסס על מספר הקריפטטים ל50 μL, חשב את נפח מאגר הדיסוציאציה הקריפטה הדרוש והעבר את אמצעי האחסון לתוך שפופרת 1.5 mL.
הערה: לדוגמה, 10 הקריפטטים לכל 50 μL נספרים, 6 x 50 μL או 300 μL דרושים עבור 300 הקריפטטים.
- צנטריפוגה את הקריפטטים בצינורות 1.5-mL ב 300 x g עבור 5 דקות.
- בזהירות להיפטר supernatant על ידי ליטוף בעדינות את שכבת הנוזל העליון ולהשעות מחדש את הגלולה ב 100 μL של גורם גדילה מופחתת מטריקס קרום המרתף על הקרח (לוח חומרים).
- הזרע המכיל מטריקס המכילים הקריפטטים לתוך 37 ° c מראש מחומם 48-באר צלחת (30 μL/ובכן, ~ 100 קריפטטים/ובכן). מודטת הצלחת בחממה סטנדרטית לתרבות רקמות עבור 5 \ u201215 min כדי לאפשר gelation מטריצה (37 ° c, 5% CO2).
- כיסוי כל ג'ל עם 250 μL תרבות ארגונית (ENR) בינונית (שולחן 1) ומניחים את הצלחות 48-היטב בחזרה לתוך חממה רגילה תרבות רקמה (37 ° c, 5% CO2). בדוק את התרבויות עבור ארגון קריפטה לתוך צורות קטנות, עגולות, פיברוזיס לאחר 24 שעות; ניצנים יהיה ליצור לאחר 2 \ u20125 ימים.
- החלף בעדינות את מדיית ENR כל 3 ימים. הסר מדיית ENR ישנה עם יניקה עדינה, טיפול לא לגעת במטריצה בעת החלפת מדיה.
- המעבר תרבויות אורגאיד כל 4 \ u20127 ימים כפי שתוארו בעבר11.
4. הכנה לקטע אורגאיד
- העבר אורגנואידים ברגע שהם מטפסים (בתוך 1 \ u20122 שבועות) או לאחר היותו מיושן. עבור ניסוי בודד התמרה, להכין 2 \ u20123 בארות של אורגנואידים תרבותית בצלחת 48-באר לכל תנאי עם ~ 100 \ u2012200 אורגנואידים/טוב או ~ 200 \ u2012600 אורגנואידים לכל מצב ניסיוני.
- Exchange ENR עם 250 μL התמרה מדיה (טבלה 1) ותרבות בתקשורת התמרה עבור 3 ימים או יותר או עד האורגנואידים לאמץ מורפולוגיה פיברוזיס. כלול הן Wnt3a והן מעכבי סלע (Y27632) במדיום התמרה כדי להגדיל את מספר התאים גבעול ו Paneth; ניטינאמיד (Nic) משפר את יעילות התרבות (ראה התמרה בינונית בטבלה 1).
- שבר מכני את הכיפה כמו מטריצת ממברנה מבנה המרתף עם מדיה טיפ מלטף באמצעות 1 mL pipet.
- העבר את האורגנואידים והמדיה לצינור 1.5 mL סטרילי.
- מכנית לשבש את המטריצה עוד יותר על ידי ליטוף עם 200 μL pipetting ~ 10 \ u201215 פעמים.
- צנטריפוגה את שברי אורגנואיד ב-RT ב 500 x g עבור 5 דקות.
- השמט את הסופרנטנט בזהירות באמצעות פיפטה והשהה מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל/F12 בינונית (שולחן 1).
- הוסף Dispase I (6 μL ב 10 מ"ג/mL) ו DNase I (2.5 μL ב 10 מ"ג/mL). מערבבים היטב על ידי ליטוף בעדינות באמצעות 1 mL pipetting.
- מארגני הדגירה ב 37 ° c עבור 20 דקות בצינור 1.5 mL.
- הוסף 500 μL של מדיית ENR כדי לסיים את תגובת הדיסוציאציה; הנסיוב באולם מסיים את התגובה.
- להעביר את התאים אורגאיד דרך מסננת תא 20 יקרומטר ו צנטריפוגה את שברי אורגאיד ב 400 x g עבור 5 דקות.
- השהה מחדש קטעים של אורגנואיד באמצעות התמרה בינונית-150 μL (טבלה 1).
5. הנדסה גנטית של אורגנואידים או תאים קריפטה על ידי התמרה ויראלית
הערה: ראה איור 2.
- אשכולות תא זרע אורגנואיד עם 200 μL התמרה בינונית/טוב בצלחת 48-באר ו דגירה בחממה רגילה תרבות רקמה (37 ° c, 5% CO2). לחילופין, המקום תאי קריפטה מבודדים טריים (~ 1,000 הקריפטטים) ב 200 μL התמרה בינונית/ובכן ב 48-באר צלחת ו דגירה בחממה רגילה תרבות רקמה (37 ° c, 5% CO2).
- הפשרת מבחנות של וירוסים עבור התמרה מאפשר ~ 50 μL של וירוס מרוכז עבור התמרה של כל באר ב 48-טוב צלחות או ~ 100 μL של וירוס מרוכז לכל טוב בצלחות 24-טוב.
- וירוס דגירה עם 12 μL של פתרון ננו-חלקיק מגנטי עבור 15 דקות ב-RT בצינור 1.5 mL (שולחן 3).
- הוסף את התמיסה ננו-חלקיק מגנטית/וירוס תערובת לתאים להיות התמרה.
- מניחים את לוח התרבות התא על צלחת מגנטית, מודקת לפחות 2 h (עד ~ 6 h) בחממה סטנדרטית לתרבות רקמות (37 ° c, 5% CO2).
6. זריעה של קטעים מזוהמים באורגאיד
- העבר את אשכולות התאים הנגועים והתמרה מדיה מכל באר לתוך צינור 1.5 mL.
- צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות.
- השמט את הסופרנטאנט עם יניקה עדינה וצנן את הצינורית המכילה את הגלולה על הקרח במשך 5 דקות.
- הוסף 120 μL של מטריקס קרום המרתף והשהה מחדש את הגלולה על ידי ליטוף לאט למעלה ולמטה.
- זרעים 30 μL של תערובת תא מטריצה לצלחת חדשה 48-טוב.
- מודקת את הצלחת ב 37 ° צ' עבור 5 \ u201215 min עד המטריצה מתקשה.
- הוסף התמרה בינונית לכל טוב ו מודטת בחממה רגילה תרבות רקמה עבור 3 \ u20124 ימים (37 ° צ', 5% CO2).
- לאחר 3 \ u20124 ימים, לבחון תרבויות תחת מיקרוסקופ אור (10x) כדי להבטיח ארגון אשכולות תאים למבנים אורגאיד. לאחר מכן, החלף בעדינות את מדיית התמרה באמצעות מדיום 250 μL ENR.
- החלף את המדיה כל 3 \ u20124 ימים.
7. בחירה (אם רלוונטי)
- לאחר 2 \ u20123 ימים, להוסיף אנטיביוטיקה רלוונטיים או הורמונים לבחירה למדיום התמרה במידת הצורך.
הערה: השתמשנו puromycin (2 μg/mL) עבור בחירה של התמרה המאשיון מפני פלמידים הרעמג גן התנגדות puromycin2,14.
8. אישור התמרה מוצלחת וביטוי גנטי או השתקה
- אם באמצעות fugw וירוס2,14, הערכת התמרה יעילות על ידי מדידת אותות gfp באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט או הזרימה cy, לנסות.
- אימות הבעות יתר של גנים או השתקה באמצעות היפוך כמותי הטרנסקריפטאז תגובת שרשרת פולימראז (RT-PCR) עבור השוואה כמותית של mRNA בשליטה ותרביות אורגאיד ניסיוני.
- אשר רמות חלבונים לביטוי גנים בקידוד חלבונים או להשתקה על-ידי אבן החשופה המערבית או כתמי החיסוני2.
9. אורגנואיד קריודור במרתף ממברנה מטריצות
הערה: ראה איור 3.
- להסיר בינונית ENR על ידי יניקה עדינה, להיזהר לא לperturb את מטריקס קרום המרתף בעדינות לשטוף פעם אחת עם 500 μL של PBS.
- תקן אורגנואידים עם 1.0 mL של 4% פאראפורמלדהיד (טבלת חומרים) ב RT עבור 30 דקות.
- הסירו את הערוץ הראשון בשאיבה ושטפו בעדינות פעמיים עם 1 מ ל PBS.
- הסר את ה-PBS על ידי יניקה והוסף 1.0 mL של 30% מאגר סוכרוז לכל מדגם. מודרת אורגנואידים קבוע בסוכרוז עבור 1 h ב 4 ° c בחדר קר, מקרר, או על קרח כדי ליטול דגימות מימה.
- להסיר מאגר סוכות על ידי יניקה ולהוסיף רק תרכובת הטבעה מספיק (טבלת חומרים) כדי לכסות את שכבת מטריצה (~ 300 μl/טוב) בכל באר.
- דגירה ב RT עבור 5 דקות.
- מניחים דגימות במקפיא של 80 ° c במשך 10 דקות, או עד שמתחם ההטבעה הופך למוצק ולבן.
- מניחים את הצלחת עם מתחם הטבעה קפואה ב-RT כדי לאפשר התכה מינימלית של התרכובת לאורך הקצוות. השתמש באזמל כדי להפריד את הבלוק מקירות הבאר.
- הסר את מטריצה הטבעה בלוק מתחם באמצעות מלקחיים ולמקם אותו בבלוק דגימה (למשל cryomold), עבודה במהירות כדי למנוע התכה.
- ממלאים את העובש לחלוטין עם מתחם הטבעה ולהקפיא ב-80 ° c עבור 30 דקות.
- השימוש בבלוק הוא עבור החסימה או אחסון ב-80 ° c מקפיא לשימוש נוסף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאן, אנו מתארים טכניקת התמרה מהירה ויעילה מאוד אשר מרתמות חלקיקים מגנטיים חשופים לשדה מגנטי כדי לספק הנגיף לתאי הריבית. עם כלים זמינים, יש לנו להחיל את הגישה הזאת לא רק כדי לשנות את התאים המבודדים מבודדים בלבד (איור 1A), אלא גם עבור אורגנואידים (איור 2) ותאים אחרים, כי הם עקשן כדי התמרה שגרתית יותר גישות. חלקיקים לנטינגיליים יכולים להיות בקלות מעלה באוב חלקיקים מגנטיים ואת הווירוס-ננו-חלקיק מכלולי מועברים ביעילות על ידי החלת שדה מגנטי באמצעות לוחית מגנטית. כדי לייעל גישה זו, בדקנו לראשונה וקטורים ויראליות מקושרים ל-GFP כגון GFP יכול לשמש כדי לזהות תאים התמרה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטית. GFP ניתן לדמיין בכל שלב בפיתוח אורגנואיד, כולל מוקדם כאשר תאים קריפטה לארגן לתוך מבנים כמו ציסטה (איור 4A), או בזמן מאוחר יותר נקודות כאשר בצורת ניצנים הטופס (איור 4a). מתאי מעיים בהצלחה לאחר מכן יכול לעבור ניתוח פונקציונלי עבור שינויים בפיתוח על ידי צביעת קרום התא וגרעינים כדי לספור מספר התא בנוסף סמנים השושלת, כגון ליזוזים לזהות תאים paneth ( איור 4 ג).
ניתן להשתמש באורגנואידים מהונדסים גנטית לניתוח נוסף על-ידי יצירת מקטעים קפואים כמתואר כאן (איור 3). לאחר הטבעה ארגונית, בלוקים קפואים ניתן לאחסן ומאוחר יותר מנות ללימודים עתידיים. גישה זו יעילה גם (מוערך להיות ~ 95% מבוסס על אחוז של GFP (+) אורגנואידים כדי הכולל אורגנואידים). גישה זו ניתן לבצע עם ריאגנטים מעבדה סטנדרטיים, ובכך לספק רקמות כי הם מקובל חקירות מגוונות, כולל מספר התא, הגורל התא, ואת הנוכחות והרמות של חלבונים ספציפיים2. לדוגמה, השתמשנו במקטעים קפואים ובצביעת מחיסולי לזיהוי תאים בודדים ובדוק את סוג התא (איור 4C).
איור 1: קריפטטים מבודדים ווילי עם קריקטורות המציגות מורפולוגיה טיפוסית. (א) קריפטטים מבודדים בצורת מבנים עגולים או אובליים. (ב) ווילי מזוהים בתור מבנים כמו אצבע. סרגל קנה מידה = 50 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: סכימטי של התמרה נגיפית של אורגנואידים באמצעות חלקיקים מגנטיים וחשיפה לשדה מגנטי. השלבים הקריטיים ביותר של פרוטוקול התמרה מוצגים. (A) וירוס הנגיף ננו-חלקיק מגנטי פתרון עבור 15 דקות ב-RT בצינור 1.5 mL. (ב) להוסיף חלקיקים מגנטיים/תערובת וירוס לתאים להיות התמרה. (ג) מניחים את לוח התרבות התא על הלוח המגנטי ואת הדגירה עבור 2 h בחממה רגילה לתרבות רקמות. זמני דגירה ארוכים יכול לשמש גם (~ 6 h); היטב נציג מוצג כאן על הלוח המגנטי. (ד) תא התמרה את הנגיף והננו-חלקיק המגנטי מוצג. (ה) להעביר את אשכולות תא הנגועים והתמרה מדיה מן כל באר לתוך צינור 1.5 mL וצנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות. להיפטר supernatant עם יניקה עדין קריר את הצינור המכיל את הגלולה על הקרח עבור 5 דקות. (F) להוסיף 120 μL של מטריצת קרום המרתף ולהשעות מחדש את הגלולה על ידי ליטוף לאט למעלה ולמטה. (G) זרעי טיפות של 30 μl המכיל תערובת תא מטריצה לתוך כל טוב בצלחת חדשה 48-טוב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: סכימטי של הקפאת הסדר של אורגנואידים במטריצה תלת-ממדית. השלבים הקריטיים ביותר של פרוטוקול האבטחה הקפואים מוצגים. (א) באר בודדת הנמצאת בלוח התרבות של התאים הפועל 24 היטב. (ב) הוספת מתחם הטבעה מספיק בלבד כדי לכסות את שכבת המטריצה (~ 300 μl/טוב) ו-דגירה ב-RT עבור 5 דקות. (ג) מקום דגימות ב-80 C במקפיא עבור 10 דקות או עד מתחם הטבעה הופך מוצק ולבן. לאחר מכן, מקם את המנה ב-RT כדי לאפשר התכה קלה לאורך קצות המדגם. (ד) השתמש באזמל כדי להפריד את הבלוק מקירות הבאר. (ה) להסיר את בלוק מטריקס הטבעה מורכבת באמצעות מלקחיים ומקום במיכל רדוד מתאים או עובש להקפיא רקמות. ממלאים את העובש לחלוטין עם תרכובת הטבעה (OCT). (ו) הקפאת חסימה ב-80 C במקפיא עבור 30 דקות. (G) הבלוק הוא מוכן לאחסון או אחסנה ב-80 C מקפיא לשימוש נוסף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תמונות מייצגות של אורגנואידים מעיים. (א) דמות ייצוגית של אורגנואידים מעיים קטנים תחת מיקרוסקופ קל המראה (משמאל) מיקרוסקופ הקרינה, ו, (מימין) מיקרוסקופ רגיל של ביטוי טרנזגנטי (egfp) ביום 3 לאחר התמרה. סרגל סרגל = 50 μm. (ב) דוגמה של ביטוי יתר של הקידוד גנטי gfp ב אורגנואיד לאחר התמרה באמצעות חלקיקי חלקיקים מגנטיים. תאים אורגנואיד התעברו עם הבעת וירוס ביטוי GFP (FUGW; למעלה) או לHmga1 וירוס ביטוי יתר (fugw-Hmga1; למטה) כפי שמוצג ביום 12 לאחר התמרה. סרגל בקנה מידה = 50 μm. (ג) אימונוofor, הדמיה של פורמלין החלק הקפוא של האורגנואידים. סעיפים אורגנואיד (4 μm) היו מוכתמים באנטי-ליסוזים (אדום), אנטי-EpCAM (ירוק) ו-DAPI (כחול). אפקאם דימדתא הגבולות, dapi הצביעו על גרעינים בודדים, ו-ליזוזים כתמי תאים paneth. סרגל קנה מידה = 50 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| בינונית תרבותית של אורגנואיד (ENR) | 100 מ ל |
| DMEM/F12 + | 96 מ ל |
| L-alanyl-L-(למשל גלוטמקס) | 1 מ ל |
| נאא | 1 מ ל |
| עט/דלקת | 1 מ ל |
| מיכל ביטון | 1 מ ל |
| EGF (100 μg/mL) | 5 מיקרומטר |
| ראש (100 μg/mL) | 10 מיקרומטר |
| R-החתן (100 μg/mL) | 10 מיקרומטר |
| או מדיום מצב R-החתן (CM) | 20 מ ל |
| אינסולין רקומביננטי אנושי (10 מ"ג/mL) | 5 מיקרומטר |
| התמרה בינונית | 5 מ ל |
| מדיום בינוני | 2.4 מ ל |
| בינונית של תנאי wnt (CM) | 2.5 מ ל |
| ניטינאמיד (1M) | 100 מיקרומטר |
| Y27632 (10 μM) | 10 מיקרומטר |
| פיצוח מאגר הדיסוציאציה | 100 מ ל |
| PBS (ללא Ca2 +, Mg2 +) | 99 מ ל |
| עט/דלקת | 1 מ ל |
| 0.5 M EDTA | 100 מיקרומטר |
| 0.1 מ. ט. ז | 100 מיקרומטר |
| 293T בינונית | 100 מ ל |
| מיכל הזיכרון | 90 מ ל |
| מיכל הפבס | 10 מ ל |
| וירוס אוסף בינוני | 100 מ ל |
| מיכל הזיכרון | 99 מ ל |
| מיכל הפבס | 1 מ ל |
| מאגר העיכול של אורגנואיד | 1 מ ל |
| DMEM/F12 + | 1 מ ל |
| האני (10 מ"ג/mL) | 6 מיקרומטר |
| Dnase I (10 מ"ג/mL) | 2.5 מיקרומטר |
טבלה 1: מדיה המשמשת בפרוטוקול.
| צלחות | 10 ס מ | 15 ס מ |
| מדידה וקטור התמרה | 6 מיקרומטר | 9 μg |
| CMVΔR8.91 | 8 μg | 12 μg |
| MD. G | 2 μg | 3 מיקרומטר |
| סה כ וקטורים | ≤ 16 μg | ≤ 24 μg |
שולחן 2: כמות של דנ א פלסטי לזיהום.
| צלחת | חרוזים מגנטיים (μL) | נפח של וירוס (μL) | עוצמת התמרה סופית (μL) |
| 48-ובכן | 6 | 50 | 250 |
| 24-ובכן | 12 | 100 | 500 |
שולחן 3: נפח של פתרון חרוז מגנטי וקטור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
התרבות העיקרית של אפיתל המעי הבוגר כמו אורגנואידים מספק כלי רב עוצמה כדי ללמוד מנגנונים מולקולריים מעורב בתפקוד תא גזע, הומאוסטזיס אפיתל המעי, ו פתולוגיה1,2,3, ד. למרות CRISPR/Cas9 הטכנולוגיה יכולה לשמש מהנדס גנטית אורגנואידים9, זה מוגבל על ידי הצורך הקרנה נרחבת ובחירה מבוסס על ניתוח רצף עבור שינויים גנטיים הרצוי. המטרה של פרוטוקול זה היא לספק הוראות ברורות ותמציתי עם הדרכות המבוססות על וידאו עבור משלוח ננו-חלקיק מגנטי של lenti-או רטרווירוס כדי אורגנואידים מעיים, ואחריו הקפאת הצמצם לניתוח נוסף.
פרוטוקול זה הוא שיטה מהירה ויעילה כדי להנדס גנטית מעיים ולנתח את ההשלכות של הבעת היתר של גנים או השתקה ממקטעים קפואים. שלבים קריטיים מתוארים באיור 2, איור 3. אסטרטגיה זו מאפשרת חקירה של המשמעות הביולוגית של שינויים גנטיים (ביטוי יתר או השתקה) בתאי גזע המעיים וצאצאיהם מתורבתים תחת תנאי תלת-ממד2,13. השתמשנו גם זה מגנטי ננו-חלקיק מבוסס מסירה של וקטורים ויראלי כדי לשפר את התמרה תאים וביטוי טרנסגנטית בתוך מבחנה בתאים ראשוניים שונים2,13.
עם גישה זו, חלקיקים נגיפי מצופים חלקיקים מגנטיים מועברים לתאים על ידי חשיפה לשדה מגנטי. לעומת שיטות התמרה הנוכחי, כגון polybrene עם או בלי מספירוחיסון10,15, מגנטי ננו-חלקיק-ויראלי מתחמים הם פחות רעילים לתאים בגלל ספיגת החומר הגנטי מתווכת על ידי האנדוציטוזה ו פינוציטוזה, שני תהליכים ביולוגיים המתרחשים באופן טבעי, כי לא לגרום נזק משמעותי קרום התא. כך, הן הכדאיות התאית והן יעילות התמרה משופרים. יעילות התמרה ניתן להגדיל עוד באמצעות שברי קריפטה קטנים או תאים בודדים (ראה שלב 4.8) במקום קריפטים גדולים או אורגנואידים כולו כפי שדווח בעבר2,10,13,16. מגנטוסטי מונחה ננו-חלקיק מסירת תוצאות בהצטברות מהירה, חדירה, ספיגת וקטורים ויראלי לתוך תאים היעד2,13. חלקיקים מגנטיים עשויים תחמוצת ברזל, אשר מתכלה לחלוטין מצופה עם מולקולות קנייני מסוימים קניינית. ננו-חלקיק עם וקטורים ויראליים מושגת על ידי צבירה הנגרמת על ידי מלח ואינטראקציות אלקטרוסטטית. חלקיקי חלקיקים מרוכזים אז על התאים על ידי שדה מגנטי חיצוני שנוצר על ידי הלוח המגנטי ממוקם תחת הצלחת התרבות. בעת התמרה של יעילות גישות 95%, לא כל התאים מתתמרים, שהוא מגבלה על טכניקה זו. בנוסף, הביע באופן שונה גנים של עניין לא משתנה כמו CRISPR/Cas9 גישות.
בעקבות גנים ביטוי יתר או השתקה, האורגנואידים ניתן להשתמש למגוון מחקרים, בהתאם ליעדים המדעיים, כולל ניתוח של ביטוי גנים, שינויים פרוטאוממית בתוך תאים או מופרש על ידי תאים, שינויים מטבולית, ו שינויים מורפולוגיים. כמו עם רקמות החיים, מקטעים קפואים ניתן להשיג עבור אימונוהיסטוכימיה ומחקרים immunofluorescence של חלבונים ספציפיים כגון שעתוק גורמים, מולקולות cytoplasmic, או משטח התאים סמנים. המאמר שלנו כולל גישה יעילה כדי לקבל חלקים קפואים מן האורגנואידים מבלי להפריע מיקומם והארגון בתרבות תלת-ממד. זה יתרון כי טכניקות קודמות דורשים הסרת אורגאיד מתוך מטריקס קרום המרתף לפני הקפאת16. עיבוד אורגנואידים על ידי הסרת מטריקס יכול לשבש את הארגון המבני של האורגאיד במקום לשקף את הצמיחה וההתפתחות של מבחנה.
פרוטוקול זה כדי להנדס גנטית אורגנואידים מעיים יכול להיות גם מותאם ללמוד תאים אחרים מבוססי מודלים מערכות אורגנואיד. לדוגמה, הלבלב, המעי הגס, הכבד, הלב, מערכות אורגאיד מוחין יכול להיות התמרה עם גישה זו. אפילו תאים הגדלים תחת טכניקות התרבות יותר סטנדרטיים הם מננו-חלקיק טכנולוגיה. יתר על כן, גישה זו יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד את המנגנונים המולקולריים של מחלות, לא רק בהקשר של מערכות הגזע הנגזר של תא, אלא גם באורגנואיד הגידול.
לסיכום, שינויים מרכזיים המתוארים בפרוטוקולים אלה עבור מחקרים אורגאיד מעיים בתקווה להעצים מדענים כדי להבהיר את התפקיד של גורמים חשובים ומסלולים במורד מעורב בביולוגיה של תאי גזע המעיים וצאצהם . גישות אלה צריך לספק את האמצעים כדי ללמוד יותר על מנגנונים מולקולריים בבסיס התחדשות עצמית, הגורל התא נחישות, הומאוסטזיס רקמות, והתחדשות אפיתל המעיים, תחת שני התנאים הפיזיולוגיים והפתולוגית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מן המכון הלאומי לבריאות (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), מרילנד תא גזע מחקר קרן (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), האגודה האמריקנית לריאות, רשת הבריאות של אלגני-ג'ונס הופקינס קרן מחקר ומחלות העיכול הופקינס מחקר בסיסי ליבה המחקר מרכז.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Base medium for 293T cells |
| DMEM/F12+ | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer |
| OPTI-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Virus plasmids transfection medium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | Component of virus collection medium and 293T medium |
| Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer |
| PBS (without Ca2+, Mg2+) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | A wash buffer and component of crypt dissociation buffer |
| Mem-NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Component of organoid culture medium |
| GlutamaxII | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Component of organoid culture medium |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Component of organoid culture medium |
| EGF | Millipore Sigma | E9644 | Component of organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 250-38 B | Component of organoid culture medium |
| R-spondin | R&D | 7150-RS-025/CF | Component of organoid culture medium |
| Human recombinant insulin | Millipore Sigma | I9278-5ml | Component of organoid culture medium |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N3376-100G | Component of Transduction medium |
| Wnt3A | R&D | 5036-WN-010 | Component of Transduction medium |
| Y27632 | Millipore Sigma | Y0503-1MG | Component of Transduction medium |
| 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Component of Crypts dissociation buffer |
| DTT (dithiothreitol) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | Component of Crypts dissociation buffer |
| Dispase I | Millipore Sigma | D4818-2MG | Component of organoid digestion buffer |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Component of organoid digestion buffer |
| matrigel(Growth factor reduced) | Corning | 356231 | Used as a matrix to embed organoids |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Medium for transfection in viral production |
| ViralMag R/L | Oz Biosiences | RL40200 | Magnetic particles of viral transduction |
| Magnetic plate | Oz Biosiences | MF10000 | Magnetic plate to facilitate viral transduction |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Transfection agent in viral production |
| Poly-D-Lysine | Millipore Sigma | A-003-E | Coating for plates before seeding 293T cells |
| 4% Formaldehyde Solution | Boster | AR1068 | Solution to fix organoids |
| O.C.T embedding compound | Thermo Fisher Scientific | 4583S | For embedding of the the organoids |
| 5 mL Falcon polystyrene tubes | Corning | 352054 | |
| 50 mL Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.100 | |
| Orbitron rotator II Rocker Shaker | Boekel Scientific | 260250 | |
| Olympus Inverted microscop CK30 | Olympus | CK30 | for scanning and counting crypts |
| Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence | Nikon | Axiovert 200 | for viewing fluorescence in the crypts |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane | Milipore Sigma | UFC910024 | For concentrating viruses |
| pluriStrainer 20 µm (Cell Strainer) | pluriSelect | SKU 43-50020 | For preparing organoid fragments |
| Falcon Cell Strainer | Fisher Scientific | 352340 | For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid) | Millipore Sigma | M8937-100EA | ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments |
| Animal strain: C57BL/6J | Jackson Lab | #000664 | For organoid culture |
References
- Cheung, E. C., et al. TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis. Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).
- Xian, L., et al. HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche. Nature Comm. , (2017).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).
- Kabiri, Z., et al. Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts. Development. 141, 2206-2215 (2014).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. J Vis Exp. (120), (2017).
- Muñoz, J., et al. The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent '+4' cellmarkers. EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).
- Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture. J Vis Exp. (90), e51765 (2014).
- Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).
- Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells. Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Tesfaye, A., et al. The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis. Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).
- Haim, H., et al. Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus. J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).
- Xue, X., Shah, Y. M. In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors. J Vis Exp. (75), e50210 (2013).
