Summary
我们描述了分步说明:1) 使用磁性纳米粒子对慢透或抗逆转录病毒转导进行高效工程肠道有机体,以及 2) 从工程有机物生成冷冻部分。这种方法提供了一个强大的工具,有效地改变基因表达在有机体的研究下游效应。
Abstract
肠道器官培养为研究肠道干细胞和体外密码生物学提供了独特的机会,尽管操纵器官基因表达的有效方法在这一领域进展有限。虽然CRISPR/Cas9技术允许对细胞进行精确的基因组编辑,以便产生有机体,但这一策略需要通过序列分析进行广泛的选择和筛选,这既耗时又昂贵。在这里,我们提供了一个详细的方案,为有效的病毒转导肠道器官。这种方法快速、高效,从而减少了CRISPR/Cas9技术固有的时间和费用。我们还提出了一个协议,从完整的有机体培养物中生成冷冻部分,以便用免疫组织化学或免疫荧光染色进行进一步分析,可用于确认基因表达或沉默。在成功转导病毒载体进行基因表达或沉默后,可迅速评估肠道干细胞和密码功能。虽然大多数器官研究采用体外检测,但有机体也可以传送给小鼠进行体内功能分析。此外,我们的方法有利于预测对药物的治疗反应,因为目前可用的疗法通常通过调节基因表达或蛋白质功能而不是改变基因组来发挥作用。
Introduction
长时间将小鼠或人类墓穴细胞培养为小肠或结肠的三维 (3D) 有机体的能力提供了重大突破,因为这些培养物显示了肠道上皮在体内的决定性特征1,2,3.从原发墓穴衍生的有机体能够自我更新和自我组织,表现出与其原产组织相似的细胞功能。事实上,有机物不仅概括了体内墓穴的结构组织,而且概括了许多分子特征,为研究正常生物学和疾病状态提供了有用的工具。为了说明,器官研究揭示了参与组织再生1、2、3、4、5以及可增强功能的药物的新型分子途径。在病理设置6,7。
对肠道干细胞的研究特别感兴趣,因为肠道内衬是高度再生的哺乳动物组织之一,每3-5天更新一次,以保护生物体免受细菌、毒素和其他病原体的侵害。肠道流明。肠道干细胞(ISCs)负责这种非凡的再生能力,从而为研究成人干细胞功能1,2提供了独特的范例。在小鼠的沿线追踪实验表明,分离的Lgr5阳性干细胞可以培养出来,在体外产生3D器官或"迷你胃",在体外它们密切镜像体内的同类。有机体培养也可以从肠道密码细胞分离物中衍生,这些分离物由祖细胞、ISC 和 Paneth 细胞组成,后者构成体内的上皮利基细胞。事实上,来自原发性肠道密码细胞的有机体培养已经演变为一种相对常规的技术,在大多数实验室使用广泛可用的试剂很容易实现。该模型还适用于RNA测序(RNA-Seq)的基因表达定量分析,以及通过质谱法、免疫组织化学或免疫荧光染色2、4、8对蛋白质进行定量分析。此外,功能遗传学可以使用功能增益(基因过度表达或激活突变基因的表达)或功能丧失(基因沉默或功能丧失突变的表达)方法2。
重要的是,标准质粒DNA或多蛋白的病毒转导方案的低效率和高毒性仍然是该领域的一个主要障碍。虽然CRISPR/Cas9技术允许精确的基因组编辑,这种方法需要耗时的选择,然后是序列验证9。在这里,我们提出了一个病毒转导方案,用于初级肠道器官,通过结合到磁性纳米粒子和应用磁场来优化病毒颗粒的传递。对先前协议4、5、10、11、12、13作了关键修改,并提出提高效率的建议。我们还描述了一种从3D母体凝胶(今称为基底膜基质或基质)中培养的完整有机物生成冷冻部分的方法,以便通过免疫组织化学或免疫荧光染色进行进一步分析。
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Protocol
该协议得到了约翰霍普金斯医疗机构动物护理和使用委员会(IACUC)的批准。该协议是从以前发布的方法10,11,12,13修改。
1. 试剂制备
- 提前几个小时准备新鲜的293T介质,在水浴中加热至37°C,使用前至少10分钟(表1)。
- 准备质粒DNA2,13,14用于病毒包装。(表2)。
- 获取所有其他必需材料 (材料表).
2. 伦蒂病毒或逆转录病毒颗粒生产
- 人类胚胎肾 (HEK) 293T 细胞播种(第1天)
- 在室温(RT)下涂上溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS;10 mL/盘)中的50微克/mL多-D-莱盐水,准备一个150毫米培养皿。
- 去除磷酸盐缓冲盐水 (PBS)/多 D-莱辛,用 5 mL PBS 洗涤涂层盘两次。
- 种子293T细胞(8\u201210 x10 6)在293T介质(表1)的总体积为15 mL。
- 在标准组织培养箱(37°C,5% CO2)中一夜之间培养293T细胞。
- HEK 293T 细胞转染(第 2 天)
- 一旦细胞达到70-80%汇合(通常在播种8\u201210 x 106细胞后约24小时)进行转染。
- 使用一种有效的方法制备转染混合物,如商业阳离子脂质体配方(表1\u20122,材料表)2。
- 稀释扁病毒DNA在1.2 mL转染介质中构造12(共+24 μg质粒DNA),在1.5 mL管(材料表)的RT孵育5分钟。
- 在1.2 mL转染介质(材料表)中稀释转染摄政(36 μL),并根据制造商的说明在5mL管中孵育5分钟。
- 将慢透病毒试剂(步骤 2.2.2.1)添加到转染试剂(步骤 2.2.2.2),并使用 5 mL 移液器缓慢上下移液轻轻混合。
- 在RT孵育混合物20分钟。
- 用5mL转染介质轻轻清洗293T细胞,用10mL转染介质代替。
- 将DNA-脂质复合物(从步骤2.2.2.3)滴入293T细胞的培养基,通过水平和垂直方向移动,仔细混合培养皿中的介质,以确保每道菜中DNA-脂质复合物的均匀分布。
- 在标准组织培养箱(37°C,5% CO2)中孵育6小时。
- 孵育后,用20mL新鲜病毒收集介质(表1)替换培养基。
- 病毒收集(第 3 天\u20125)
- 将病毒培养基收集在50 mL管中,并储存在4°C冰箱中以进一步浓缩。
- 每24小时更换20 mL的新鲜病毒收集介质,并隔夜(±24小时)培养。在接下来的 2 天内重复媒体收集(第 4 天\u20125)。
- 确保第 5 天之后收集的介质总体积为 ± 60 mL(20 mL/天 x 3 天)。
- 病毒浓度(第5天)
- 在 400 x g 下将收集的介质 (60 mL) 离心 5 分钟。然后,通过过滤器(0.45 μm 孔隙)将上清液排出,以清除任何细胞碎屑。
- 在离心过滤单元(材料表)中加入15 mL的过滤病毒介质,以浓缩病毒。在 2,500 x g下在 4°C 下离心 15 分钟。由于病毒无法通过此过滤器,它将集中在过滤器的上腔。
- 从管(底部腔室)吸出流量,并添加另外15 mL的剩余病毒收集介质上清液到同一离心过滤器单元。如上所述(2,500 x g在 4°C 下 15 分钟)从上清液中浓缩额外的病毒。
- 在单个转导板中对 60 mL 介质使用相同的过滤器重复此过程,直到达到所需的浓度(±100 倍)。
注意:我们通常将 +60 mL 的病毒收集介质浓缩到 +600 μL。 - 使用 1 mL 移液器从过滤器上腔中取出浓缩病毒,然后等分并储存在 1.5 mL 管 (50μu201260 μL/管) 中,以 -80 °C 供以后使用。储存浓缩颗粒长达6~u201212个月。
3. 隔离墓穴
- 根据当地的IACUC指南,使用CO2对小鼠实施安乐死。
- 将安乐死动物放在其背上,用70%乙醇喷洒,洗腹部。
- 执行从胸骨到腹股沟的纵向中线切口,先切开皮肤,然后切开皮下组织。
- 取出小肠从胃到cecum。
- 确定小肠内感兴趣的区域;墓穴可以从十二指肠、十二指肠和回肠中分离出来。
- 使用10 mL注射器,用密码分离缓冲液冲洗分离的小肠(预冷冻PBS含有1 mM二硫尿酸醇(DTT),1%青霉素/链霉素(无Ca2+和Mg 2+))在10厘米组织培养盘中(表) 1)
- 取出周围脂肪组织,在无菌玻璃板上纵向打开或"圆角"肠道组织(15 厘米 x 15 厘米)。
- 使用细胞刮刀轻轻刮掉肠道上皮绒。
- 将小肠切成2\u20123厘米长度的截面。
- 使用扁平钳子(116 mm)将组织转移到含有预冷却PBS的15 mL管中。用手大力摇动30s(将管子朝相反方向移动+60次),洗净组织碎片。
- 刷新 PBS 并重复洗涤,直到 PBS 变清楚。
注意:我们通常清洗片段 2\u20123 次。 - 一旦PBS清除,在轨道摇床上以中等速度在4°C下孵育组织,在含有10 mL的隐解分离缓冲液(表1)中孵育组织10分钟。
- 用手用力摇动管 30 s(相反方向 = 60 次),并使用扁平钳将组织转移到另一根包含 10 mL 的隐解分离缓冲液的 15 mL 锥形管。在冰上孵育这个分数。不要使用第一部分的有机体培养,因为它主要包含绒面。
- 重复步骤 3.11\u20123.13 3\u20124 次,收集每个分数并将其放在冰上。
- 通过在倒置显微镜(4x)下扫描每个馏分的200μL样本,选择富含最大百分比的肠道密码的分数。按前面描述的典型形态(图1A)10识别墓穴。
注:它们的形状呈圆形或椭圆形,并包含颗粒状的Paneth细胞。相反,villi 是手指状结构,缺少颗粒状的 Paneth 细胞(图 1B)。 - 如果需要,通过 40 μm 细胞滤网传递所选分数,以获得大小相似的密码。或者,如果小鼠被交叉到EGFP-Lgr5+背景或其他合适的模型,能够识别Lgr5+细胞2,则分离出基于绿色荧光蛋白(GFP)流式细胞测定的Lgr5+干细胞。
- 计算所选分数中的密码总数,如下所示。
- 将所选分数的移液器 50 μL 放入细胞计,并使用倒置光学显微镜 (4x) 计算密码数。使用 48 孔板进行转导实验时,每孔放置 ±100 个密码,其中 3\u20126 孔将按实验条件转导,用于基因沉默或过度表达。
- 根据每 50 μL 的密码数,计算所需的密码解散缓冲液的体积,并将该体积转移到 1.5 mL 管中。
注意:例如,每 50 μL 计算 10 个密码,300 个墓穴需要 6 x 50 μL 或 300 μL。
- 在 300 x g的 1.5 mL 管中将密码离心 5 分钟。
- 小心地丢弃上清液,轻轻移掉上部液体层,并在100μL的生长因子中重新悬浮颗粒,减少冰基膜基质(材料表)。
- 将含基质的墓穴播种到37°C预加热的48孔板(30 μL/孔,+100个基点/孔)。在标准组织培养箱中孵育板5\u201215分钟,允许基质凝胶化(37°C,5%CO2)。
- 用250μL有机体培养基(ENR)培养基覆盖每个凝胶(表1),并将48孔板放回标准组织培养箱(37°C,5%CO2)。检查24小时后,为小,圆形,囊性形状的墓穴组织的培养物;芽将在2\u20125天后形成。
- 每 3 天轻轻更换一次 ENR 介质。用柔和的吸力拆下旧的 ENR 介质,在更换介质时注意不要触摸基质。
- 通道有机体培养每4\u20127天如前所述11。
4. 有机体碎片制备
- 转导有机体一旦形成(在1\u20122周内)或通过后。对于单个转导实验,根据 +100_u2012200 有机体/孔或 +200\u2012600 有机物,在 48 孔板中制备 200\u2012600 有机体。每个条件。
- 与250μL转导介质(表1)交换ENR和转导介质中的培养,为期3天或更长时间,或直到器官采用囊状形态。在转导介质中同时包括Wnt3a和ROCK抑制剂(Y27632),以增加茎和Paneth细胞的数量;烟酰胺(尼古丁)提高培养效率(见表1中的转导介质)。
- 使用 1 mL 移液器用介质和移液器尖端机械地破裂圆顶状基底膜基质结构。
- 将有机物和介质转移到无菌的 1.5 mL 管中。
- 使用 200 μL 移液器进行移液 ,以机械方式进一步破坏基质。10μu201215 次。
- 在 RT 下以 500 x g将有机体碎片离心 5 分钟。
- 小心使用移液器丢弃上清液,并将颗粒重新悬浮在 1 mL DMEM/F12 介质中(表 1)。
- 加入分酶I(6 μL,10毫克/mL)和DNase I(2.5 μL,10毫克/mL)。使用 1 mL 移液轻轻移液,将混合良好。
- 在37°C下孵育有机体20分钟,在1.5 mL管中。
- 加入500μL的ENR介质以终止解散反应;ENR 中的血清终止反应。
- 通过20μm细胞过滤器将有机体细胞传递,并在400 x g下将有机体片段离心5分钟。
- 用150μL转导介质重新悬浮有机体片段(表1)。
5. 病毒转化的有机物或隐细胞的遗传工程
注:参见图2。
- 种子有机细胞簇与200μL转导介质/孔在48孔板和孵育在标准组织培养箱(37°C,5%CO2)。或者,将新鲜分离的墓穴细胞(+1,000个密码)放入200μL转导介质/孔中,放入48孔板中,孵育在标准组织培养箱(37°C,5%CO2)。
- 用于转导的病毒解冻小瓶,允许在48孔板中每孔转导每孔50μL的浓缩病毒,或24孔板中每孔100μL的浓缩病毒转导。
- 在1.5 mL管中用12μL的磁性纳米颗粒溶液孵育病毒15分钟(表3)。
- 将磁性纳米颗粒溶液/病毒混合物添加到要转导的细胞中。
- 将细胞培养板放在磁板上,在标准组织培养箱(37°C,5% CO2)中孵育至少2小时(最多+6小时)。
6. 受感染的有机体碎片的播种
- 将受感染的有机体细胞簇和转导介质从每个孔转移到1.5 mL管中。
- 500 x g离心 5 分钟。
- 用温和的吸力丢弃上清液,将含有颗粒的管子冷却5分钟。
- 加入120 μL的基底膜基质,通过慢慢上下移液重新悬浮颗粒。
- 种子30μL将基质细胞混合物滴入新的48孔板中。
- 在 37°C 孵育板 5\u201215 分钟,直到基质凝固。
- 向每口井添加转导介质,并在标准组织培养箱中孵育3~u20124天(37°C,CO25%)。
- 3\u20124天后,在光学显微镜(10x)下检查培养物,以确保细胞簇组织成有机体结构。然后,用250μL ENR介质轻轻更换转导介质。
- 每 3\u20124 天更换一次介质。
7. 选择(如适用)
- 2\u20123天后,在适当情况下将相关抗生素或激素加入转导培养基中进行选择。
注:我们使用紫霉素(2 μg/mL)来选择扁豆转导,因为质粒含有一个紫霉素抗基因2,14。
8. 成功转导和基因表达或沉默的确认
- 如果使用FUGW慢病毒2,14,通过荧光显微镜或流式细胞测量测量GFP信号来估计转导效率。
- 使用定量逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)验证基因过度表达或沉默,用于对照和实验有机体培养中mRNA的定量比较。
- 通过西布洛特或免疫染色2确认蛋白质编码基因表达或沉默的蛋白质水平。
9. 地下室膜基质中的有机体冷冻剖分
注:参见图3。
- 通过温和的吸力去除ENR介质,小心不要扰动地下室膜基质,用500μL的PBS轻轻洗涤一次。
- 用1.0 mL的4%甲醛(PFA)溶液(材料表)在RT上固定有机物30分钟。
- 通过吸力去除 PFA,用 1 mL PBS 轻轻洗涤两次。
- 通过吸力去除PBS,并在每个样品中加入1.0 mL的30%蔗糖缓冲液。在冷室、冰箱或冰上孵育蔗糖中固定有机物1小时,在4°C下脱水样品。
- 通过吸出蔗糖缓冲液,并添加足够多的嵌入化合物(材料表),以覆盖每个井中的基质层(+300 μL/井)。
- 在 RT 孵育 5 分钟。
- 将样品放入-80°C冷冻室10分钟,或直到嵌入化合物变成固体和白色。
- 将带有冷冻嵌入化合物的盘子放在RT处,以便沿边缘对化合物进行最小程度的熔化。使用手术刀将方块与井壁隔开。
- 使用钳子去除基体嵌入复合块,并将其放入试样块(例如低温),快速工作以防止熔化。
- 用嵌入化合物完全填充模具,并在-80°C冷冻30分钟。
- 使用块是切片或存储在-80°C冰柜进一步使用。
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Representative Results
在这里,我们描述了一种快速和高效的转导技术,该技术利用暴露于磁场的磁性纳米粒子,将慢病毒输送到感兴趣的细胞。利用现成的工具,我们不仅应用了这种方法来转导新鲜分离的密码细胞(图1A),还应用了有机物(图2)和其他耐火细胞,以用于更常规的转导方法。Lentiviral粒子可以很容易地与磁性纳米粒子结合,因此,通过使用磁板施加磁场,可以有效地传递产生的病毒-纳米粒子复合物。为了优化这种方法,我们首先测试了与GFP相连的慢病毒载体,以便GFP可用于用荧光显微镜识别转导细胞。GFP可以在器官发育的每个阶段可视化,包括早期当密码细胞组织成囊状结构(图4A),或在后期时,当器官形成芽(图4B)。成功转导的肠道器官然后可以进行功能分析,通过染色细胞膜和核来列举除系系标记外的总细胞数,如酶酶识别Paneth细胞(图 4C.
基因工程有机物可用于进一步分析,通过生成此处概述的冷冻部分(图3)。嵌入有机物后,冷冻块可以储存,然后分割,以供将来研究。这种方法也是有效的(根据GFP(+)类有机物占总器官的百分比,估计为+95%)。这种方法可以使用标准实验室试剂进行,从而提供适合各种研究的组织,包括细胞数量、细胞命运以及特定蛋白质2的存在和水平。例如,我们使用冷冻截面和免疫荧光染色来识别单个细胞并确定细胞类型(图4C)。
图1:孤立的墓穴和斜体,卡通显示典型的形态。(A) 孤立的墓穴形成圆形或椭圆形结构.(B) 维利被确定为手指状结构.比例尺 = 50 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:使用磁性纳米粒子和暴露于磁场的有机物病毒转导原理图。显示了转导协议的最关键步骤。(A) 在 1.5 mL 管中,在 RT 孵育病毒和磁性纳米颗粒溶液 15 分钟。(B) 将磁性纳米粒子/病毒混合物加入要转导的细胞中。(C) 将细胞培养板放在磁板上,在标准组织培养箱中孵育2小时。也可以使用更长的孵育时间(±6小时);代表井显示在这里的磁板上。(D) 显示了一个与病毒和磁性纳米粒子进行转导的细胞。(E) 将受感染的有机体细胞簇和转导介质从每口井转移到一个1.5 mL管中,以500 x g离心5分钟。用温和的吸力丢弃上清液,将含有冰块的管冷却5分钟。(F)加入120 μL 的基底膜基质,通过移液缓慢上下移液重新悬浮颗粒。(G) 种子滴 30 μL 含有基质-细胞混合物到每个孔在新的 48 孔板。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:3D矩阵中有机物冷冻切片的原理图。显示了冻结切片协议的最关键步骤。(A) 描绘了24孔细胞培养板内的一口井。(B) 加入刚足够的嵌入化合物,以覆盖基质层(+300 μL/井),并在RT孵育5分钟(C)将样品置于-80C的冷冻室10分钟,或直到嵌入化合物变成固体和白色。接下来,将盘子放在 RT 处,以便沿着样品的边缘稍微融化。(D) 使用手术刀将方块与井壁分开。(E) 使用钳子取出基质嵌入复合块,并放置在适当的浅容器或模具中,以冷冻组织。用嵌入化合物 (OCT) 完全填充模具。(F) 在 -80 C 冷冻块在冰柜中冷冻 30 分钟 (G) 该块已准备好分段或储存在-80 C 冰柜中供进一步使用。请点击此处查看此图的较大版本。
图4:转导肠道器官的代表性图像。(A) 在光显微镜下显示(左)荧光显微镜的小肠道器官的代表性图像,以及(右)转导后第3天转基因表达(EGFP)的标准显微镜。刻度条 = 50 μm (B) 使用磁性纳米粒子转导后在有机体中过度表达基因编码 GFP 的示例。有机体细胞与表达GFP(FUGW) 的慢病毒转导;顶部)或慢病毒过度表达Hmga1 (FUGW-Hmga1;底部)如转导后第 12 天所示。刻度条 = 50 μm. (C) 有机物的正式固定冷冻部分的免疫荧光成像。有机体部分(4 μm)被染色的抗酶(红色),抗EpCAM(绿色)和DAPI(蓝色)。EpCAM划定细胞边界,DAPI指示单个核,和酶染色窗格细胞。比例尺 = 50 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
| 有机体培养基(ENR) | 100 mL |
| DMEM/F12+ | 96 mL |
| L-阿兰尼-L-谷氨酰胺二肽补充剂(例如谷氨酸) | 1 mL |
| 国家能源局 | 1 mL |
| 笔/链球 | 1 mL |
| 赫佩斯 | 1 mL |
| EGF (100 μg/ mL) | 5 μL |
| 诺金 (100 μg/ mL) | 10 μL |
| R-斯蓬丁 (100 μg/ mL) | 10 μL |
| 或 R-斯蓬丁条件介质 (CM) | 20 mL |
| 人体重组胰岛素(10毫克/mL) | 5 μL |
| 转导介质 | 5 mL |
| ENR 介质 | 2.4 mL |
| Wnt 条件介质 (CM) | 2.5 mL |
| 烟酰胺 (1M) | 100 μL |
| Y27632 (10 μM) | 10 μL |
| 隐解分离缓冲器 | 100 mL |
| PBS (不含 Ca2+,Mg2+) | 99 mL |
| 笔/链球 | 1 mL |
| 0.5 米 EDTA | 100 μL |
| 0.1 M DTT(二硫二醇) | 100 μL |
| 293T 介质 | 100 mL |
| DMEM | 90 mL |
| FBS | 10 mL |
| 病毒收集介质 | 100 mL |
| DMEM | 99 mL |
| FBS | 1 mL |
| 有机体消化缓冲液 | 1 mL |
| DMEM/F12+ | 1 mL |
| 脱脂I (10毫克/毫克) | 6 μL |
| 脱氧核糖核酸I (10毫克/毫克) | 2.5 μL |
表 1:协议中使用的媒体。
| 板 | 10 厘米 | 15 厘米 |
| 伦蒂病毒转导载体 | 6 μg | 9 μg |
| CMV_R8.91 | 8 μg | 12 μg |
| Md。G | 2 μg | 3 μg |
| 矢量总数 | ±16 μg | ±24 μg |
表2:用于转染的质粒DNA数量。
| 板 | 磁珠 (μL) | 病毒体积 (μL) | 最终转导体积 (μL) |
| 48-well | 6 | 50 | 55W |
| 24-well | 12 | 100 | 500 |
表3:磁珠溶液和矢量体积。
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Discussion
成人肠道上皮作为有机物的初级培养物为研究干细胞功能、肠道上皮平衡和病理学1、2、3、病理的分子机制提供了强有力的工具。 4.虽然CRISPR/Cas9技术可用于基因工程有机物9,但它受到基于序列分析的广泛筛选和选择所需的广泛筛选和选择的限制。该协议的目的是提供清晰和简洁的说明,通过视频教程将慢透或逆转录病毒传送到肠道器官,然后冷冻切片进行进一步分析。
该协议是一种快速而有效的方法,用于对肠道器官进行基因工程,并分析基因过度表达或从冷冻部分沉默的后果。关键步骤如图2,图3。 这种策略允许研究在3D条件下培养的肠道干细胞及其后代的遗传改变(过度表达或沉默)的生物意义。我们还利用这种基于磁性纳米粒子的病毒载体,在体外增强细胞转导和异质表达,在体外不同原细胞2,13。
采用这种方法,病毒粒子被涂上磁性纳米粒子,并通过暴露于磁场而输送到细胞。与目前的转导方法相比,如含有或不带脊柱传播的聚苯乙烯10,15,磁性纳米粒子-病毒复合物对细胞的毒性较小,因为遗传物质的接受是通过内细胞传播和pinocytois,两种自然发生的生物过程,不会引起细胞膜的显著损伤。因此,细胞的存活性和转导效率都得到提高。转导效率可以进一步提高使用小密码碎片或单个细胞(见步骤4.8),而不是较大的墓穴或整个有机体,如前2,10,13,16报告。磁导纳米粒子传递导致病毒载体快速积累、渗透和被活到目标细胞2、13。磁性纳米粒子由氧化铁制成,完全可生物降解,并涂有特定的专有阳离子分子。纳米粒子与病毒载体的关联是通过盐诱导的胶体聚集和静电相互作用实现的。然后,纳米粒子通过放置在培养盘下的磁板产生的外部磁场集中到细胞上。虽然转导效率接近95%,但并非所有细胞都是转导的,这是该技术的一个限制。此外,内源表达的感兴趣基因不会像CRISPR/Cas9方法一样改变。
在基因过度表达或沉默之后,有机体可用于无数的研究,这取决于科学目标,包括基因表达分析、细胞内蛋白质组改变或细胞分泌物、代谢改变,以及形态变化。与活组织一样,冷冻部分可用于特定蛋白质(如转录因子、细胞质分子或细胞表面标记物)的免疫组织化学和免疫荧光研究。我们的文章包括一种有效的方法,在不干扰其在 3D 文化中的位置和组织的情况下,从有机体中获取冷冻部分。这是有利的,因为以前的技术要求在冻结16之前从基底膜基质去除有机体。通过从基质中取出器官处理有机体会破坏有机体的结构组织,而不是反映体外生长和发育。
这种对基因工程师肠道有机体的协议也可以适应研究其他基于细胞的模型和有机体系统。例如,胰腺、结肠、肝、心和脑器官系统可以通过这种方法进行转导。即使在更标准的培养技术下生长的细胞也适合纳米粒子技术。此外,这种方法还可用于研究疾病的分子机制,不仅在干细胞衍生的有机体系统,而且在肿瘤器官。
总之,这些协议中描述的肠道器官研究的关键修改有望使科学家能够阐明重要因素和下游途径在肠道干细胞及其后代生物学中的作用.这些方法应提供手段,以更多地了解在生理和病理条件下的自我更新、细胞命运确定、组织平衡和肠道上皮再生的分子机制。
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Disclosures
作者没有什么可透露的
Acknowledgments
这项工作得到了国家卫生研究院(R01DK102943、R03CA182679、R03CA191621)、马里兰干细胞研究基金(2015-MSCRFE-1759,2017-MSCRFD-3934)、美国肺协会、Allegheny健康网络- 约翰斯的资助。霍普金斯研究基金和霍普金斯消化系统疾病基础研究核心中心。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Base medium for 293T cells |
| DMEM/F12+ | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer |
| OPTI-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Virus plasmids transfection medium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | Component of virus collection medium and 293T medium |
| Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer |
| PBS (without Ca2+, Mg2+) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | A wash buffer and component of crypt dissociation buffer |
| Mem-NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Component of organoid culture medium |
| GlutamaxII | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Component of organoid culture medium |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Component of organoid culture medium |
| EGF | Millipore Sigma | E9644 | Component of organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 250-38 B | Component of organoid culture medium |
| R-spondin | R&D | 7150-RS-025/CF | Component of organoid culture medium |
| Human recombinant insulin | Millipore Sigma | I9278-5ml | Component of organoid culture medium |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N3376-100G | Component of Transduction medium |
| Wnt3A | R&D | 5036-WN-010 | Component of Transduction medium |
| Y27632 | Millipore Sigma | Y0503-1MG | Component of Transduction medium |
| 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Component of Crypts dissociation buffer |
| DTT (dithiothreitol) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | Component of Crypts dissociation buffer |
| Dispase I | Millipore Sigma | D4818-2MG | Component of organoid digestion buffer |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Component of organoid digestion buffer |
| matrigel(Growth factor reduced) | Corning | 356231 | Used as a matrix to embed organoids |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Medium for transfection in viral production |
| ViralMag R/L | Oz Biosiences | RL40200 | Magnetic particles of viral transduction |
| Magnetic plate | Oz Biosiences | MF10000 | Magnetic plate to facilitate viral transduction |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Transfection agent in viral production |
| Poly-D-Lysine | Millipore Sigma | A-003-E | Coating for plates before seeding 293T cells |
| 4% Formaldehyde Solution | Boster | AR1068 | Solution to fix organoids |
| O.C.T embedding compound | Thermo Fisher Scientific | 4583S | For embedding of the the organoids |
| 5 mL Falcon polystyrene tubes | Corning | 352054 | |
| 50 mL Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.100 | |
| Orbitron rotator II Rocker Shaker | Boekel Scientific | 260250 | |
| Olympus Inverted microscop CK30 | Olympus | CK30 | for scanning and counting crypts |
| Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence | Nikon | Axiovert 200 | for viewing fluorescence in the crypts |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane | Milipore Sigma | UFC910024 | For concentrating viruses |
| pluriStrainer 20 µm (Cell Strainer) | pluriSelect | SKU 43-50020 | For preparing organoid fragments |
| Falcon Cell Strainer | Fisher Scientific | 352340 | For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid) | Millipore Sigma | M8937-100EA | ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments |
| Animal strain: C57BL/6J | Jackson Lab | #000664 | For organoid culture |
References
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