Summary
Describimos instrucciones paso a paso para: 1) diseñar de manera eficiente organoides intestinales utilizando nanopartículas magnéticas para la transducción lenti- o retroviral, y, 2) generar secciones congeladas a partir de organoides diseñados. Este enfoque proporciona una poderosa herramienta para alterar eficientemente la expresión génica en organoides para la investigación de los efectos posteriores.
Abstract
Los cultivos organoides intestinales proporcionan una oportunidad única para investigar la biología intestinal de células madre y criptas in vitro, aunque los enfoques eficientes para manipular la expresión génica en organoides han hecho progresos limitados en esta arena. Si bien la tecnología CRISPR/Cas9 permite la edición precisa del genoma de las células para la generación de organoides, esta estrategia requiere una amplia selección y cribado por análisis de secuencia, que requiere mucho tiempo y es costoso. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para la transducción viral eficiente de organoides intestinales. Este enfoque es rápido y altamente eficiente, disminuyendo así el tiempo y los gastos inherentes a la tecnología CRISPR/Cas9. También presentamos un protocolo para generar secciones congeladas de cultivos organoides intactos para su posterior análisis con tinción inmunohistoquímica o inmunofluorescente, que se puede utilizar para confirmar la expresión génica o el silenciamiento. Después de lograr una transducción exitosa de vectores virales para la expresión génica o silenciamiento, se puede evaluar rápidamente la función de células madre intestinales y criptas. Aunque la mayoría de los estudios organoides emplean ensayos in vitro, los organoides también pueden ser entregados a ratones para análisis funcionales in vivo. Además, nuestros enfoques son ventajosos para predecir las respuestas terapéuticas a los fármacos porque las terapias disponibles actualmente generalmente funcionan modulando la expresión génica o la función proteica en lugar de alterar el genoma.
Introduction
La capacidad de cultivar células de ratones o criptas humanas como organoides tridimensionales (3D) desde el intestino delgado o el colon durante períodos de tiempo prolongados proporcionó un gran avance porque estos cultivos muestran características definitorias del epitelio intestinal in vivo 1 , 2 , 3. Los organoides derivados de las criptas primarias son capaces de auto-renovación y auto-organización, exhibiendo funciones celulares similares a sus tejidos de origen. De hecho, los organoides recapitulan no sólo la organización estructural de las criptas in vivo, sino también muchas características moleculares, proporcionando así herramientas útiles para estudiar la biología normal y los estados de enfermedad. Para ilustrar, estudios organoides han revelado nuevas vías moleculares implicadas en la regeneración tisular1,2,3,4,5 así como fármacos que podrían mejorar la función en ajustes patológicos6,7.
El estudio de las células madre intestinales es de particular interés porque el revestimiento intestinal se encuentra entre los tejidos de mamíferos más altamente regenerativos, renovándose cada 3-5 días para proteger el organismo de bacterias, toxinas y otros patógenos dentro de la lúmenes intestinales. Las células madre intestinales (ISC) son responsables de esta notable capacidad regenerativa y por lo tanto proporcionan un paradigma único para el estudio de la función de células madre adultas1,2. Los experimentos de trazado de linaje en ratones demostraron que se pueden cultivar células madre aisladas lgr5 positivas para generar organoides 3D o "mini-guts" in vitro donde reflejan de cerca sus contrapartes in vivo. Los cultivos organoides también pueden derivarse de aislados celulares de cripta intestinal compuestos por progenitores, ISC y células Depanet, los cuales constituyen las células de nicho epitelial in vivo. De hecho, el cultivo organoide a partir de células de cripta intestinal primaria ha evolucionado hasta convertirse en una técnica relativamente rutinaria que es fácil de implementar en la mayoría de los laboratorios utilizando reactivos ampliamente disponibles. Este modelo también es susceptible al análisis cuantitativo de la expresión génica mediante la secuenciación de ARN (RNA-Seq) y proteínas por espectrometría de masas, inmunohistoquímica o tinción inmunofluorescente2,4,8. Además, la genética funcional se puede estudiar utilizando enfoques de ganancia de función (sobreexpresión genética o expresión de un gen mutante activador) o pérdida de función (silenciamiento del gen o expresión de un mutante de pérdida de función)2.
Es importante destacar que la baja eficiencia y la alta toxicidad del ADN plásmido estándar o los protocolos de transducción viral con polibrino siguen siendo un obstáculo importante en el campo. Aunque la tecnología CRISPR/Cas9 permite una edición precisa del genoma, este enfoque requiere una selección que requiere mucho tiempo seguida de la validación de secuencias9. Aquí, presentamos un protocolo de transducción viral para organoides intestinales primarios que optimiza la entrega de partículas virales por conjugación a nanopartículas magnéticas y aplicación de un campo magnético. Se proporcionan modificaciones clave a los protocolos anteriores4,5,10,11,12,13 y recomendaciones para mejorar la eficiencia. También describimos un enfoque para generar secciones congeladas a partir de organoides intactos cultivados en matrigael 3D (en adelante, matriz o matriz de membrana de sótano) para su posterior análisis con inmunohistoquímica o tinción inmunofluorescente.
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Protocol
Este protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de las Instituciones Médicas Johns Hopkins (IACUC). Este protocolo se modifica a partir de los métodos publicados anteriormente10,11,12,13.
1. Preparación de reactivos
- Preparar el medio 293T fresco varias horas de antelación y calentar a 37 oC en un baño de agua durante al menos 10 minutos antes de su uso (Tabla 1).
- Preparar el ADN plásmido2,13,14 para el embalaje viral. (Tabla 2).
- Adquirir todos los demás materiales necesarios (Tablade Materiales).
2. Producción de partículas de Lentivirus o Retrovirus
- Sembrado de células 293T de riñón embrionario humano (HEK) (Día 1)
- Preparar un plato de cultivo de 150 mm mediante un recubrimiento con 50 g/ml de poli-D-lisina disuelta en solución salina tamponada de fosfato (PBS; 10 mL/plato) durante 1 h a temperatura ambiente (RT).
- Retire la solución salina tamponada de fosfato (PBS)/poli-D-lisina y lave el plato recubierto dos veces con 5 ml de PBS.
- Células semilla 293T (8-u201210 x 106) en el medio 293T (Tabla1) a un volumen total de 15 ml.
- Cultivo de células 293T durante la noche en una incubadora de cultivo de tejido estándar (37 oC, 5% CO2).
- Transfección celular HEK 293T (Día 2)
- Realizar la transfección una vez que las células han alcanzado 70-80% de confluencia (generalmente alrededor de 24 h después de la sembración 8 -u201210 x 106 células).
- Preparar la mezcla de transfección utilizando un enfoque eficiente, como una formulación de liposoma catiónico comercial (Tablas 1-u20122, Tabla de Materiales)2.
- El ADN de lentivirus diluido construye12 (adn plásmido total de 24 g, Tabla 2) en 1,2 ml de medio de transfección e incuba durante 5 minutos a RT en tubos de 1,5 ml (Tablade materiales).
- Diluir el regente de la transfección (36 l) en 1,2 ml de medio de transfección (Tablade materiales)e incubar en tubos de 5 ml durante 5 min de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Agregue el reactivo de lentivirus (paso 2.2.2.1) al reactivo de transfección (paso 2.2.2.2) y mezcle suavemente con tuberías lentas hacia arriba y hacia abajo utilizando un pipeta de 5 ml.
- Incubar la mezcla durante 20 min a RT.
- Lavar suavemente 293T células con 5 ml de medio de transfección y reemplazar por 10 ml de medio de transfección.
- Agregue los complejos de lípidos de ADN (del paso 2.2.2.3) con gota al medio de las células 293T y mezcle cuidadosamente los medios en los platos de cultivo moviéndose en direcciones horizontales y verticales para garantizar una distribución equitativa de los complejos de LÍpidos de ADN en cada plato.
- Incubar durante 6 h en una incubadora de cultivo de tejido estándar (37 oC, 5% CO2).
- Después de la incubación, sustituya los medios por un medio de recolección de virus frescos de 20 ml (Tabla 1).
- Recopilación de virus (Días 3-u20125)
- Recoger los medios de virus en tubos de 50 ml y almacenar en un refrigerador de 4 oC para una mayor concentración.
- Sustituya 20 ml de medio de recolección de virus frescos cada 24 h y cultivo durante la noche (24 h). Repita la recopilación de medios durante los próximos 2 días (Días 4-u20125).
- Asegúrese de que el volumen total del medio recogido después del día 5 es de 60 ml (20 ml/día x 3 días).
- Concentración de virus (Día 5)
- Centrifugar el medio recogido (60 ml) durante 5 min a 400 x g. Luego, pasa el sobrenadante a través de un filtro (0,45 m de poros) para eliminar los restos celulares.
- Concentrar el virus añadiendo 15 ml de medios de virus filtrados en una unidad de filtro centrífugo (Tabla de materiales). Centrífuga a 2.500 x g durante 15 min a 4oC. Debido a que el virus no puede pasar a través de este filtro, se concentrará en la cámara superior del filtro.
- Aspirar el flujo desde el tubo (cámara inferior) y añadir otros 15 ml de sobrenadante de medios de recolección viral restante a la misma unidad de filtro centrífugo. Centrífuga como se ha mencionado anteriormente (2.500 x g durante 15 min a 4 oC) para concentrar el virus adicional del sobrenadante.
- Repita el proceso utilizando el mismo filtro para medios de 60 ml a partir de una sola placa transducida hasta que se alcance la concentración deseada (100 veces).
Nota: Normalmente concentramos 60 ml de medios de recopilación de virus a 600 ml. - Retire el virus concentrado de la cámara superior del filtro utilizando un pipeta de 1 ml, luego alícuota y guárdelo en tubos de 1,5 ml (50 u201260 l/tubo) a -80 oC para su uso posterior. Almacene las partículas concentradas durante un máximo de 6 u201212 meses.
3. Aislar criptas
- Euthanizar ratones usando CO2 de acuerdo con las directrices locales de la IACUC.
- Coloque el animal eutanasiado sobre su espalda y lave el abdomen rociando con 70% de etanol.
- Realizar una incisión longitudinal de línea media desde el esternón hasta la ingle, incisiendo la piel primero, y luego el tejido subcutáneo.
- Retire el intestino delgado del estómago al cecum.
- Identificar regiones de interés dentro del intestino delgado; criptas pueden aislarse del duodeno, el yeyuno y el íleon.
- Con una jeringa de 10 ml, enjuague el intestino delgado aislado con tampón de disociación de cripta (PBS preenfriado que contiene 1 mM de ditilotitoito (TDT), 1% penicilina/estreptomicina (no Ca2+ y Mg2+)) en un plato de cultivo tisular de 10 cm (Tabla 1)
- Retire el tejido graso periférico y abra o "revuelva" el tejido intestinal longitudinalmente sobre una placa de vidrio estéril (15 cm x 15 cm).
- Raspar suavemente las vellosidades epiteliales intestinales usando un rascador celular.
- Cortar el intestino delgado en secciones longitudinales de 2-u20123 cm.
- Transfiera el tejido a un tubo de 15 ml que contenga PBS preenfriado utilizando fórceps planos (116 mm). Lavar los fragmentos de tejido agitando vigorosamente con la mano durante 30 s (moviendo el tubo en direcciones opuestas 60 veces).
- Actualice el PBS y repita el lavado hasta que el PBS se aclare.
Nota: Normalmente lavamos los fragmentos 2-u20123 veces. - Incubar el tejido en un tubo cónico de 15 ml que contenga 10 ml de tampón de disociación de cripta (Tabla 1) durante 10 minutos a 4 oC en un agitador orbital a velocidad media una vez que el PBS esté despejado.
- Agitar vigorosamente el tubo a mano durante 30 s (direcciones opuestas 60 veces) y transferir el tejido usando fórceps planos a otro tubo cónico de 15 ml que contenga 10 ml de tampón de disociación de cripta. Incubar esta fracción sobre hielo. No utilice la primera fracción para el cultivo organoide porque contiene principalmente vellosidades.
- Repita los pasos 3.11-u20123.13 para 3-u20124 veces, recogiendo cada fracción y colocándolas en hielo.
- Seleccione la fracción que se enriquece con el mayor porcentaje de criptas intestinales escaneando muestras de 200 ml de cada fracción bajo un microscopio invertido (4x). Identifique las criptas por la morfología típica como se describió anteriormente (Figura1A)10.
NOTA: Aparecerán redondas u ovaladas en forma y contendrán células Deletadas. Por el contrario, las vellosidades son estructuras similares a los dedos que carecen de las células Paneth granulares (Figura1B). - Pase la fracción seleccionada a través de un colador de células de 40 m para obtener criptas de tamaño similar si es necesario. Alternativamente, aísle las células madre Lgr5+ basadas en la citometría de flujo para proteína fluorescente verde (GFP) si los ratones se cruzan en el fondo EGFP-Lgr5+ u otro modelo adecuado que permita la identificación de las células Lgr5+2.
- Cuente el número total de criptas en la fracción seleccionada de la siguiente manera.
- Pipetear 50 l de la fracción seleccionada en un hemocitómetro y contar el número de criptas utilizando un microscopio de luz invertida (4x). Coloque 100 criptas por pozo cuando utilice una placa de 48 pocillos para permitir los experimentos de transducción en los que se transducirán los pozos 3.u20126 por condición experimental para silenciar genes o sobrerexpresión.
- Basándose en el número de criptas por 50 l, calcule el volumen de búfer de disociación de criptas necesario y transfiera ese volumen a un tubo de 1,5 ml.
Nota: Por ejemplo, se cuentan 10 criptas por 50 l, se necesitan 6 x 50 l o 300 l para 300 criptas.
- Centrifugar las criptas en los tubos de 1,5 ml a 300 x g durante 5 min.
- Deseche cuidadosamente el sobrenadante pipeteando suavemente la capa líquida superior y resuspenda el pellet en 100 oL de factor de crecimiento reducido de la matriz de membrana del sótano sobre hielo (Tablade materiales).
- Sembrar las criptas que contienen matriz en una placa precalentada de 48 pocillos (30 ol/pozo, 100 criptas/pozo). Incubar la placa en una incubadora de cultivo de tejido estándar durante 5 u201215 min para permitir la gelación de la matriz (37 oC, 5% CO2).
- Superponga cada gel con un cultivo organoide de 250 l (ENR) medio (Tabla1) y vuelva a colocar las placas de 48 pocillos en una incubadora de cultivo de tejido estándar (37 oC, 5% CO2). Compruebe los cultivos para la organización de la cripta en formas pequeñas, redondas y quísticas después de 24 h; se formarán después de 2 u20125 días.
- Reemplace suavemente los medios ENR cada 3 días. Retire los medios ENR viejos con succión suave, teniendo cuidado de no tocar la matriz al reemplazar los medios.
- Pasaje de cultivos organoides cada 4-u20127 días como se describió anteriormente11.
4. Preparación de fragmentos organoides
- Transducir los organoides una vez que se forman (dentro de 1-u20122 semanas) o después de ser pasados. Para un solo experimento de transducción, prepare 2-u20123 pozos de organoides cultivados en una placa de 48 pocillos por condición con organoides/pozos de 100 o2012200 o organoides de 200 a 200-u2012600 por condición de transducción experimental.
- Intercambie ENR con medios de transducción de 250 l (Tabla1) y cultivo en los medios de transducción durante 3 o más días o hasta que los organoides adopten una morfología quística. Incluir wnt3a e inhibidor DE ROCK (Y27632) en el medio de transducción para aumentar el número de células madre y Paneth; La nicotinamida (Nic) mejora la eficiencia del cultivo (véase el medio de transducción en la Tabla1).
- Romper mecánicamente la estructura de matriz de membrana de sótano similar a la cúpula con medios y una punta de pipeteo utilizando un pipeta de 1 ml.
- Transfiera los organoides y los medios a un tubo estéril de 1,5 ml.
- Interrumpe mecánicamente la matriz aún más al pipetear con un pipeteo de 200 l de 10 a 20 1215 veces.
- Centrifugar los fragmentos organoides a RT a 500 x g durante 5 min.
- Deseche el sobrenadante cuidadosamente con una pipeta y vuelva a suspender el pellet en un medio DMEM/F12 de 1 ml (Tabla 1).
- Añadir Dispase I (6 l a 10 mg/ml) y DNase I (2,5 oL a 10 mg/ml). Mezcle bien pipeteando suavemente con un pipeta de 1 ml.
- Incubar organoides a 37oC durante 20 min en el tubo de 1,5 ml.
- Añadir 500 s de medios ENR para terminar la reacción de disociación; el suero en el ENR termina la reacción.
- Pasar las células organoides a través de un colador celular de 20 m y centrifugar los fragmentos organoides a 400 x g durante 5 min.
- Resuspender fragmentos organoides con medio de transducción de 150 l (Tabla1).
5. Ingeniería Genética de Organoides o Células Criptas por Transducción Viral
NOTA: Vea la figura2.
- Secúmulos de células organoides de semilla con medio/pozo de transducción de 200 l en una placa de 48 pocillos e incubar en una incubadora de cultivodeta tisular estándar (37 oC, 5% CO2). Alternativamente, coloque las células de la cripta recién aisladas (1.000 criptas) en un medio/pozo de transducción de 200 ol en una placade 48 pocillos e incubar en una incubadora de cultivo de tejido estándar (37 oC, 5% CO 2).
- Estresa los viales de virus para la transducción, lo que permite una transducción de cada pocal en placas de 48 pocillos o 100 ol de virus concentrados por poca en placas de 24 pocillos.
- Virus de incubación con 12 ml de solución de nanopartículas magnéticas durante 15 minutos a RT en un tubo de 1,5 ml (Tabla3).
- Agregue la mezcla magnética de nanopartículas/virus a las células a transdujeras.
- Colocar la placa de cultivo celular en una placa magnética e incubar durante al menos 2 h (y hasta 6 h) en una incubadora de cultivo de tejido estándar (37 oC, 5% CO2).
6. Sembración de fragmentos organoides infectados
- Transfiera los cúmulos de células organoides infectadas y los medios de transducción de cada pozo a un tubo de 1,5 ml.
- Centrífuga a 500 x g durante 5 min.
- Deseche el sobrenadante con succión suave y enfríe el tubo que contiene el pellet sobre hielo durante 5 min.
- Añadir 120 l de matriz de membrana de sótano y resuspender el pellet pipeteando lentamente hacia arriba y hacia abajo.
- Semillas de 30 l de la mezcla matriz-célula en una nueva placa de 48 pocillos.
- Incubar la placa a 37oC durante 5oC 201215 min hasta que la matriz se solidifique.
- Añadir medio de transducción a cada pocal e incubar en una incubadora de cultivo de tejido estándar durante 3 u20124 días (37 oC, 5% CO2).
- Después de 3 u20124 días, inspeccione los cultivos bajo un microscopio de luz (10x) para asegurar la organización de los racimos celulares en estructuras organoides. A continuación, sustituya suavemente los medios de transducción por un medio ENR de 250 ml.
- Sustituya los medios cada 3 a 20124 días.
7. Selección (si procede)
- Después de 2 u20123 días, agregue antibióticos u hormonas relevantes para su selección al medio de transducción si procede.
NOTA: Utilizamos puromicina (2 g/ml) para la selección de la transducción lentivrial porque los plásmidos albergaban un gen de resistencia a la puromicina2,14.
8. Confirmación de la transducción exitosa y la expresión génica o silenciamiento
- Si utiliza fuGW lentivirus2,14, estimar la eficiencia de transducción mediante la medición de señales GFP a través de microscopio fluorescente o citometría de flujo.
- Validar la sobreexpresión o silenciamiento genético utilizando la reacción en cadena cuantitativa de la transcriptasa polimerasa (RT-PCR) para la comparación cuantitativa de ARNm en los cultivos de control y organoides experimentales.
- Confirmar los niveles de proteína para la expresión génica de codificación de proteínas o silenciamiento por Western Blot o inmunostaining2.
9. Criosección organoideense en matriz de membranasótano
NOTA: Vea la figura3.
- Retire el medio ENR por succión suave, teniendo cuidado de no perturbar la matriz de membrana del sótano y lave suavemente una vez con 500 ol de PBS.
- Fijar organoides con 1,0 ml de solución de paraformaldehído (PFA) al 4% (Tablade materiales)en RT durante 30 min.
- Retire la PFA por succión y lave suavemente dos veces con 1 ml de PBS.
- Retire el PBS por succión y agregue 1.0 mL de 30% tampón de sacarosa a cada muestra. Incubar organoides fijos en sacarosa durante 1 h a 4 oC en una cámara frigorífica, refrigerador o en hielo para deshidratar muestras.
- Retire el tampón de sacarosa por succión y agregue suficiente compuesto de incrustación (Tablade materiales)para cubrir la capa de matriz (300 l/pozo) en cada pocil.
- Incubar a RT durante 5 min.
- Coloque las muestras en un congelador de -80 oC durante 10 minutos, o hasta que el compuesto de incrustación se vuelva sólido y blanco.
- Coloque el plato con compuesto de incrustación congelado en RT para permitir una fusión mínima del compuesto a lo largo de los bordes. Utilice un bisturí para separar el bloque de las paredes del pozo.
- Retire el bloque compuesto de incrustación de matriz utilizando fórceps y colóquelo en un bloque de muestras (por ejemplo, criomold), trabajando rápidamente para evitar el derretimiento.
- Llenar el molde completamente con compuesto de incrustación y congelar a -80 oC durante 30 min.
- El uso del bloque es para seccionar o almacenar en un congelador de -80 oC para su uso posterior.
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Representative Results
Aquí, describimos una técnica de transducción rápida y altamente eficiente que aprovecha las nanopartículas magnéticas expuestas a un campo magnético para entregar lentivirus a las células de interés. Con las herramientas fácilmente disponibles, hemos aplicado este enfoque no sólo para transducir células criptopeticas recién aisladas (Figura1A),sino también para organoides (Figura2)y otras células que son refractarias a enfoques de transducción más rutinarios. Las partículas lentivirales se pueden conjugar fácilmente con nanopartículas magnéticas y los complejos virus-nanopartículas resultantes se entregan eficientemente aplicando un campo magnético utilizando una placa magnética. Para optimizar este enfoque, probamos primero vectores lentivirales vinculados a GFP de tal manera que GFP pudiera utilizarse para identificar células transducidas con microscopía de fluorescencia. El GFP se puede visualizar en cada etapa del desarrollo de organoides, incluso al principio cuando las células de la cripta se organizan en estructuras similares a quistes (Figura4A),o en momentos posteriores cuando los organoides forman brotes (Figura4B). Los organoides intestinales transducidos con éxito pueden someterse a análisis funcionales de alteraciones en el desarrollo mediante la tinción de las membranas celulares y los núcleos para enumerar el número total de células además de los marcadores de linaje, como la lisozima para identificar las células de Paneth ( Figura 4C).
Los organoides genéticamente modificados se pueden utilizar para un análisis posterior mediante la generación de secciones congeladas como se describe aquí (Figura3). Después de incrustar organoides, los bloques congelados se pueden almacenar y seccionarse más tarde para futuros estudios. Este enfoque también es eficiente (se estima que es del 95 % en función del porcentaje de organoides de GFP (+) y los organoides totales). Este enfoque se puede realizar con reactivos de laboratorio estándar, proporcionando así tejidos que son susceptibles adiversas investigaciones, incluyendo el número celular, el destino celular, y la presencia y los niveles de proteínas específicas 2. Por ejemplo, utilizamos secciones congeladas y tinción inmunofluorescente para identificar células individuales y determinar el tipo de célula (Figura4C).
Figura 1: Criptas aisladas y vellosidades con caricaturas que muestran morfología típica. (A) Las criptas aisladas forman estructuras redondas u ovaladas. (B) Villi se identifican como estructuras similares a los dedos. Barra de escala de 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Esquema de transducción viral de organoides utilizando nanopartículas magnéticas y exposición a un campo magnético. Se muestran los pasos más críticos del protocolo de transducción. (A) Incubar virus y solución de nanopartículas magnéticas durante 15 minutos a RT en un tubo de 1,5 ml. (B) Añadir la mezcla magnética de nanopartículas/virus a las células a transdujeras. (C) Coloque la placa de cultivo celular en la placa magnética e incubar durante 2 h en una incubadora de cultivo de tejido estándar. También se pueden utilizar tiempos de incubación más largos (6 h); el pozo representativo se muestra aquí en la placa magnética. (D) Se muestra una célula que se está transduciendo con el virus y la nanopartícula magnética. (E) Transferir los cúmulos de células organoides infectadas y los medios de transducción de cada pocal en un tubo de 1,5 ml y centrífuga a 500 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante con succión suave y enfríe el tubo que contiene el pellet sobre hielo durante 5 min. (F) Añadir 120 l de matriz de membrana del sótano y resuspender el pellet pipeteando lentamente hacia arriba y hacia abajo. (G) Gotas de semillas de 30 ol que contienen mezcla de matriz-célula en cada pocto en una nueva placa de 48 pocillos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Esquema de la sección congelada de organoides en matriz 3D. Se muestran los pasos más críticos del protocolo de seccionamiento congelado. (A) Se representa un solo pozo dentro de una placa de cultivo de celda de 24 pocillos. (B) Añadir suficiente compuesto de incrustación para cubrir la capa de matriz (300 l/pozo) e incubar a RT durante 5 min. (C) Coloque las muestras a -80 C en un congelador durante 10 minutos o hasta que el compuesto de incrustación se vuelva sólido y blanco. A continuación, coloque el plato en RT para permitir un ligero derretimiento a lo largo de los bordes de la muestra. (D) Utilice un bisturí para separar el bloque de las paredes del pozo. (E) Retire el bloque compuesto de incrustación de matriz utilizando fórceps y colóquelo en un recipiente o molde superficial apropiado para congelar los tejidos. Llene el molde completamente con compuesto de incrustación (OCT). (F) Congelar bloque a -80 C en un congelador durante 30 min. (G) El bloque está listo para la sección o el almacenamiento en el congelador de -80 C para su uso posterior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imágenes representativas de organoides intestinales transducidos. (A) Imagen representativa de pequeños organoides intestinales bajo microscopio de luz que muestra la microscopía de fluorescencia (izquierda) y, (derecha) microscopía estándar de expresión transgénica (EGFP) en el día 3 después de la transducción. Barra de escala de 50 m. (B) Ejemplo de sobreexpresión de GFP de codificación genética en organoides después de la transducción utilizando nanopartículas magnéticas. Las células organoides fueron transducidas con lentivirus que expresaban GFP (FUGW; Top) o lentivirus sobreexpresando Hmga1 (FUGW-Hmga1; Inferior) como se muestra en el día 12 después de la transducción. Barra de escala a 50 m. (C) Imagen de inmunofluorescencia de la sección congelada fija de formalina de los organoides. Las secciones organoides (4 m) se tiñeron con anti-lisozyme (rojo), anti-EpCAM (verde) y DAPI (azul). EpCAM demarca los bordes de las celdas, DAPI indicó núcleos individuales y las células de Paneth de las manchas de lisozyma. Barra de escala de 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Medio de cultivo organoide (ENR) | 100 ml |
| DMEM/F12+ | 96 mL |
| Suplemento de dipéptido de L-asiell-L-glutamina (por ejemplo, Glutamax) | 1 mL |
| NEAA | 1 mL |
| Pluma/Strep | 1 mL |
| HEPES | 1 mL |
| EGF (100 g/mL) | 5 l |
| Noggin (100 g/mL) | 10 l |
| R-espondina (100 g/ml) | 10 l |
| o medio de condición De R-spondin (CM) | 20 mL |
| Insulina recombinante humana (10 mg/ml) | 5 l |
| Medio de transducción | 5 mL |
| Medio ENR | 2,4 ml |
| Medio de condición wnt (CM) | 2,5 ml |
| Nicotinamida (1M) | 100 l |
| Y27632 (10 m) | 10 l |
| Búfer de disociación de criptas | 100 ml |
| PBS (sin Ca2+, Mg2+) | 99 mL |
| Pluma/Strep | 1 mL |
| 0.5 M EDTA | 100 l |
| 0,1 TDT M (dititothreitol) | 100 l |
| 293T medio | 100 ml |
| DMEM | 90 mL |
| Fbs | 10 mL |
| Medio de recolección de virus | 100 ml |
| DMEM | 99 mL |
| Fbs | 1 mL |
| Tampón de digestión organoide | 1 mL |
| DMEM/F12+ | 1 mL |
| Dispensar I (10 mg/ml) | 6 L |
| Adnsa I (10 mg/mL) | 2,5 l |
Tabla 1: Medios utilizados en el protocolo.
| Placas | 10 cm | 15 cm |
| Vector de transducción de Lentivirus | 6 g | 9 g |
| CMV-R8.91 | 8 g | 12 g |
| Md. G | 2 g | 3 g |
| Vectores totales | N.o 16 g | N.o 24 g |
Tabla 2: Cantidad de ADN plásmido para la transfección.
| Placa | Perlas magnéticas (L) | Volumen del virus (L) | Volumen de Transducción Final (L) |
| 48-bueno | 6 | 50 | 250 |
| 24-bien | 12 | 100 | 500 |
Tabla 3: Volumen de la solución de perlas magnéticas y vector.
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Discussion
El cultivo primario del epitelio intestinal adulto como organoides proporciona una poderosa herramienta para estudiar los mecanismos molecularesimplicados en la función de las células madre, la homeostasis epitelial intestinal y la patología 1,2,3, 4. Aunque la tecnología CRISPR/Cas9 se puede utilizarpara diseñar genéticamente organoides 9, está limitada por la necesidad de un cribado y selección exhaustivos basados en el análisis de secuencia para los cambios genéticos deseados. El objetivo de este protocolo es proporcionar instrucciones claras y concisas con tutoriales basados en vídeo para la entrega de nanopartículas magnéticas de lenti- o retrovirus a organoides intestinales, seguido de sección congelada para su posterior análisis.
Este protocolo es un método rápido y eficiente para diseñar genéticamente organoides intestinales y analizar las consecuencias de la sobreexpresión genética o el silenciamiento de secciones congeladas. Los pasos críticos se describen en la Figura 2, Figura 3. Esta estrategia permite investigar la importancia biológica de las alteraciones genéticas (sobreexpresión o silenciamiento) en lascélulas madre intestinales y su progenie cultivada en condiciones 3D 2,13. También hemos utilizado esta entrega magnética basada en nanopartículas de vectores virales para mejorarla transducción celular y la expresión transgénica in vitro en diferentes células primarias 2,13.
Con este enfoque, las partículas virales se recubren con nanopartículas magnéticas y se envían a las células por exposición a un campo magnético. En comparación con los métodos actuales de transducción, como el polibreno con o sin espinoculación10,15, los complejos nanopartículas-virales magnéticos son menos tóxicos para las células porque la utilización del material genético está mediada por la endocitosis y la pincitosis, dos procesos biológicos naturales que no inducen daños significativos a las membranas celulares. Por lo tanto, se mejoran tanto la viabilidad celular como la eficiencia de transducción. La eficiencia de transducción puede aumentarse aún más utilizando pequeños fragmentos de cripta o células individuales (ver paso 4.8) en lugar de criptas más grandes o organoides enteros como se informó anteriormente2,10,13,16. La entrega de nanopartículas guiada magnéticamente da como resultado una rápidaacumulación, penetración y admisión de vectores virales en las células objetivo 2,13. Las nanopartículas magnéticas están hechas de óxido de hierro, que es totalmente biodegradable y recubierto con moléculas catiónicas patentadas específicas. La asociación de nanopartículas con vectores virales se logra mediante la agregación coloidal inducida por sal y las interacciones electrostáticas. Las nanopartículas se concentran en las células por un campo magnético externo generado por la placa magnética colocada debajo de la placa de cultivo. Mientras que la eficiencia de transducción se acerca al 95%, no todas las células son transducidas, lo que es una limitación a esta técnica. Además, los genes de interés expresados endógenamente no se alteran como con los enfoques CRISPR/Cas9.
Después de la sobreexpresión o silenciamiento genético, los organoides se pueden utilizar para una miríada de estudios, dependiendo de los objetivos científicos, incluyendo el análisis de la expresión génica, alteraciones proteómicas dentro de las células o secretadas por células, alteraciones metabólicas, y cambios morfológicos. Al igual que con los tejidos vivos, se pueden obtener secciones congeladas para estudios inmunohistoquímicos e inmunofluorescencia de proteínas específicas como factores de transcripción, moléculas citoplasmáticas o marcadores de superficie celular. Nuestro artículo incluye un enfoque eficaz para obtener secciones congeladas de organoides sin perturbar su posición y organización en el cultivo 3D. Esto es ventajoso porque las técnicas previas requieren la eliminación del organoide de la matriz de membrana del sótano antes de congelar16. El procesamiento de organoides mediante la eliminación de la matriz podría interrumpir la organización estructural del organoide en lugar de reflejar el crecimiento y desarrollo in vitro.
Este protocolo para el ingeniería genética de organoides intestinales también se puede adaptar para estudiar otros modelos basados en células y sistemas organoides. Por ejemplo, los sistemas organoides pancreáticos, colonicos, hepáticos, cardíacos y cerebrales podrían transduciarse con este enfoque. Incluso las células que crecen bajo técnicas de cultivo más estándar son susceptibles a la tecnología de nanopartículas. Además, este enfoque se puede aplicar para estudiar los mecanismos moleculares de las enfermedades, no sólo en el contexto de los sistemas organoides derivados de células madre, sino también en los organoides tumorales.
En resumen, las modificaciones clave descritas en estos protocolos para los estudios organoides intestinales, con suerte, empoderarán a los científicos para que dilucidarán el papel de factores importantes y vías aguas abajo implicadas en la biología de las células madre intestinales y su progenie . Estos enfoques deben proporcionar los medios para aprender más acerca de los mecanismos moleculares subyacentes a la autorenovación, la determinación del destino celular, la homeostasis tisular y la regeneración epitelial intestinal, tanto en condiciones fisiológicas como patológicas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional de Salud (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), el Maryland Stem Cell Research Fund (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), la Asociación Americana del Pulmón, la Red de Salud Allegheny - Johns Hopkins Research Fund y hopkins Digestive Diseases Basic Research Core Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Base medium for 293T cells |
| DMEM/F12+ | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer |
| OPTI-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Virus plasmids transfection medium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | Component of virus collection medium and 293T medium |
| Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer |
| PBS (without Ca2+, Mg2+) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | A wash buffer and component of crypt dissociation buffer |
| Mem-NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Component of organoid culture medium |
| GlutamaxII | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Component of organoid culture medium |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Component of organoid culture medium |
| EGF | Millipore Sigma | E9644 | Component of organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 250-38 B | Component of organoid culture medium |
| R-spondin | R&D | 7150-RS-025/CF | Component of organoid culture medium |
| Human recombinant insulin | Millipore Sigma | I9278-5ml | Component of organoid culture medium |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N3376-100G | Component of Transduction medium |
| Wnt3A | R&D | 5036-WN-010 | Component of Transduction medium |
| Y27632 | Millipore Sigma | Y0503-1MG | Component of Transduction medium |
| 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Component of Crypts dissociation buffer |
| DTT (dithiothreitol) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | Component of Crypts dissociation buffer |
| Dispase I | Millipore Sigma | D4818-2MG | Component of organoid digestion buffer |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Component of organoid digestion buffer |
| matrigel(Growth factor reduced) | Corning | 356231 | Used as a matrix to embed organoids |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Medium for transfection in viral production |
| ViralMag R/L | Oz Biosiences | RL40200 | Magnetic particles of viral transduction |
| Magnetic plate | Oz Biosiences | MF10000 | Magnetic plate to facilitate viral transduction |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Transfection agent in viral production |
| Poly-D-Lysine | Millipore Sigma | A-003-E | Coating for plates before seeding 293T cells |
| 4% Formaldehyde Solution | Boster | AR1068 | Solution to fix organoids |
| O.C.T embedding compound | Thermo Fisher Scientific | 4583S | For embedding of the the organoids |
| 5 mL Falcon polystyrene tubes | Corning | 352054 | |
| 50 mL Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.100 | |
| Orbitron rotator II Rocker Shaker | Boekel Scientific | 260250 | |
| Olympus Inverted microscop CK30 | Olympus | CK30 | for scanning and counting crypts |
| Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence | Nikon | Axiovert 200 | for viewing fluorescence in the crypts |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane | Milipore Sigma | UFC910024 | For concentrating viruses |
| pluriStrainer 20 µm (Cell Strainer) | pluriSelect | SKU 43-50020 | For preparing organoid fragments |
| Falcon Cell Strainer | Fisher Scientific | 352340 | For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid) | Millipore Sigma | M8937-100EA | ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments |
| Animal strain: C57BL/6J | Jackson Lab | #000664 | For organoid culture |
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