Summary
Nous décrivons des instructions étape par étape à : 1) engineerly organoids intestinal utilisant des nanoparticules magnétiques pour la transduction lenti- ou rétroviral, et, 2) produisent des sections congelées des organoïdes machinés. Cette approche fournit un outil puissant pour modifier efficacement l'expression des gènes chez les organoïdes pour l'étude des effets en aval.
Abstract
Les cultures d'organoïdes intestinaux offrent une occasion unique d'étudier la biologie intestinale des cellules souches et des cryptes in vitro, bien que des approches efficaces pour manipuler l'expression des gènes chez les organoïdes aient fait des progrès limités dans ce domaine. Bien que la technologie CRISPR/Cas9 permette une édition génomique précise des cellules pour la génération d'organoïdes, cette stratégie nécessite une sélection et un dépistage approfondis par analyse de séquences, ce qui est à la fois long et coûteux. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour la transduction virale efficace des organoïdes intestinaux. Cette approche est rapide et très efficace, réduisant ainsi le temps et les dépenses inhérents à la technologie CRISPR/Cas9. Nous présentons également un protocole pour produire des sections congelées des cultures organoïdes intactes pour une analyse plus approfondie avec la coloration immunohistochimique ou immunofluorescente, qui peut être employée pour confirmer l'expression ou le silence de gène. Après la transduction réussie des vecteurs viraux pour l'expression ou le silence de gène est réalisé, la fonction intestinale de cellules souches et de crypte peut être rapidement évaluée. Bien que la plupart des études organoïdes utilisent des tests in vitro, les organoïdes peuvent également être livrés à des souris pour des analyses fonctionnelles in vivo. En outre, nos approches sont avantageuses pour prédire les réponses thérapeutiques aux médicaments parce que les thérapies actuellement disponibles fonctionnent généralement en modulant l'expression des gènes ou la fonction protéique plutôt que de modifier le génome.
Introduction
La capacité de culture de la souris ou des cryptes humaines cellules comme des organoïdes tridimensionnels (3D) de l'intestin grêle ou du côlon sur de longues périodes de temps a fourni une percée majeure parce que ces cultures affichent des caractéristiques déterminantes de l'épithélium intestinal in vivo 1 Fois , 2 (en) , 3. Les organoïdes dérivés des cryptes primaires sont capables d'auto-renouvellement et d'auto-organisation, présentant des fonctions cellulaires semblables à leurs tissus d'origine. En effet, les organoïdes récapitulent non seulement l'organisation structurelle des cryptes in vivo, mais aussi de nombreuses caractéristiques moléculaires, fournissant ainsi des outils utiles pour étudier la biologie normale et les états de la maladie. Pour illustrer, les études organoïdes ont révélé de nouvelles voies moléculaires impliquées dans la régénération des tissus1,2,3,4,5 ainsi que des médicaments qui pourraient améliorer la fonction dans les milieux pathologiques6,7.
L'étude des cellules souches intestinales est d'un intérêt particulier parce que la muqueuse intestinale est parmi les tissus mammifères les plus fortement régénératrices, se renouvelant tous les 3-5 jours pour protéger l'organisme contre les bactéries, les toxines et autres agents pathogènes au sein de la lumens intestinaux. Les cellules souches intestinales (ISC) sont responsables de cette remarquable capacité de régénération et fournissent ainsi un paradigme unique pour l'étude de la fonction des cellules souches adultes1,2. Des expériences de traçage de lignée chez la souris ont démontré que les cellules souches isolées lgr5-positives peuvent être cultivées pour produire des organoïdes 3D ou « mini-guts » in vitro où elles reflètent étroitement leurs homologues in vivo. Les cultures organoïdes peuvent également être dérivées d'isolats cellulaires de crypte intestinale composés d'ancêtres, d'ISC et de cellules Paneth, ces dernières constituant les cellules de niche épithéliales in vivo. En fait, la culture organoïde des cellules primaires de crypte intestinale a évolué en une technique relativement routinière qui est facile à mettre en œuvre dans la plupart des laboratoires utilisant des réactifs largement disponibles. Ce modèle est également favorable à l'analyse quantitative de l'expression génique par le séquençage de l'ARN (ARN-Seq) et les protéines par spectrométrie de masse, immunohistochimie, ou coloration immunofluorescente2,4,8. En outre, la génétique fonctionnelle peut être étudiée à l'aide d'approches de gain de fonction (surexpression ou expression génique d'un gène mutant activant) ou de perte de fonction (silençage génétique ou expression d'un mutant en perte de fonction)approche 2.
Fait important, la faible efficacité et la toxicité élevée de l'ADN plasmide standard ou des protocoles de transduction virale avec du polybrene demeurent un obstacle majeur dans le domaine. Bien que la technologie CRISPR/Cas9 permette une modification précise du génome, cette approche nécessite une sélection longue suivie d'une validation de séquence9. Ici, nous présentons un protocole de transduction virale pour les organoïdes intestinaux primaires qui optimise la livraison des particules virales par conjugaison aux nanoparticules magnétiques et l'application d'un champ magnétique. Les principales modifications apportées aux protocoles antérieurs4,5,10,11,12,13 et des recommandations pour améliorer l'efficacité sont fournies. Nous décrivons également une approche pour produire des sections congelées des organoïdes intacts cultivés dans le matrigel 3D (maintenant désigné sous le premier sous-sol matrice ou matrice de membrane) pour l'analyse plus approfondie avec l'immunohistochimie ou la coloration immunofluorescente.
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Protocol
Ce protocole a été approuvé par le Johns Hopkins Medical Institutions Animal Care and Use Committee (IACUC). Ce protocole est modifié à partir d'une méthode déjà publiée10,11,12,13.
1. Préparation des réactifs
- Préparer le milieu frais 293T plusieurs heures à l'avance et réchauffer à 37 oC dans un bain d'eau pendant au moins 10 min avant utilisation (tableau 1).
- Préparer plasmide ADN2,13,14 pour l'emballage viral. (Tableau 2).
- Acquérir tous les autres matériaux requis (Tableaudes matériaux).
2. Lentivirus ou rétrovirus Production de particules
- Rein d'embryon humain (HEK) 293T ensemencement cellulaire (Jour 1)
- Préparer un plat de culture de 150 mm en enrobant de 50 g/mL de poly-lysine dissous dans du phosphate tamponné salin (PBS; 10 ml/plat) pendant 1 h à température ambiante (RT).
- Retirer le phosphate tamponné saline (PBS)/poly-D-lysine et laver le plat enduit deux fois avec 5 mL de PBS.
- Seed 293T cells (8-u201210 x 106) in 293T medium (tableau 1) to a total volume of 15 mL.
- Culture 293T cellules du jour au lendemain dans un incubateur de culture tissulaire standard (37 oC, 5 % CO2).
- HEK 293T transfection cellulaire (Jour 2)
- Effectuer la transfection une fois que les cellules ont atteint 70-80% confluence (généralement environ 24 h après l'ensemencement 8-u201210 x 106 cellules).
- Préparer le mélange de transfection à l'aide d'une approche efficace telle qu'une formulation commerciale de liposome cationic (Tableaux 1-u20122, Tableau des matériaux)2.
- Diluer l'ADN des lentilles construit12 (ADN plasmide total de 24 g, tableau 2) dans 1,2 ml de milieu de transfection et incube pendant 5 min à RT dans des tubes de 1,5 mL (Tableau des matériaux).
- Diluer le régent de transfection (36 oL) dans 1,2 ml de milieu de transfection (Tableau des matériaux)et couver dans des tubes de 5 ml pendant 5 min selon les instructions du fabricant.
- Ajouter le réactif lentivirus (étape 2.2.2.1) au réactif de transfection (étape 2.2.2.2) et mélanger doucement en pipetting lentement vers le haut et vers le bas à l'aide d'un tuyauterie de 5 ml.
- Incuber le mélange pendant 20 min à RT.
- Laver délicatement les cellules 293T avec 5 ml de milieu de transfection et remplacer par 10 ml de milieu de transfection.
- Ajouter les complexes ADN-lipide (à partir de l'étape 2.2.2.3) goutte à goutte au milieu des cellules 293T et mélanger soigneusement les milieuis dans les plats de culture en se déplaçant dans des directions horizontales et verticales pour assurer une distribution égale des complexes ADN-lipide dans chaque plat.
- Incuber pendant 6 h dans un incubateur standard de culture tissulaire (37 oC, 5 % CO2).
- Après l'incubation, remplacer les médias par un milieu de collecte de virus frais de 20 ml (tableau1).
- Collecte de virus (Jours 3-u20125)
- Recueillir les médias antivirus dans des tubes de 50 ml et les conserver dans un réfrigérateur de 4 oC pour une concentration plus poussée.
- Remplacer 20 mL de virus frais collecte moyenne tous les 24 h et la culture du jour au lendemain (24 h). Répétez la collecte des médias au cours des 2 prochains jours (Jours 4-u20125).
- Veiller à ce que le volume total de milieu recueilli après le jour 5 soit de 60 ml (20 ml/jour x 3 jours).
- Concentration de virus (Jour 5)
- Centrifuger le support collecté (60 ml) pendant 5 min à 400 x g. Ensuite, passez le supernatant à travers un filtre (0,45 m pores) pour enlever les débris cellulaires.
- Concentrez le virus en ajoutant 15 ml de milieuis de virus filtrés dans une unité de filtre centrifuge (Tableau des matériaux). Centrifugeuse à 2 500 x g pendant 15 min à 4 oC. Parce que le virus ne peut pas passer à travers ce filtre, il sera concentré dans la chambre supérieure du filtre.
- Aspirez le flux à travers le tube (chambre inférieure) et ajoutez un autre 15 ml de plus de supernatant de milieu de collecte virale restant à la même unité de filtre centrifuge. Centrifugeuse comme ci-dessus (2 500 x g pendant 15 min à 4 oC) pour concentrer le virus supplémentaire du supernatant.
- Répétez le processus à l'aide du même filtre pour un support de 60 ml à partir d'une seule plaque transductible jusqu'à ce que la concentration désirée soit atteinte (100 fois).
Remarque : Nous concentrons généralement 60 ml de supports de collecte de virus à 600 l. - Retirez le virus concentré de la chambre supérieure du filtre à l'aide d'une tuyauterie de 1 ml, puis en adhérence et entreposez-le dans des tubes de 1,5 ml (50'u201260 'L/tube) à -80 'C pour une utilisation ultérieure. Entreposez les particules concentrées jusqu'à 6 mois et demi.
3. Isoler les cryptes
- Euthanasiez les souris en utilisant le CO2 selon les directives locales de l'IACUC.
- Placez l'animal euthanasié sur son dos et lavez l'abdomen en pulvérisant 70 % d'éthanol.
- Effectuer une incision longitudinale de la ligne médiane du sternum à l'aine, inciser la peau d'abord, puis le tissu sous-cutané.
- Retirer l'intestin grêle de l'estomac au cecum.
- Identifier les régions d'intérêt au sein de l'intestin grêle; les cryptes peuvent être isolées du duodénum, du jejunum et de l'ileum.
- À l'aide d'une seringue de 10 ml, rincer l'intestin grêle isolé avec un tampon de dissociation de la crypte (PBS préréfrigéré contenant 1 mM de dithiothreitol (TNT), 1 % de pénicilline/streptomycine (no Ca2 et Mg2)dans un plat de culture tissulaire de 10 cm (Tableau 1) )
- Enlever les tissus adipeux périphériques et ouvrir ou « fileter » le tissu intestinal longitudinalement sur une plaque de verre stérile (15 cm x 15 cm).
- Gratter délicatement les villosités épithéliales intestinales à l'aide d'un grattoir cellulaire.
- Couper l'intestin grêle en sections de 2'u20123 cm dans le sens de la longueur.
- Transférer le tissu dans un tube de 15 ml contenant du PBS préréfrigéré à l'aide de forceps plats (116 mm). Laver les fragments de tissu en secouant vigoureusement à la main pendant 30 s (déplacer le tube dans des directions opposées 60 fois).
- Rafraîchir le PBS et répéter le lavage jusqu'à ce que le PBS devienne clair.
Remarque : Nous lavons généralement les fragments 2 fois. - Incuber le tissu dans un tube conique de 15 ml contenant 10 ml de tampon de dissociation de crypte (tableau 1) pendant 10 min à 4 oC sur un shaker orbital à vitesse moyenne une fois que le PBS est clair.
- Secouez vigoureusement le tube à la main pendant 30 s (directions opposées 60 fois) et transférez le tissu à l'aide de forceps plats vers un autre tube conique de 15 ml contenant 10 ml de tampon de dissociation de crypte. Incuber cette fraction sur la glace. N'utilisez pas la première fraction pour la culture organoïde, car elle contient principalement des villosités.
- Répétez les étapes 3.11'u20123.13 pour 3'u20124 fois, collecte de chaque fraction et les plaçant sur la glace.
- Sélectionnez la fraction qui est enrichie avec le pourcentage le plus élevé de cryptes intestinales en scannant 200 échantillons de L de chaque fraction sous un microscope inversé (4x). Identifier les cryptes par la morphologie typique décrite précédemment (Figure 1A)10.
REMARQUE: Ils apparaîtront de forme ronde ou ovale et contiendront des cellules panétoytes granulées. En revanche, les villosités sont des structures ressemblant à des doigts dépourvues des cellules granulaires de Paneth (Figure 1B). - Passez la fraction sélectionnée à travers une passoire cellulaire de 40 m pour obtenir des cryptes de taille similaire si nécessaire. Sinon, isolez les cellules souches Lgr5MD en fonction de la cytométrie d'écoulement pour les protéines fluorescentes vertes (GFP) siles souris sont croisées sur le fond EGFP-Lgr5MD ou sur un autre modèle approprié qui permet d'identifier les cellules Lgr52 .
- Comptez le nombre total de cryptes dans la fraction sélectionnée comme suit.
- Pipette 50 l de la fraction sélectionnée dans un hémocytomètre et compter le nombre de cryptes à l'aide d'un microscope à lumière inversée (4x). Placez 100 cryptes par puits lors de l'utilisation d'une plaque de 48 puits pour permettre les expériences de transduction dans lesquelles les puits de 3-u20126 seront cédés par condition expérimentale pour le silençage génétique ou la surexpression.
- En fonction du nombre de cryptes par 50 L, calculez le volume de tampon de dissociation de crypte nécessaire et transférez ce volume dans un tube de 1,5 ml.
Remarque : Par exemple, 10 cryptes pour 50 L sont comptées, 6 x 50 L ou 300 L sont nécessaires pour 300 cryptes.
- Centrifuger les cryptes dans les tubes de 1,5 ml à 300 x g pendant 5 min.
- Jetez soigneusement le supernatant en tafilant doucement la couche liquide supérieure et resuspendez la pastille dans 100 ll de matrice de membrane réduite de la membrane du sous-sol sur la glace (Tableau des matériaux).
- Ensemencez les cryptes contenant de la matrice dans une plaque de 48 puits préréchauffée de 37 oC (30 l/puits, 100 cryptes/puits). Incuber la plaque dans un incubateur standard de culture tissulaire pendant 5'u201215 min pour permettre la gélification de matrice (37 oC, 5% CO2).
- Regroupez chaque gel d'un milieu de culture organoïde de 250 l (ENR) (tableau1) et placez les plaques de 48 puits dans un incubateur standard de culture tissulaire (37 oC, 5 % CO2). Vérifiez les cultures pour l'organisation de crypte dans de petites formes rondes et cystiques après 24 h ; bourgeons se formeront après 2'u20125 jours.
- Remplacez délicatement les supports ENR tous les 3 jours. Retirez les vieux supports ENR avec une aspiration douce, en prenant soin de ne pas toucher la matrice lors du remplacement des médias.
- Les cultures organoïdes de passage tous les 4 jours 20127 comme précédemment décrit11.
4. Préparation de fragment organoïde
- Transduce organoïdes une fois qu'ils se forment (dans les 1'u20122 semaines) ou après avoir été adoptés. Pour une seule expérience de transduction, préparez 2 puits d'organoïdes cultivés dans une plaque de 48 puits par condition avec des organoïdes/puits de 200 ou 200 ou 200'u202600 par état de transduction expérimentale.
- Échangez ENR avec des supports de transduction de 250 l (tableau 1) et de la culture dans les supports de transduction pendant 3 jours ou plus ou jusqu'à ce que les organoïdes adoptent une morphologie kystique. Inclure à la fois l'inhibiteur Wnt3a et l'inhibiteur rock (Y27632) dans le milieu de transduction pour augmenter le nombre de cellules souches et paneth; Nicotinamide (Nic) améliore l'efficacité de la culture (voir le milieu de transduction dans le tableau 1).
- Rompre mécaniquement la structure de la membrane de membrane du sous-sol en forme de dôme avec des supports et une pointe de pipet à l'aide d'une tuyauterie de 1 ml.
- Transférer les organoïdes et les médias dans un tube stérile de 1,5 ml.
- Perturber mécaniquement la matrice plus loin en pipetting avec un tuyaude de 200 l 10 'u201215 fois.
- Centrifugeles les fragments d'organoïdes à RT à 500 x g pendant 5 min.
- Jeter le supernatant soigneusement à l'aide d'une pipette et resuspendre la pastille dans un milieu DMEM/F12 de 1 ml (tableau1).
- Ajouter Dispase I (6 l à 10 mg/mL) et DNase I (2,5 l à 10 mg/mL). Bien mélanger en pipetting doucement à l'aide d'une tuyauterie de 1 ml.
- Incuber les organoïdes à 37 oC pendant 20 min dans le tube de 1,5 ml.
- Ajouter 500 l de supports ENR pour mettre fin à la réaction de dissociation; le sérum dans l'ENR met fin à la réaction.
- Passer les cellules organoïdes à travers une passoire à cellules de 20 m et centrifuger les fragments d'organoïdes à 400 x g pendant 5 min.
- Resuspendre les fragments d'organoïdes avec un milieu de transduction de 150 l (tableau 1).
5. Génie génétique des organoïdes ou des cellules cryptiques par transduction virale
REMARQUE: Voir Figure 2.
- Clusters de cellules organoïdes de graines avec 200 l transduction moyenne/bien dans une plaque de 48 puits et incuber dans un incubateur standard de culture tissulaire (37 oC, 5 % CO2). Vous pouvez également placer des cellules cryptiques fraîchement isolées (1 000 cryptes) dans un milieu/puits de transduction de 200 l dans une plaque de 48 puits et incuber dans un incubateur standard de culture tissulaire (37 oC, 5 % CO2).
- Décongeler les flacons de virus pour la transduction, ce qui permet de défonçage 50 ll de virus concentré pour la transduction de chaque puits dans des plaques de 48 puits ou 100 l de virus concentré par puits dans des plaques de 24 puits.
- Incuber le virus avec 12 l de solution de nanoparticules magnétiques pendant 15 min à RT dans un tube de 1,5 ml (tableau 3).
- Ajoutez la solution magnétique de nanoparticules/mélange de virus aux cellules à transduire.
- Placer la plaque de culture cellulaire sur une plaque magnétique et incuber pendant au moins 2 h (et jusqu'à 6 h) dans un incubateur standard de culture tissulaire (37 oC, 5 % CO2).
6. Ensemencement de fragments d'organoïdes infectés
- Transférer les amas de cellules organoïdes infectés et les supports de transduction de chaque puits dans un tube de 1,5 ml.
- Centrifugeuse à 500 x g pendant 5 min.
- Jeter le supernatant avec une aspiration douce et refroidir le tube contenant le granule sur la glace pendant 5 min.
- Ajouter 120 l de matrice de membrane de sous-sol et resuspendre le granule en pipetting lentement de haut en bas.
- Graines de 30 l gouttes du mélange matrice-cellule dans une nouvelle plaque de 48 puits.
- Incuber la plaque à 37 oC pendant 5'u201215 min jusqu'à ce que la matrice se solidifie.
- Ajouter le milieu de transduction à chaque puits et incuber dans un incubateur standard de culture tissulaire pendant 3'u20124 jours (37 oC, 5% CO2).
- Après 3 jours 20124, inspectez les cultures au microscope léger (10x) pour assurer l'organisation des grappes cellulaires en structures organoïdes. Ensuite, remplacez délicatement les supports de transduction par un support ENR de 250 l.
- Remplacez les médias tous les 3 jours et plus.
7. Sélection (le cas échéant)
- Après 2 jours 20123, ajouter des antibiotiques ou des hormones pertinents pour la sélection au milieu de transduction si approprié.
REMARQUE: Nous avons utilisé la puromycine (2 g/mL) pour la sélection de la transduction lentivriale parce que les plasmides abritait un gène de résistance à la puromycine2,14.
8. Confirmation d'une transduction réussie et d'expression génique ou de silence
- Si vous utilisez fuGW lentivirus2,14, estimer l'efficacité de la transduction en mesurant les signaux GFP via le microscope fluorescent ou la cytométrie de flux.
- Valider la surexpression ou le silence génétique à l'aide d'une réaction quantitative en chaîne de transcriptase inversée (RT-PCR) pour la comparaison quantitative de l'ARNm dans les cultures organoïdes témoins et expérimentales.
- Confirmer les niveaux de protéines pour l'expression des gènes codant les protéines ou le silence par Western Blot ou immunostaining2.
9. Cryosection organoïde dans la matrice de membrane de sous-sol
REMARQUE: Voir Figure 3.
- Retirez le milieu ENR par une aspiration douce, en prenant soin de ne pas perturber la matrice de membrane du sous-sol et en lavant doucement une fois avec 500 L de PBS.
- Fixer les organoïdes avec 1,0 ml de 4% paraformaldehyde (PFA) solution (Tableau des matériaux) à RT pour 30 min.
- Retirer le PFA par aspiration et laver délicatement deux fois avec 1 mL de PBS.
- Retirez le PBS par aspiration et ajoutez 1,0 ml de tampon de saccharose de 30 % à chaque échantillon. Incuber les organoïdes fixes dans le saccharose pendant 1 h à 4 oC dans une chambre froide, un réfrigérateur ou sur de la glace pour déshydrater les échantillons.
- Enlever le tampon de saccharose par aspiration et ajouter juste assez de composé d'emcasterie (Tableau des matériaux) pour couvrir la couche de matrice (300 l/puits) dans chaque puits.
- Incuber à RT pendant 5 min.
- Placer les échantillons dans un congélateur de -80 oC pendant 10 min, ou jusqu'à ce que le composé d'incorporation devienne solide et blanc.
- Placez le plat avec le composé d'incorporation congelé à RT pour permettre la fonte minimale du composé le long des bords. Utilisez un scalpel pour séparer le bloc des parois du puits.
- Retirez le bloc composé d'intégration de matrice à l'aide de forceps et placez-le dans un bloc de spécimens (p. ex. cryomold), en travaillant rapidement pour empêcher la fonte.
- Remplir complètement le moule d'un composé d'incorporation et congeler à -80 oC pendant 30 min.
- Utilisez le bloc est pour la section ou le stockage dans le congélateur de -80 oC pour une utilisation ultérieure.
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Representative Results
Ici, nous décrivons une technique de transduction rapide et très efficace qui exploite les nanoparticules magnétiques exposées à un champ magnétique pour délivrer le lentivirus aux cellules d'intérêt. Avec des outils facilement disponibles, nous avons appliqué cette approche non seulement pour transduire des cellules cryptiques fraîchement isolées (Figure 1A), mais aussi pour les organoïdes (Figure 2) et d'autres cellules qui sont réfractaires à des approches de transduction plus routinières. Les particules lentivirales peuvent être facilement conjuguées aux nanoparticules magnétiques et les complexes virus-nanoparticules qui en résultent sont livrés efficacement en appliquant un champ magnétique à l'aide d'une plaque magnétique. Pour optimiser cette approche, nous avons d'abord testé des vecteurs lentiviraux liés au GFP de telle sorte que le GFP puisse être utilisé pour identifier les cellules transductrices par microscopie à fluorescence. Le GFP peut être visualisé à chaque étape du développement des organoïdes, y compris au début lorsque les cellules cryptiques s'organisent en structures ressemblant à des kystes (figure 4A), ou à des moments ultérieurs lorsque les organoïdes forment des bourgeons (Figure 4B). Les organoïdes intestinaux réussis peuvent alors subir l'analyse fonctionnelle pour des changements dans le développement en taclant des membranes de cellules et des noyaux pour énumérer le nombre total de cellules en plus des marqueurs de lignée, tels que le lysozyme pour identifier des cellules de Paneth ( Figure 4C).
Les organoïdes génétiquement modifiés peuvent être utilisés pour une analyse plus approfondie en générant des sections congelées comme indiqué ici (figure 3). Après l'intégration des organoïdes, les blocs congelés peuvent être stockés et sectionnés plus tard pour de futures études. Cette approche est également efficace (estimée à 95 % en fonction du pourcentage d'organoïdes GFP(MD) par rapport au total des organoïdes). Cette approche peut être effectuée avec des réactifs de laboratoire standard, fournissant ainsi des tissus qui sont propices à diverses enquêtes, y compris le nombre de cellules, le sort des cellules, et la présence et les niveaux de protéines spécifiques2. Par exemple, nous avons utilisé des sections congelées et des taches immunofluorescentes pour identifier les cellules individuelles et déterminer le type de cellules (figure4C).
Figure 1 : Cryptes et villosités isolées avec des dessins animés montrant une morphologie typique. (A) Les cryptes isolées forment des structures rondes ou ovales. (B) Les villi sont identifiés comme des structures ressemblant à des doigts. Barre d'échelle de 50 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Schéma de la transduction virale des organoïdes à l'aide de nanoparticules magnétiques et de l'exposition à un champ magnétique. Les étapes les plus critiques du protocole de transduction sont affichées. (A) Incubate virus et solution magnétique de nanoparticules pendant 15 min à RT dans un tube de 1,5 ml. (B) Ajouter les nanoparticules magnétiques/mélange de virus aux cellules à décéder. (C) Placez la plaque de culture cellulaire sur la plaque magnétique et incubez pendant 2 h dans un incubateur standard de culture tissulaire. Des temps d'incubation plus longs peuvent également être utilisés (6 h); le puits représentatif est montré ici sur la plaque magnétique. (D) Une cellule transduced avec le virus et la nanoparticule magnétique est montrée. (E) Transférer les amas de cellules organoïdes infectés et les supports de transduction de chaque puits dans un tube et une centrifugeuse de 1,5 ml à 500 x g pendant 5 min. Jeter le supernatant avec une aspiration douce et refroidir le tube contenant le granule sur la glace pendant 5 min. (F) Ajouter 120 L de matrice de membrane de sous-sol et resuspendre le granule en pipetting lentement de haut en bas. (G) Gouttes de graines de 30 L contenant du mélange de cellules matricielles dans chaque puits dans une nouvelle plaque de 48 puits. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Schéma de sectionnement congelé des organoïdes dans la matrice 3D. Les étapes les plus critiques du protocole de sectionnement gelé sont affichées. (A) Un puits simple dans une plaque de culture cellulaire de 24 puits est représenté. (B) Ajouter juste assez de composé d'incorporation pour couvrir la couche de matrice (300 l/puits) et couver à RT pendant 5 min. (C) Placer les échantillons à -80 C dans un congélateur pendant 10 min ou jusqu'à ce que le composé d'incorporation devienne solide et blanc. Ensuite, placez le plat à RT pour permettre une légère fonte le long des bords de l'échantillon. (D) Utilisez un scalpel pour séparer le bloc des parois du puits. (E) Retirez le bloc composé d'intégration de matrice à l'aide de forceps et placez-le dans un contenant ou un moule peu profond approprié pour congeler les tissus. Remplissez complètement le moule de composé d'intégration (OCT). (F) Bloquer le bloc à -80 C dans un congélateur pendant 30 min. (G) Le bloc est prêt pour la section ou l'entreposage dans un congélateur de -80 C pour une utilisation ultérieure. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Images représentatives d'organoïdes intestinaux transducés. (A) Image représentative de petits organoïdes intestinaux sous microscope léger montrant (à gauche) la microscopie de fluorescence, et, (droite) microscopie standard de l'expression transgène (EGFP) au jour 3 après transduction. Barre d'échelle de 50 m. (B) Exemple de surexpression du gène codant gFP dans l'organoïde après la transduction à l'aide de nanoparticules magnétiques. Les cellules organoïdes ont été transduced avec le lentivirus exprimant GFP (FUGW ; Top) ou lentivirus surexprimant Hmga1 (FUGW-Hmga1; En bas) comme indiqué au jour 12 après la transduction. Barre d'échelle de 50 m. (C) Imagerie immunofluorescence de la section congelée fixe de formaline des organoïdes. Les sections organoïdes (4 m) ont été tachées d'antilysozyme (rouge), d'anti-EpCAM (vert) et de DAPI (bleu). EpCAM délimite les frontières cellulaires, DAPI a indiqué les noyaux individuels, et les taches de lysozyme cellules Paneth. Barre d'échelle de 50 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Milieu de culture organoïde (ENR) | 100 ml |
| DMEM/F12 | 96 ml |
| Supplément de dipeptide L-alanyl-L-glutamine (p. ex. Glutamax) | 1 mL |
| NEAA (ENAA) | 1 mL |
| Stylo/Strep | 1 mL |
| Hepes | 1 mL |
| EGF (100 g/mL) | 5 ll |
| Noggin (100 g/mL) | 10 l |
| R-spondin (100 g/mL) | 10 l |
| ou R-spondin condition medium (CM) | 20 ml |
| Insuline recombinante humaine (10 mg/ml) | 5 ll |
| Moyen de transduction | 5 mL |
| Moyen ENR | 2,4 ml |
| Moyen d'état de Wnt (CM) | 2,5 ml |
| Nicotinamide (1M) | 100 l |
| Y27632 (10 M) | 10 l |
| Tampon de dissociation de cryptes | 100 ml |
| PBS (sans Ca2,Mg2) | 99 ml |
| Stylo/Strep | 1 mL |
| 0,5 M EDTA | 100 l |
| 0,1 M TNT (dithiothreitol) | 100 l |
| 293T moyen | 100 ml |
| Dmem | 90 ml |
| Fbs | 10 ml |
| Virus Collection Moyenne | 100 ml |
| Dmem | 99 ml |
| Fbs | 1 mL |
| Tampon de digestion organoïde | 1 mL |
| DMEM/F12 | 1 mL |
| Dispase I (10 mg/ml) | 6 l |
| Dnase I (10 mg/ml) | 2,5 l |
Tableau 1 : Médias utilisés dans le protocole.
| Plaques | 10 cm | 15 cm |
| Vecteur de transducisation lentivirus | 6 g | 9 g |
| CMV -R8.91 | 8 g | 12 g |
| Md. gr | 2 g | 3 g |
| Vecteurs totaux | 16 g | 24 g |
Tableau 2 : Quantité d'ADN plasmide pour la transfection.
| assiette | Perles magnétiques (L) | Volume de virus (L) | Final TransductionVolume (L) |
| 48-bien | 6 Annonces | 50 Annonces | 250 Annonces |
| 24-bien | 12 Ans, états-unis | 100 ans | 500 Annonces |
Tableau 3 : Volume de solution de perle magnétique et de vecteur.
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Discussion
La culture primaire de l'épithélium intestinal adulte comme organoïdes fournit un outil puissant pour étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans la fonction de cellules souches, l'homéostasie épithéliale intestinale, et la pathologie1,2,3, 4. Bien que la technologie CRISPR/Cas9 puisse être utilisée pour modifier génétiquement les organoïdes9, elle est limitée par la nécessité d'un dépistage et d'une sélection approfondis basés sur l'analyse de la séquence pour les changements génétiques souhaités. L'objectif de ce protocole est de fournir des instructions claires et concises avec des tutoriels vidéo pour la livraison de nanoparticules magnétiques de lenti- ou de rétrovirus aux organoïdes intestinaux, suivis d'une section congelée pour une analyse plus approfondie.
Ce protocole est une méthode rapide et efficace pour modifier génétiquement les organoïdes intestinaux et analyser les conséquences de la surexpression génétique ou du silence à partir de sections congelées. Les étapes critiques sont décrites dans la figure 2, figure 3. Cette stratégie permet d'enquêter sur la signification biologique des altérations génétiques (surexpression ou silençage) dans les cellules souches intestinales et leur progéniture cultivée dans des conditions 3D2,13. Nous avons également utilisé cette livraison magnétique à base de nanoparticules de vecteurs viraux pour améliorer la transduction cellulaire et l'expression transgène in vitro dans différentes cellules primaires2,13.
Avec cette approche, les particules virales sont recouvertes de nanoparticules magnétiques et livrées aux cellules par exposition à un champ magnétique. Par rapport aux méthodes de transduction actuelles, telles que le polybrene avec ou sans spinoculation10,15, les complexes magnétiques nanoparticules-virales sont moins toxiques pour les cellules parce que l'apport du matériel génétique est médié par l'endocytose et pinocytose, deux processus biologiques naturels qui n'induisent pas de dommages importants aux membranes cellulaires. Ainsi, la viabilité cellulaire et l'efficacité de la transduction sont améliorées. L'efficacité de la transduction peut être augmentée en utilisant de petits fragments de crypte ou des cellules simples (voir l'étape 4.8) au lieu de cryptes plus grandes ou d'organoïdes entiers comme indiqué précédemment2,10,13,16. La livraison de nanoparticules guidée magnétiquement entraîne une accumulation, une pénétration et une prise rapides de vecteurs viraux dans les cellules cibles2,13. Les nanoparticules magnétiques sont faites d'oxyde de fer, qui est entièrement biodégradable et recouvert de molécules cationiques propriétaires spécifiques. L'association de nanoparticules avec des vecteurs viraux est réalisée par l'agrégation colloïdale induite par le sel et les interactions électrostatiques. Les nanoparticules sont ensuite concentrées sur les cellules par un champ magnétique externe généré par la plaque magnétique placée sous le plat de culture. Bien que l'efficacité de la transduction approche 95 %, toutes les cellules ne sont pas transductées, ce qui est une limitation à cette technique. En outre, les gènes d'intérêt exprimés de façon endogène ne sont pas modifiés comme avec les approches CRISPR/Cas9.
Après la surexpression ou le silence génétique, les organoïdes peuvent être utilisés pour une myriade d'études, selon les objectifs scientifiques, y compris l'analyse de l'expression génique, les altérations protéomiques dans les cellules ou sécrétées par les cellules, les altérations métaboliques, et changements morphologiques. Comme avec les tissus vivants, des sections congelées peuvent être obtenues pour les études immunohistochimiques et d'immunofluorescence de protéines spécifiques telles que les facteurs de transcription, les molécules cytoplasmiques, ou les marqueurs de surface cellulaire. Notre article inclut une approche efficace pour obtenir des sections congelées des organoïdes sans perturber leur position et organisation dans la culture 3D. Ceci est avantageux parce que les techniques antérieures exigent l'enlèvement de l'organoïde de la matrice de membrane de sous-sol avant de geler16. Le traitement des organoïdes par prélèvement de la matrice pourrait perturber l'organisation structurelle de l'organoïde plutôt que de refléter la croissance et le développement in vitro.
Ce protocole d'ingénierie génétique des organoïdes intestinaux peut également être adapté pour étudier d'autres modèles cellulaires et systèmes organoïdes. Par exemple, les systèmes organoïdes pancréatiques, coloniques, hépatiques, cardiaques et cérébraux pourraient être transdunts avec cette approche. Même les cellules qui poussent selon des techniques de culture plus standard sont favorables à la technologie des nanoparticules. En outre, cette approche peut être appliquée pour étudier les mécanismes moléculaires des maladies, non seulement dans le contexte des systèmes organoïdes dérivés des cellules souches, mais aussi dans les organoïdes tumoraux.
En résumé, les principales modifications décrites dans ces protocoles pour les études d'organoïdes intestinaux permettront, espérons-le, aux scientifiques d'élucider le rôle des facteurs importants et des voies en aval impliqués dans la biologie des cellules souches intestinales et de leur progéniture. . Ces approches devraient fournir les moyens d'en apprendre davantage sur les mécanismes moléculaires sous-jacents à l'auto-renouvellement, la détermination du destin cellulaire, l'homéostasie tissulaire et la régénération épithéliale intestinale, dans des conditions physiologiques et pathologiques.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions du National Institute of Health (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), du Maryland Stem Cell Research Fund (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), de l'American Lung Association, de l'Allegheny Health Network - Johns Hopkins Research Fund et le Hopkins Digestive Diseases Basic Research Core Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Base medium for 293T cells |
| DMEM/F12+ | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer |
| OPTI-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Virus plasmids transfection medium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | Component of virus collection medium and 293T medium |
| Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer |
| PBS (without Ca2+, Mg2+) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | A wash buffer and component of crypt dissociation buffer |
| Mem-NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Component of organoid culture medium |
| GlutamaxII | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Component of organoid culture medium |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Component of organoid culture medium |
| EGF | Millipore Sigma | E9644 | Component of organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 250-38 B | Component of organoid culture medium |
| R-spondin | R&D | 7150-RS-025/CF | Component of organoid culture medium |
| Human recombinant insulin | Millipore Sigma | I9278-5ml | Component of organoid culture medium |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N3376-100G | Component of Transduction medium |
| Wnt3A | R&D | 5036-WN-010 | Component of Transduction medium |
| Y27632 | Millipore Sigma | Y0503-1MG | Component of Transduction medium |
| 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Component of Crypts dissociation buffer |
| DTT (dithiothreitol) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | Component of Crypts dissociation buffer |
| Dispase I | Millipore Sigma | D4818-2MG | Component of organoid digestion buffer |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Component of organoid digestion buffer |
| matrigel(Growth factor reduced) | Corning | 356231 | Used as a matrix to embed organoids |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Medium for transfection in viral production |
| ViralMag R/L | Oz Biosiences | RL40200 | Magnetic particles of viral transduction |
| Magnetic plate | Oz Biosiences | MF10000 | Magnetic plate to facilitate viral transduction |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Transfection agent in viral production |
| Poly-D-Lysine | Millipore Sigma | A-003-E | Coating for plates before seeding 293T cells |
| 4% Formaldehyde Solution | Boster | AR1068 | Solution to fix organoids |
| O.C.T embedding compound | Thermo Fisher Scientific | 4583S | For embedding of the the organoids |
| 5 mL Falcon polystyrene tubes | Corning | 352054 | |
| 50 mL Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.100 | |
| Orbitron rotator II Rocker Shaker | Boekel Scientific | 260250 | |
| Olympus Inverted microscop CK30 | Olympus | CK30 | for scanning and counting crypts |
| Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence | Nikon | Axiovert 200 | for viewing fluorescence in the crypts |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane | Milipore Sigma | UFC910024 | For concentrating viruses |
| pluriStrainer 20 µm (Cell Strainer) | pluriSelect | SKU 43-50020 | For preparing organoid fragments |
| Falcon Cell Strainer | Fisher Scientific | 352340 | For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid) | Millipore Sigma | M8937-100EA | ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments |
| Animal strain: C57BL/6J | Jackson Lab | #000664 | For organoid culture |
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