Summary
Vi beskriver trin-for-trin instruktioner til: 1) effektivt ingeniør tarm organoider ved hjælp af magnetiske nanopartikler til Lenti-eller antiretroviral transduktion, og, 2) generere frosne sektioner fra manipuleret organoider. Denne fremgangsmåde giver et effektivt værktøj til effektiv ændring af genekspression i organoider til undersøgelse af downstream-effekter.
Abstract
Tarm organoid kulturer giver en enestående mulighed for at undersøge tarm stamcelle og Crypt biologi in vitro, selv om effektive tilgange til at manipulere genekspression i organoider har gjort begrænsede fremskridt i denne arena. Mens CRISPR/Cas9-teknologien giver mulighed for præcis genomredigering af celler til organoid-generering, kræver denne strategi omfattende udvælgelse og screening ved Sekvensanalyse, hvilket både er tidskrævende og dyrt. Her giver vi en detaljeret protokol til effektiv viral transduktion af intestinale organoider. Denne fremgangsmåde er hurtig og yderst effektiv og mindsker dermed den tid og omkostning, der er forbundet med CRISPR/Cas9-teknologien. Vi præsenterer også en protokol til at generere frosne sektioner fra intakt organoid kulturer til yderligere analyse med immunohistokemiske eller immunfluorescent farvning, som kan bruges til at bekræfte genekspression eller hæmning. Efter vellykket transduktion af virale vektorer for genekspression eller lyddæmpningen opnås, kan tarm stamcelle og Crypt funktion hurtigt vurderes. Selv om de fleste organoid-studier anvender in vitro-assays, kan organoider også leveres til mus til in vivo funktionelle analyser. Desuden er vores tilgange er fordelagtige for at forudsige terapeutiske reaktioner på narkotika, fordi øjeblikket tilgængelige behandlinger generelt fungerer ved at modulerende genekspression eller protein funktion i stedet for at ændre genomet.
Introduction
Evnen til at kultur mus eller menneskelige Krypter celler som tredimensionale (3D) organoider fra små tarme eller kolon over langvarige perioder forudsat et stort gennembrud, fordi disse kulturer viser definerende funktioner i tarm epitelet in vivo 1 , 2 , 3. organoider afledt af primære Krypter er i stand til selvfornyelse og selvorganisering, udstiller cellulære funktioner svarende til deres væv af oprindelse. Faktisk, organoider rekapitulere ikke kun den strukturelle organisation af Krypter in vivo, men også mange molekylære træk, hvilket giver nyttige værktøjer til at studere normale biologi og sygdomstilstande. For at illustrere, organoid undersøgelser har afsløret nye molekylære veje involveret i vævsregeneration1,2,3,4,5 samt lægemidler, der kan forbedre funktionen i patologiske indstillinger6,7.
Studiet af tarm stamceller er af særlig interesse, fordi tarmslimhinden er blandt de mest regenerativ pattedyrs væv, forny sig hver 3-5 dage for at beskytte organismen mod bakterier, toksiner og andre patogener inden for tarm lumen. Tarm stamceller (ISCs) er ansvarlige for denne bemærkelsesværdige regenerativ kapacitet og dermed give et unikt paradigme for at studere voksen stamcelle funktion1,2. Lineage-Tracing eksperimenter i mus viste, at isolerede Lgr5-positive stamceller kan dyrkes for at generere 3D-organoider eller ' mini-Guts ' in vitro, hvor de nøje afspejler deres in vivo-modparter. Organoide kulturer kan også udledes af intestinal Crypt celle isolater bestående af stamceller, Isc'er og Paneth cellerne, hvoraf sidstnævnte udgør epitelial niche celler in vivo. Faktisk har organoid kultur fra primære intestinale Crypt-celler udviklet sig til en relativt rutinemæssig teknik, der er let at implementere i de fleste laboratorier ved hjælp af alment tilgængelige reagenser. Denne model er også modtagelig for kvantitativ analyse af genekspression ved RNA-sekventering (RNA-SEQ) og proteiner ved massespektrometri, immunhistokemi eller immunfluorescent farvning2,4,8. Desuden kan funktionel genetik undersøgt ved hjælp af Gain-of-funktion (gen overekspression eller udtryk for et aktiverende mutant gen) eller tab af funktion (genhæmning eller udtryk af en tab-of-Function mutant) tilgange2.
Vigtigere, lav effektivitet og høj toksicitet af standard plasmid DNA eller viral transduktionsprotokoller med polybrene forbliver en stor forhindring i marken. Selvom crispr/Cas9-teknologien giver mulighed for præcis genom-redigering, kræver denne fremgangsmåde tidskrævende valg efterfulgt af sekvens validering9. Her præsenterer vi en viral transduktionsprotokol for primære intestinale organoider, der optimerer leveringen af virale partikler ved konjugering til magnetiske nanopartikler og anvendelse af et magnetfelt. Der gives vigtige ændringer af tidligere protokoller4,5,10,11,12,13 og anbefalinger til forbedring af effektiviteten. Vi beskriver også en tilgang til at generere frosne sektioner fra intakte organoider dyrket i 3D matrigel (fremover benævnt kælder membran matrix eller matrix) til yderligere analyse med Immunhistokemi eller immunfluorescent farvning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol blev godkendt af Johns Hopkins Medical Institutionsudvalget for dyrepasning og-anvendelse (IACUC). Denne protokol er ændret fra en tidligere offentliggjort metoder10,11,12,13.
1. klargøring af reagenser
- Forbered frisk 293T medium flere timer i forvejen og varm til 37 °C i et vandbad i mindst 10 min før brug (tabel 1).
- Forbered plasmid DNA2,13,14 for viral emballage. (Tabel 2).
- Erhverve alle andre nødvendige materialer (tabel over materialer).
2. partikel produktion af lentivirus eller retrovirus
- Humant embryo nyre (HEK) 293T celle såning (Dag 1)
- Forbered 1 150 mm kulturfad ved belægning med 50 μg/mL poly-D-lysin opløst i fosfat bufferet saltvand (PBS; 10 mL/fad) i 1 time ved stuetemperatur (RT).
- Fjern fosfatbuffer saltvand (PBS)/poly-d-lysin, og vask den coatede skål to gange med 5 mL PBS.
- Frø 293T celler (8 \ u201210 x 106) i 293t medium (tabel 1) til et samlet volumen på 15 ml.
- Kultur 293T celler natten over i en standard vævskultur inkubator (37 °C, 5% CO2).
- Hek 293t celle transfektering (dag 2)
- Udfør transfektering, når cellerne har nået 70-80% sammenløbet (normalt ca. 24 timer efter såning 8 \ u201210 x 106 celler).
- Forbered transfektering blanding ved hjælp af en effektiv tilgang som en kommerciel kationisk Liposom formulering (tabel1 \ u20122, skema over materialer)2.
- Fortyndet lentivirus DNA-konstruktioner12 (totalt ~ 24 μg plasmid-DNA, tabel 2) i 1,2 ml transfektering medium og inkuberes i 5 min ved rt i 1,5 ml rør (tabel over materialer).
- Fortynd transfektering Regent (36 μl) i 1,2 ml transfektering medium (tabel over materialer) og inkuberes i 5-ml rør i 5 min i henhold til fabrikantens anvisninger.
- Tilsæt lentivirus reagens (trin 2.2.2.1) til transfektering reagens (trin 2.2.2.2) og bland forsigtigt ved langsom pipettering op og ned ved hjælp af et 5 ml pipet.
- Blandingen inkubates i 20 minutter ved RT.
- Vask forsigtigt 293t celler med 5 ml transfektering medium og Udskift med 10 ml transfektering medium.
- Tilsæt DNA-lipid komplekser (fra trin 2.2.2.3) dråbevis til medium af 293t celler og omhyggeligt blande medierne i kulturen retter ved at flytte i horisontale og lodrette retninger for at sikre lige fordeling af DNA-lipid komplekser i hver skål.
- Inkubér i 6 timer i en standard vævskultur-inkubator (37 °C, 5% CO2).
- Efter inkubation skal mediet udskiftes med 20 mL frisk virus opsamlings medium (tabel 1).
- Virus samling (dage 3 \ u20125)
- Indsaml virus mediet i 50 mL rør, og opbevar det i et 4 °C-køleskab for yderligere koncentration.
- Udskift 20 mL frisk virus opsamling medium hver 24 h og Kulturnatten (~ 24 h). Gentag medie samlingen i løbet af de næste 2 dage (dag 4 \ u20125).
- Sørg for, at den totale mængde medium indsamlet efter dag 5 er ~ 60 mL (20 mL/dag x 3 dage).
- Virus koncentration (dag 5)
- Centrifuger det indsamlede medie (60 mL) i 5 minutter ved 400 x g. Derefter passere supernatanten gennem et filter (0,45 μm porer) for at fjerne eventuelle cellulære snavs.
- Koncentrer virussen ved at tilsætte 15 mL filtrerede virus medier i en centrifugal filterenhed (tabel over materialer). Centrifugeres ved 2.500 x g i 15 minutter ved 4 °c. Fordi virussen ikke kan passere gennem dette filter, vil det være koncentreret i det øverste kammer af filteret.
- Indsug gennemstrømningen fra røret (nederste kammer) og tilsæt yderligere 15 mL resterende viral opsamlings medie supernatanten til den samme centrifugal filterenhed. Centrifugeres som ovenfor (2.500 x g i 15 minutter ved 4 °c) for at koncentrere yderligere virus fra supernatanten.
- Gentag processen med det samme filter for 60 mL-mediet fra en enkelt transduceret plade, indtil den ønskede koncentration er nået (~ 100 gange).
Bemærk: vi koncentrerer typisk ~ 60 mL virus indsamlings medier til ~ 600 μL. - Fjern den koncentrerede virus fra det øverste kammer af filteret ved hjælp af et 1 ml pipet, derefter alikvot og opbevar i 1,5 ml rør (50 u201260 μl/tube) ved-80 °c til senere brug. Opbevar koncentrerede partikler i op til 6 \ u201212 måneder.
3. isolerende Krypter
- Euthanize mus ved hjælp af CO2 i henhold til de lokale IACUC retningslinjer.
- Placer det euthaniserede dyr på ryggen og vask maven ved sprøjtning med 70% ethanol.
- Udfør en langsgående midterlinje indsnit fra brystbenet til lyden, incising huden først, og derefter det subkutane væv.
- Fjern tyndtarmen fra maven til cecum.
- Identificere regioner af interesse i tyndtarmen; Krypter kan isoleres fra duodenum, jejunum og ileum.
- Brug en 10 ml sprøjte til at skylle den isolerede tyndtarmen med Crypt-dissociations buffer (præ-kølet PBS indeholdende 1 mm ditiotreitol (DTT), 1% penicillin/streptomycin (no ca2 + og mg2 +)) i en 10 cm vævskultur skål (tabel 1)
- Fjerne perifert fedtvæv, og åbne eller "filet" tarm vævet længderetningen på en steril glasplade (15 cm x 15 cm).
- Forsigtigt skrabe den intestinale epitelial villi ved hjælp af en celle skraber.
- Skær tyndtarmen i 2 \ u20123 cm længde-kloge sektioner.
- Vævet overføres til et 15 mL rør, der indeholder præ-kølet PBS med flade pincet (116 mm). Vask vævs fragmenter ved at ryste kraftigt i hånden til ~ 30 s (flytning af røret i modsatte retninger ~ 60 gange).
- Opdater PBS og Gentag vask, indtil PBS bliver klar.
Bemærk: Vi vasker typisk fragmenterne 2 \ u20123 gange. - Væv Inkubér i et 15 mL konisk rør indeholdende 10 mL Crypt dissociations buffer (tabel 1) i 10 min ved 4 °c på en orbital shaker ved medium hastighed, når PBS er klar.
- Ryst kraftigt røret i hånden for ~ 30 s (modsat retninger ≈ 60 gange) og Overfør vævet ved hjælp af flade pincet til et andet 15 mL konisk rør indeholdende 10 mL Crypt dissociations buffer. Denne fraktion inkubates på is. Brug ikke den første fraktion til organoid kultur, fordi den indeholder primært villi.
- Gentag trin 3.11 \ u 20123.13 for 3 \ u20124 gange, indsamle hver fraktion og placere dem på is.
- Vælg den brøk, der er beriget med den højeste procentdel af intestinal Krypter ved at scanne 200 μL prøver fra hver fraktion under et inverteret mikroskop (4X). Identificer Krypter ved den typiske morfologi som beskrevet tidligere (figur 1a)10.
Bemærk: De vises runde eller ovale i form og indeholder granulerede Paneth celler. I modsætning hertil, villi er finger-lignende strukturer, der mangler granulære Paneth celler (figur 1b). - Den valgte fraktion passerer gennem en 40 μm celle-si for at opnå Krypter af tilsvarende størrelse, hvis det er nødvendigt. Alternativt isoleres Lgr5 + stamceller baseret på flowcytometri for grønt fluorescerende protein (GFP), hvis mus krydses på EGFP-Lgr5 +-baggrunden eller en anden egnet model, der muliggør identifikation af Lgr5 + celler2.
- Tæl det samlede antal Krypter i den valgte brøk som følger.
- Pipetten 50 μL af den valgte fraktion i et hemocytometer, og Tæl antallet af Krypter ved hjælp af et inverteret lysmikroskop (4X). Placer ~ 100 Krypter per brønd, når du bruger en 48-brønd plade for at give mulighed for transduktionseksperimenter, hvor 3 \ u20126 brønde vil blive transduceret pr. eksperimentel betingelse for genhæmning eller over ekspression.
- Baseret på antallet af Krypter pr 50 μL, beregne volumen af Crypt dissociation buffer nødvendig og overføre denne volumen til en 1,5 mL rør.
Bemærk: for eksempel tælles der 10 Krypter pr. 50 μL, 6 x 50 μL eller 300 μL for 300 Krypter.
- Centrifuge krypterne i 1,5-mL rørene ved 300 x g i 5 min.
- Kassér forsigtigt supernatanten ved forsigtigt at afpipettere det øvre flydende lag og resuspendere pellet i 100 μL vækstfaktor reduceret kælder membran matrix på is (tabel over materialer).
- Frø matrix-holdige Krypter i en 37 °C præ-varmet 48-brønd plade (30 μL/brønd, ~ 100 Krypter/brønd). Pladen inkubates i en standard vævskultur inkubator i 5 \ u201215 min for at tillade matrix gelering (37 °C, 5% CO2).
- Overlejring hver gel med 250 μL organoid Culture (ENR) medium (tabel 1) og Placer 48-brønd pladerne tilbage i en standard vævskultur inkubator (37 °c, 5% Co2). Tjek kulturerne for Crypt organisation i små, runde, cystiske figurer efter 24 h; knopper vil danne efter 2 \ u20125 dage.
- Udskift forsigtigt ENR-mediet hver 3. Fjern gamle ENR-medier med blid sugning, pas på ikke at røre ved matrixen, når mediet udskiftes.
- Passage organoid kulturer hver 4 \ u20127 dage som tidligere beskrevet11.
4. præparat til organoid fragment
- Organiske oider, når de dannes (inden for 1 \ u20122 uger) eller efter at være blevet passaged. For et enkelt transduktionseksperiment forberedes 2 \ u20123 brønde af dyrkede organoider i en 48-brønd plade pr. tilstand med ~ 100 \ u2012200 organoider/brønd eller ~ 200 \ u2012600 organoider pr. eksperimentel transduktionstilstand.
- Ombytningen ENR med 250 μL transduktionsmedier (tabel 1) og kultur i transduktionsmediet i 3 eller flere dage, eller indtil organoiderne vedtager en cystisk morfologi. Medtag både Wnt3a og ROCK-hæmmer (Y27632) i transduktionsmediet for at øge antallet af stamceller og Paneth cellerne; Nicotinamid (NIC) forbedrer kultur effektiviteten (Se transduktionsmedium i tabel 1).
- Mekanisk ruptur kuppel-lignende kælder membran matrixstruktur med medier og en pipet spids ved hjælp af en 1 mL pipet.
- Organoider og medier overføres til et sterilt 1,5 mL rør.
- Mekanisk forstyrre matrixen yderligere ved pipettering med en 200 μL pipet ~ 10 \ u201215 gange.
- Centrifuger organoide fragmenter ved RT ved 500 x g i 5 min.
- Supernatanten kasseres forsigtigt ved hjælp af en pipette, og pellet opslæmmes i 1 mL DMEM/F12-medium (tabel 1).
- Tilsæt Dispase I (6 μL ved 10 mg/mL) og DNase I (2,5 μL ved 10 mg/mL). Bland godt ved pipettering forsigtigt ved hjælp af et 1 mL pipet.
- Inkuber organoider ved 37 °C i 20 minutter i 1,5 mL røret.
- Tilsæt 500 μL ENR-mediet for at afbryde dissociations reaktionen. Serummet i ENR afslutter reaktionen.
- Passere organoide celler gennem en 20 μm celle sien og centrifuger organoide fragmenter ved 400 x g i 5 min.
- Resuspension af organoide fragmenter med 150 μL transduktionsmedium (tabel 1).
5. genteknologi af Organoider eller krypt celler ved viral transduktion
Bemærk: Se figur 2.
- Frø organoid celle klynger med 200 μL transduktionsmedium/brønd i en 48-brønd plade og Inkubér i en standard vævskultur inkubator (37 °C, 5% CO2). Alternativt kan du placere nyisolerede krypt celler (~ 1.000 Krypter) i 200 μL transduktionsmedium/brønd i en 48-brønd plade og inkubere i en standard vævskultur inkubator (37 °C, 5% CO2).
- Tø hætteglas med virus til transduktion giver mulighed for ~ 50 μL koncentreret virus til transduktion af hver brønd i 48-brønd plader eller ~ 100 μL koncentreret virus per brønd i 24-brønd plader.
- Incubate virus med 12 μL magnetisk nanopartikel opløsning i 15 min ved RT i et 1,5 mL rør (tabel 3).
- Tilsæt magnetisk nanopartikel opløsning/virus blanding til de celler, der skal transduced.
- Cellekultur pladen placeres på en magnet plade, og der inkubates i mindst 2 timer (og op til ~ 6 timer) i en standard vævskultur-inkubator (37 °C, 5% CO2).
6. såning af inficerede Organoid fragmenter
- Overfør de inficerede organoid celle klynger og transduktionsmedier fra hver brønd ind i et 1,5 mL rør.
- Centrifugeres ved 500 x g i 5 min.
- Supernatanten kasseres med blid sugning, og røret, der indeholder pellet på is, afkøles i 5 minutter.
- Tilsæt 120 μL kælder membran matrix og resuspension pellet ved pipettering langsomt op og ned.
- Frø 30 μL dråber af matrix-celle blandingen i en ny 48-brønd plade.
- Pladen inkubates ved 37 °C i 5 \ u201215 min., indtil matrixen størkner.
- Tilsæt transduktionsmedium til hver brønd og Inkuber i en standard vævskultur inkubator i 3 \ u20124 dage (37 °C, 5% CO2).
- Efter 3 \ u20124 dage, inspicere kulturer under et let mikroskop (10x) for at sikre organiseringen af celle klynger i organoid strukturer. Udskift derefter forsigtigt transduktionsmediet med 250 μL ENR-medium.
- Udskift medierne hver 3 \ u20124 dage.
7. udvælgelse (hvis relevant)
- Efter 2 \ u20123 dage tilsættes relevante antibiotika eller hormoner til udvælgelse til transduktionsmediet, hvis det er relevant.
Bemærk: Vi brugte puromycin (2 μg/ml) til udvælgelse af lentivrial transduktion fordi plasmider næret en puromycin resistens gen2,14.
8. bekræftelse af vellykket transduktion og genekspression eller lyddæmpningen
- Hvis du bruger fugw lentivirus2,14, estimerer transduktionseffektiviteten ved at måle gfp-signaler via fluorescerende mikroskop eller flow cytometri.
- Validerer gen-overekspression eller lyddæmpningen ved hjælp af kvantitativ reverse transkriptase-polymerase-kædereaktion (RT-PCR) til kvantitativ sammenligning af mRNA i kontrol og eksperimentel organoid-kulturer.
- Bekræft protein niveauer for protein-kodning genekspression eller hæmning af Western blot eller immunofarvning2.
9. organoid Kryosektion i kælder membran matrix
Bemærk: Se figur 3.
- Fjern ENR-mediet ved hjælp af en blid suge, og pas på ikke at pertura kælderen membran matrix og vask forsigtigt en gang med 500 μL PBS.
- Fastgør organoider med 1,0 mL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) opløsning (tabel over materialer) ved rt i 30 min.
- Fjern PFA ved sugning, og vask forsigtigt to gange med 1 mL PBS.
- Fjern PBS ved sugning og tilsæt 1,0 mL 30% saccharose buffer til hver prøve. Inkuber fikseret organoider i saccharose i 1 time ved 4 °C i et kølerum, køleskab eller på is for at dehydrere prøverne.
- Fjern saccharose buffer ved suge og tilføje lige nok indlejring sammensatte (tabel over materialer) til at dække matrix lag (~ 300 μl/brønd) i hver brønd.
- Inkuber ved RT i 5 min.
- Placer prøverne i en-80 °C fryser i 10 min, eller indtil indlejrings forbindelsen bliver solid og hvid.
- Placer skålen med frossen indlejrings forbindelse på RT for at give mulighed for minimal smeltning af forbindelsen langs kanterne. Brug en skalpel til at adskille blokken fra væggene i brønden.
- Fjern den sammensatte blok matrix-integrering ved hjælp af pincet, og Placer den i en objekt blok (f. eks. cryomold), der arbejder hurtigt for at forhindre smeltning.
- Fyld formen helt med indlejring sammensatte og fryse ved-80 °C i 30 min.
- Brug blokken er til skæring eller opbevaring i-80 °C fryser til videre brug.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her beskriver vi en hurtig og yderst effektiv transduktionsteknik, som udnytter magnetiske nanopartikler, der er udsat for et magnetfelt, til at levere lentivirus til celler af interesse. Med let tilgængelige værktøjer har vi anvendt denne fremgangsmåde ikke kun til at transduceres frisk isolerede krypt celler (figur 1a), men også til organoider (figur 2) og andre celler, der er refraktære over for mere rutinemæssige transduktionstilgange. Lentiviral partikler kan let konjugeres til magnetiske nanopartikler og de resulterende virus-nanopartitikomplekser leveres effektivt ved at anvende et magnetfelt ved hjælp af en magnet plade. For at optimere denne tilgang testede vi først lentiviral vektorer knyttet til GFP, således at GFP kunne bruges til at identificere transducerede celler med Fluorescens mikroskopi. GFP kan visualiseres på hvert trin i organoid udvikling, herunder tidligt Hvornår Crypt-celler organiseres i cyste lignende strukturer (figur 4a) eller på senere tidspunkter, når organoider danner knopper (figur 4b). Med succes transducerede intestinale organoider kan derefter gennemgå funktionelle analyse for ændringer i udviklingen ved farvning cellemembraner og kerner til at optælle det samlede celle nummer ud over Lineage markører, såsom lysozym at identificere Paneth celler ( Figur 4C).
De gensplejsede organoider kan anvendes til yderligere analyse ved at generere frosne sektioner som skitseret her (figur 3). Efter indlejring organoider, frosne blokke kan lagres og senere sektioneret til fremtidige undersøgelser. Denne fremgangsmåde er også effektiv (anslået til at være ~ 95% baseret på procentdel af GFP (+) organoider til totale organoider). Denne fremgangsmåde kan udføres med standard laboratoriereagenser, hvilket giver væv, der er modtagelig for forskellige undersøgelser, herunder celle nummer, celle skæbne, og tilstedeværelsen og niveauerne af specifikke proteiner2. For eksempel brugte vi frosne sektioner og immunfluorescent farvning til at identificere individuelle celler og fastslå celletype (figur 4c).
Figur 1: isolerede krypter og villi med tegnefilm, der viser typisk morfologi. (A) isolerede Krypter danner runde eller ovale strukturer. B) villi identificeres som finger lignende konstruktioner. Scale bar = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: skematisk viral transduktion af organoider ved hjælp af magnetiske nanopartikler og eksponering for et magnetfelt. De mest kritiske trin i transduktionsprotokollen vises. (A) incubate virus og magnetisk nanopartikel opløsning i 15 min ved RT i et 1,5 ml rør. B) Tilsæt den magnetiske nanopartikler/virus blanding til de celler, der skal transducere. C) Placer cellekultur pladen på magnet pladen og Inkuber i 2 timer i en standard vævskultur-inkubator. Længere inkubationstider kan også anvendes (~ 6 h); repræsentanten godt er vist her på magnet pladen. D) en celle, der er blevet transduceret med virusset, og magnetisk nanopartikel vises. (E) overføre de inficerede organoid celle klynger og transduktionsmedier fra hver brønd til et 1,5 ml rør og centrifugeres ved 500 x g i 5 min. kassér supernatanten med blid sugning og Afkøl røret, der indeholder pellet på is i 5 min. f) Tilsæt 120 μL af kælderen membran matrix og resuspendere pellet ved pipettering langsomt op og ned. G) frødråber på 30 μl indeholdende matrixcelle blandinger i hver brønd i en ny 48-brønd plade. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: skematisk af frosset skæring af organoider i 3D matrix. De mest kritiske trin i den frosne sektionerings protokol vises. A) en enkelt brønd inden for en 24-brønd cellekultur plade er afbildet. (B) Tilsæt lige nok indlejrings forbindelse til at dække matrixlaget (~ 300 μl/brønd) og INKUBER ved rt i 5 min.c) placer prøverne ved-80 C i en fryser i 10 min. eller indtil indlejrings forbindelsen bliver solid og hvid. Derefter skal du placere skålen på RT for at give mulighed for let smeltning langs kanterne af prøven. (D) bruge en skalpel til at adskille blokken fra væggene i brønden. E) Fjern den sammensatte blok af matrix indlejring ved hjælp af pincet, og Placer den i en passende lavvandet beholder eller skimmelsvamp til frysning af væv. Fyld formen helt med indlejrings forbindelse (OCT). (F) fryse blokken ved-80 C i en fryser i 30 min.G) blokken er klar til skæring eller opbevaring i-80 c fryser til videre brug. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: repræsentative billeder af transducerede intestinale organoider. A) repræsentativt billede af små intestinale organoider under let mikroskop,derviser (venstre) Fluorescens mikroskopi, og (højre) standard mikroskopi af transgenekspression (egfp) på dag 3 efter transduktion. Scale bar = 50 μm.B) eksempel på overekspression af genkodning af gfp i organoid efter transduktion ved hjælp af magnetiske nanopartikler. Organoide celler blev transduceret med lentivirus, der udtrykker GFP (FUGW; Top) eller lentivirus overudtrykker Hmga1 (fugw-Hmga1; I bunden) som vist på dag 12 efter transduktion. Scale bar = 50 μm.C) immunofluorescenbilleddannelse af formalin fastfrosset del af organoider. Organoide sektioner (4 μm) blev plettet med anti-lysozym (rød), anti-EpCAM (grøn) og DAPI (blå). Epcam afgrænses beskyttelses cellegrænser, dapi indikerede individuelle kerner, og lysozym pletter Paneth celler. Scale bar = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Organoid-kulturmedium (ENR) | 100 mL |
| DMEM/F12 + | 96 mL |
| L-alanyl-L-glutamin dipeptid supplement (f. eks. Glutamax) | 1 mL |
| NEAA | 1 mL |
| Pen/STREP | 1 mL |
| HEPES | 1 mL |
| EGF (100 μg/mL) | 5 μL |
| Noggin (100 μg/mL) | 10 μL |
| R-spondin (100 μg/mL) | 10 μL |
| eller R-spondin-tilstand medium (CM) | 20 mL |
| Humant rekombinant insulin (10 mg/mL) | 5 μL |
| Transduktionsmedium | 5 mL |
| ENR medium | 2,4 mL |
| WNT-tilstands medium (CM) | 2,5 mL |
| Nicotinamid (1M) | 100 μL |
| Y27632 (10 μM) | 10 μL |
| Krypter dissociation buffer | 100 mL |
| PBS (uden ca2 +, mg2 +) | 99 mL |
| Pen/STREP | 1 mL |
| 0,5 M EDTA | 100 μL |
| 0,1 M DTT (dithiothreitol) | 100 μL |
| 293T medium | 100 mL |
| DMEM | 90 mL |
| Fbs | 10 mL |
| Virus indsamling medium | 100 mL |
| DMEM | 99 mL |
| Fbs | 1 mL |
| Organoid fordøjelses buffer | 1 mL |
| DMEM/F12 + | 1 mL |
| Dispase I (10 mg/mL) | 6 μL |
| DNase I (10 mg/mL) | 2,5 μL |
Tabel 1: medier, der anvendes i protokollen.
| Plader | 10 cm | 15 cm |
| Lentivirus, transducere Vector | 6 μg | 9 μg |
| CMVΔR 8.91 | 8 μg | 12 μg |
| Md. G | 2 μg | 3 μg |
| Total vektorer | ≤ 16 μg | ≤ 24 μg |
Tabel 2: mængden af plasmid-DNA til transfection.
| Plade | Magnetiske perler (μL) | Mængde virus (μL) | Endelig TransductionVolume (μL) |
| 48-godt | 6 | 50 | 250 |
| 24-Well | 12 | 100 | 500 |
Tabel 3: volumen af magnetisk perle opløsning og vektor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Primær kultur af voksne tarm epitelet som organoider giver et kraftfuldt værktøj til at studere molekylære mekanismer involveret i stamcelle funktion, intestinal epitelial homøostase, og patologi1,2,3, 4. Selv om CRISPR/Cas9 teknologi kan bruges til genetisk ingeniør organoids9, er det begrænset af behovet for omfattende screening og udvælgelse baseret på Sekvensanalyse for de ønskede genetiske ændringer. Målet med denne protokol er at give klare og præcise instruktioner med video-baserede tutorials for magnetisk nanopartikel levering af Lenti-eller retrovirus til intestinale organoider, efterfulgt af frosne skæring til yderligere analyse.
Denne protokol er en hurtig og effektiv metode til genetisk ingeniør tarm organoider og analysere konsekvenserne af gen overekspression eller hæmning fra frosne sektioner. Kritiske trin er skitseret i figur 2, figur 3. Denne strategi giver mulighed for undersøgelse af den biologiske betydning af genetiske ændringer (overekspression eller hæmning) i tarm stamceller og deres afkom kultiveret under 3D-betingelser2,13. Vi har også brugt denne magnetiske nanopartikel-baserede levering af virale vektorer til at forbedre celle transduktion og transgene udtryk in vitro i forskellige primære celler2,13.
Med denne fremgangsmåde er virale partikler belagt med magnetiske nanopartikler og leveret til celler ved udsættelse for et magnetfelt. Sammenlignet med nuværende transduktionsmetoder, såsom polybrene med eller uden spinoculation10,15, er magnetiske nanopartikel-virale komplekser mindre giftige for celler, fordi optagelsen af det genetiske materiale medieres af endokytose og pinocytose, to naturligt forekommende biologiske processer, der ikke fremkalder betydelig skade på cellemembraner. Således, både cellelevedygtighed og transduktiviteten forbedres. Transduktion effektivitet kan øges yderligere ved hjælp af små Crypt fragmenter eller enkeltceller (Se trin 4,8) i stedet for større Krypter eller hele organoider som rapporteret tidligere2,10,13,16. Magnetisk guidet nanopartikel levering resulterer i hurtig ophobning, penetration, og optagelse af virale vektorer i målcellerne2,13. De magnetiske nanopartikler er lavet af jernoxid, som er fuldt biologisk nedbrydeligt og belagt med specifikke proprietære kationiske molekyler. Nanopartikel Association med virale vektorer opnås ved salt-induceret kolloid aggregering og elektrostatiske interaktioner. Nanopartiklerne koncentreres derefter på cellerne ved et udvendigt magnetfelt, der genereres af magnet pladen, som er placeret under kultur skålen. Mens transduktiviteten nærmer sig 95%, er ikke alle celler transducerede, hvilket er en begrænsning til denne teknik. Desuden, endogent udtrykte gener af interesse er ikke ændret som med crispr/Cas9 tilgange.
Efter genekspression eller hæmning af genet kan organoiderne anvendes til et utal af undersøgelser, afhængigt af de videnskabelige mål, herunder analyse af genekspression, proteomiske ændringer i cellerne eller udskillet af celler, metaboliske ændringer og morfologiske ændringer. Som med levende væv, frosne sektioner kan fås til immunhistokemiske og immunofluorescens undersøgelser af specifikke proteiner såsom transkriptionsfaktorer, cytoplasmiske molekyler, eller celleoverflade markører. Vores artikel indeholder en effektiv tilgang til at opnå frosne sektioner fra organoider uden at forstyrre deres position og organisation i 3D-kultur. Dette er fordelagtigt, fordi tidligere teknikker kræver fjernelse af organoid fra kælderen membran matrix før frysning16. Behandling af organoider ved fjernelse fra matrix kunne forstyrre den strukturelle organisation af organoid snarere end afspejle in vitro vækst og udvikling.
Denne protokol til genetisk ingeniør intestinale organoider kan også tilpasses til at studere andre celle-baserede modeller og organoid-systemer. For eksempel, pancreas, colonic, hepatisk, hjerte, og cerebrale organoid systemer kunne være transduceret med denne tilgang. Selv celler vokser under mere standard kultur teknikker er modtagelig for nanopartikel teknologi. Desuden kan denne fremgangsmåde anvendes til at studere de molekylære mekanismer af sygdomme, ikke kun i forbindelse med stamcelle-afledte organoid-systemer, men også i tumor organoider.
Sammenfattende vil de vigtigste ændringer, der er beskrevet i disse protokoller for intestinale organoid-undersøgelser, forhåbentlig give forskerne mulighed for at belyse rollen for vigtige faktorer og downstream-veje, der er involveret i tarm stamcellernes biologi og deres afkom . Disse tilgange bør give mulighed for at lære mere om molekylære mekanismer underliggende selvfornyelse, celle skæbne bestemmelse, væv homøostase, og intestinal epitel regenerering, under både fysiologiske og patologiske forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institute of Health (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), Maryland stamcelleforskning fond (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), American Lung Association, den Allegheny Health Network-Johns Hopkins forskningsfond og Hopkins fordøjelsessygdomme grundlæggende forskning kerne Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Base medium for 293T cells |
| DMEM/F12+ | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer |
| OPTI-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Virus plasmids transfection medium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | Component of virus collection medium and 293T medium |
| Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer |
| PBS (without Ca2+, Mg2+) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | A wash buffer and component of crypt dissociation buffer |
| Mem-NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Component of organoid culture medium |
| GlutamaxII | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Component of organoid culture medium |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Component of organoid culture medium |
| EGF | Millipore Sigma | E9644 | Component of organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 250-38 B | Component of organoid culture medium |
| R-spondin | R&D | 7150-RS-025/CF | Component of organoid culture medium |
| Human recombinant insulin | Millipore Sigma | I9278-5ml | Component of organoid culture medium |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N3376-100G | Component of Transduction medium |
| Wnt3A | R&D | 5036-WN-010 | Component of Transduction medium |
| Y27632 | Millipore Sigma | Y0503-1MG | Component of Transduction medium |
| 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Component of Crypts dissociation buffer |
| DTT (dithiothreitol) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | Component of Crypts dissociation buffer |
| Dispase I | Millipore Sigma | D4818-2MG | Component of organoid digestion buffer |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Component of organoid digestion buffer |
| matrigel(Growth factor reduced) | Corning | 356231 | Used as a matrix to embed organoids |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Medium for transfection in viral production |
| ViralMag R/L | Oz Biosiences | RL40200 | Magnetic particles of viral transduction |
| Magnetic plate | Oz Biosiences | MF10000 | Magnetic plate to facilitate viral transduction |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Transfection agent in viral production |
| Poly-D-Lysine | Millipore Sigma | A-003-E | Coating for plates before seeding 293T cells |
| 4% Formaldehyde Solution | Boster | AR1068 | Solution to fix organoids |
| O.C.T embedding compound | Thermo Fisher Scientific | 4583S | For embedding of the the organoids |
| 5 mL Falcon polystyrene tubes | Corning | 352054 | |
| 50 mL Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.100 | |
| Orbitron rotator II Rocker Shaker | Boekel Scientific | 260250 | |
| Olympus Inverted microscop CK30 | Olympus | CK30 | for scanning and counting crypts |
| Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence | Nikon | Axiovert 200 | for viewing fluorescence in the crypts |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane | Milipore Sigma | UFC910024 | For concentrating viruses |
| pluriStrainer 20 µm (Cell Strainer) | pluriSelect | SKU 43-50020 | For preparing organoid fragments |
| Falcon Cell Strainer | Fisher Scientific | 352340 | For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid) | Millipore Sigma | M8937-100EA | ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments |
| Animal strain: C57BL/6J | Jackson Lab | #000664 | For organoid culture |
References
- Cheung, E. C., et al. TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis. Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).
- Xian, L., et al. HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche. Nature Comm. , (2017).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).
- Kabiri, Z., et al. Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts. Development. 141, 2206-2215 (2014).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. J Vis Exp. (120), (2017).
- Muñoz, J., et al. The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent '+4' cellmarkers. EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).
- Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture. J Vis Exp. (90), e51765 (2014).
- Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).
- Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells. Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Tesfaye, A., et al. The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis. Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).
- Haim, H., et al. Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus. J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).
- Xue, X., Shah, Y. M. In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors. J Vis Exp. (75), e50210 (2013).
