Summary
We beschrijven stap-voor-stap instructies voor: 1) efficiënt ingenieur intestinale organoïden met behulp van magnetische nanodeeltjes voor Lenti-of retrovirale transductie, en, 2) het genereren van bevroren secties van engineered organoïden. Deze aanpak biedt een krachtig hulpmiddel om de genexpressie in organoïden efficiënt te veranderen voor onderzoek naar stroomafwaartse effecten.
Abstract
Intestinale organoïde culturen bieden een unieke kans om te onderzoeken intestinale stamcel en crypt biologie in vitro, hoewel efficiënte benaderingen voor het manipuleren van genexpressie in organoïden beperkte vooruitgang in deze arena hebben gemaakt. Hoewel crispr/Cas9 technologie het mogelijk maakt om cellen te bewerken voor organoïde generatie, vereist deze strategie een uitgebreide selectie en screening door sequentieanalyse, wat zowel tijdrovend als kostbaar is. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor efficiënte virale transductie van intestinale organoïden. Deze aanpak is snel en zeer efficiënt, waardoor de tijd en kosten die inherent zijn aan CRISPR/Cas9 technologie afnemen. We presenteren ook een protocol voor het genereren van bevroren delen van intacte organoïde culturen voor verdere analyse met immunohistochemische of immunofluorescentie kleuring, die kan worden gebruikt om genexpressie of uitschakeling te bevestigen. Na succesvolle transductie van virale vectoren voor genexpressie of geluids dempings wordt bereikt, kunnen de intestinale stamcel en de crypte functie snel worden beoordeeld. Hoewel de meeste organoïde-onderzoeken in vitro testen gebruiken, kunnen organoïden ook bij muizen worden afgeleverd voor in-vivo-functionele analyses. Bovendien zijn onze benaderingen voordelig bij het voorspellen van therapeutische reacties op geneesmiddelen, omdat momenteel beschikbare therapieën doorgaans functioneren door het moduleren van genexpressie of eiwit functie in plaats van het genoom te veranderen.
Introduction
De mogelijkheid om te cultuur muis of menselijke crypten cellen als driedimensionale (3D) organoïden uit de dunne darmen of dikke darm over langere tijd perioden voorzien van een grote doorbraak, omdat deze culturen weergeven definiëren kenmerken van intestinale epitheel in vivo 1 , 2 , 3. organoïden afgeleid van primaire crypten zijn in staat om zelf vernieuwing en zelforganisatie, exposeren cellulaire functies vergelijkbaar met hun weefsels van oorsprong. Inderdaad, organoïden recapituleren niet alleen de structurele organisatie van crypten in vivo, maar ook veel moleculaire kenmerken, waardoor het verstrekken van nuttige instrumenten om normale biologie en ziektetoestanden te bestuderen. Ter illustratie, organoïde studies hebben aangetoond dat nieuwe moleculaire trajecten die betrokken zijn bij weefselregeneratie1,2,3,4,5 en geneesmiddelen die de functie kunnen verbeteren in pathologische instellingen6,7.
De studie van intestinale stamcellen is van bijzonder belang omdat de intestinale voering behoort tot de meest zeer regeneratieve zoogdier weefsels, die zich elke 3-5 dagen vernieuwt om het organisme te beschermen tegen bacteriën, toxines en andere pathogenen binnen de intestinale lumens. Intestinale stamcellen (iSCS) zijn verantwoordelijk voor dit opmerkelijke regeneratieve vermogen en bieden zo een uniek paradigma voor het bestuderen van de volwassen stamcel functie1,2. Lineage-tracing experimenten bij muizen toonden aan dat geïsoleerde Lgr5-positieve stamcellen gekweekt kunnen worden om 3D-organoïden of ' mini-Guts ' in vitro te genereren, waar ze hun in vivo-tegenhangers nauwkeurig weerspiegelen. Organoïde culturen kunnen ook worden afgeleid van intestinale crypte van cellen die bestaan uit voor ouders, ISCs en Paneth, waarvan de laatste de epitheliale niche cellen in vivo vormen. In feite is de organoïde cultuur uit primaire intestinale crypte cellen geëvolueerd tot een relatief routinematige techniek die gemakkelijk te implementeren is in de meeste laboratoria met behulp van algemeen beschikbare reagentia. Dit model is ook vatbaar voor kwantitatieve analyse van genexpressie door RNA-sequencing (RNA-SEQ) en eiwitten door massaspectrometrie, Immunohistochemie of immunofluorescentie kleuring2,4,8. Daarnaast kan functionele genetica worden bestudeerd met behulp van gain-of-function (gen-overexpressie of expressie van een activerend Mutant gen) of verlies van functie (gen-uitschakeling of expressie van een verlies-van-functie Mutant) benaderingen2.
Belangrijk, laag rendement en hoge toxiciteit van standaard plasmide DNA of virale transductie protocollen met polybrene blijven een grote hindernis in het veld. Hoewel CRISPR/Cas9 technologie een precieze genoom bewerking mogelijk maakt, vereist deze aanpak tijdrovende selectie gevolgd door sequentie validatie9. Hier presenteren we een virale transductie protocol voor primaire intestinale organoïden dat de levering van virale deeltjes optimaliseert door conjugatie aan magnetische nanopartikels en de toepassing van een magnetisch veld. Belangrijke wijzigingen in de voorafgaande protocollen4,5,10,11,12,13 en aanbevelingen ter verbetering van de efficiëntie worden verstrekt. We beschrijven ook een aanpak voor het genereren van bevroren secties van intacte organoïden gekweekt in 3D matrigel (hierna te noemen kelder membraan matrix of matrix) voor verdere analyse met immunohistochemie of immunofluorescentie kleuring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol werd goedgekeurd door de Johns Hopkins Medical instellingen Animal Care en use Committee (IACUC). Dit protocol is gewijzigd van een eerder gepubliceerde methoden10,11,12,13.
1. bereiding van de reagentia
- Bereid vers 293T medium enkele uren van tevoren en warm tot 37 °C in een waterbad gedurende ten minste 10 minuten voor gebruik (tabel 1).
- Bereid plasmide DNA2,13,14 voor virale verpakking. (Tabel 2).
- Verkrijg alle andere vereiste materialen (tabel met materialen).
2. lentivirus-of retrovirus deeltjes productie
- Menselijke embryo nier (HEK) 293T celseeding (Dag 1)
- Bereid 1 150 mm kweek schaal met coating met 50 μg/mL poly-D-Lysine opgelost in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; 10 mL/schotel) voor 1 uur bij kamertemperatuur (RT).
- Verwijder de fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)/poly-D-lysine en was de gecoate schotel tweemaal met 5 mL PBS.
- Zaad 293T cellen (8 \ u201210 x 106) in 293t medium (tabel 1) tot een totaal volume van 15 ml.
- Cultuur 293T cellen overnachten in een standaard weefselkweek incubator (37 °C, 5% CO2).
- HEK 293T celtransfectie (dag 2)
- Voer transfectie zodra cellen hebben bereikt 70-80% samenloop (meestal ongeveer 24 h na zaaien 8 \ u201210 x 106 cellen).
- Bereid transfectie mengsel met behulp van een efficiënte aanpak, zoals een commerciële kationische liposoom formulering (tabellen 1 \ u20122, tabel van de materialen)2.
- Verdun lentivirus DNA constructies12 (totaal ~ 24 μg plasmide DNA, tabel 2) in 1,2 ml transfectie medium en inincuberen gedurende 5 min bij RT in 1,5 ml buizen (tabel van de materialen).
- Verdun transfectie regent (36 μL) in 1,2 mL transfectie medium (tabel met materialen) en inincuberen in 5-ml buisjes gedurende 5 min volgens de instructies van de fabrikant.
- Voeg het lentivirusreagens (stap 2.2.2.1) toe aan het transfectie-reagens (stap 2.2.2.2) en meng zachtjes met een pipet van 5 ml met langzaam pipetteren.
- Inbroed het mengsel gedurende 20 minuten bij RT.
- Spoel 293T cellen voorzichtig af met 5 mL transfectie medium en vervang deze door 10 mL transfectie medium.
- Voeg de DNA-lipide-complexen (van stap 2.2.2.3) druppelsgewijs toe aan het medium van 293t cellen en meng de media zorgvuldig in de cultuur gerechten door horizontale en verticale richtingen te bewegen om gelijke verdeling van de DNA-lipidecomplexen in elk gerecht te garanderen.
- Incueren voor 6 h in een standaard incubator voor weefselkweek (37 °C, 5% CO2).
- Na incubatie, de media vervangen door 20 mL vers virus opvang medium (tabel 1).
- Virus Collection (dagen 3 \ u20125)
- Verzamel virus media in buizen van 50 mL en bewaar in een koelkast van 4 °C voor verdere concentratie.
- Vervang 20 mL vers virus opvang medium elke 24 uur en cultuur 's nachts (~ 24 uur). Herhaal de mediaverzameling gedurende de volgende 2 dagen (dagen 4 \ u20125).
- Zorg ervoor dat de totale hoeveelheid medium verzameld na dag 5 is ~ 60 mL (20 mL/dag x 3 dagen).
- Virus concentratie (dag 5)
- Centrifugeer de verzamelde media (60 mL) gedurende 5 min bij 400 x g. Vervolgens passeert u het supernatant door een filter (poriën van 0,45 μm) om celresten te verwijderen.
- Concentreer het virus door 15 mL gefilterde virus media toe te voegen in een centrifugale filter Unit (tabel met materialen). Centrifugeer bij 2.500 x g gedurende 15 minuten bij 4 °c. Omdat het virus dit filter niet kan passeren, zal het geconcentreerd worden in de bovenste kamer van het filter.
- Zuig de doorstroming van de buis (onderste kamer) en voeg nog eens 15 mL overgebleven virale inzamel media supernatant toe aan dezelfde centrifugale filter unit. Centrifugeer zoals hierboven (2.500 x g gedurende 15 minuten bij 4 °c) om extra virus van het supernatant te concentreren.
- Herhaal het proces met behulp van hetzelfde filter voor 60 mL media van een enkele getransduceerde plaat tot de gewenste concentratie is bereikt (~ 100-fold).
Opmerking: we concentreren ons meestal ~ 60 mL van de virus verzamelings media tot ~ 600 μL. - Verwijder het geconcentreerde virus uit de bovenste kamer van het filter met behulp van een pipet van 1 mL, vervolgens aliquot en bewaar in 1,5 mL buisjes (50 \ u201260 μL/buis) bij-80 °C voor later gebruik. Bewaar geconcentreerde deeltjes tot 6 \ u201212 maanden.
3. isoleren crypten
- Euthanize muizen met behulp van CO2 volgens de lokale IACUC richtlijnen.
- Plaats het geëeuthaniseerde dier op zijn rug en was de buik door te spuiten met 70% ethanol.
- Voer een longitudinale middenlijn incisie van het borstbeen naar de lies, insnijding van de huid eerst, en vervolgens het subcutane weefsel.
- Verwijder de dunne darm van de maag naar de Cecum.
- Identificeer regio's van belang binnen de dunne darm; crypten kunnen worden geïsoleerd uit de twaalfvingerige darm, jejunum en ileum.
- Spoel met een injectiespuit van 10 ml de geïsoleerde dunne darm met een crypt dissociatie buffer (voorgekoelde PBS met 1 mm dithiotreïtol (DTT), 1% penicileen/streptomycine (no CA2 + en mg2 +)) in een 10 cm-weefselkweek schaal (tabel 1)
- Verwijder perifeer vetweefsel en open of "filet" het darmweefsel longitudinaal op een steriele glazen plaat (15 cm x 15 cm).
- Schrapen de intestinale epitheliale Villi voorzichtig met behulp van een celscraper.
- Snijd de dunne darm in 2 \ u20123 cm lengte-Wise secties.
- Breng het weefsel over in een buis van 15 mL die voorgekoelde PBS met platte Tang (116 mm) bevat. Was de weefsel fragmenten door krachtig schudden met de hand voor ~ 30 s (verplaatsen van de buis in tegengestelde richtingen ~ 60 keer).
- Vernieuw de PBS en herhaal wassen totdat de PBS duidelijk wordt.
Opmerking: we wassen meestal de fragmenten 2 \ u20123 keer. - Inbroed het weefsel in een conische buis van 15 mL met 10 mL crypt dissociatie buffer (tabel 1) gedurende 10 minuten bij 4 °c op een rondschudapparaat met een gemiddelde snelheid zodra de PBS helder is.
- Schud de buis krachtig met de hand voor ~ 30 s (tegenovergestelde richtingen ≈ 60 keer) en breng het weefsel over met platte Tang naar een andere conische buis van 15 mL met 10 mL crypte dissociatie buffer. Incuberen deze breuk op ijs. Gebruik de eerste fractie niet voor de organoïde cultuur omdat deze voornamelijk Villi bevat.
- Herhaal stap 3.11 \ u 20123.13 voor 3 \ u20124 keer, het verzamelen van elke breuk en het plaatsen van hen op ijs.
- Selecteer de breuk die is verrijkt met het hoogste percentage intestinale crypten door het scannen van 200 μL monsters van elke fractie onder een omgekeerde Microscoop (4x). Identificeer crypten door de typische morfologie zoals eerder beschreven (Figuur 1a)10.
Opmerking: Ze verschijnen rond of ovaal in vorm en bevatten gegranuleerde Paneth cellen. Villi daarentegen zijn vingerachtige structuren zonder de korrelige Paneth cellen (Figuur 1b). - Geef de geselecteerde breuk door een 40 μm celzeef om crypten van vergelijkbare grootte te verkrijgen indien nodig. U ook Lgr5 + stamcellen isoleren op basis van Flowcytometrie voor groene fluorescerende eiwitten (GFP) als muizen worden gekruist op de EGFP-Lgr5 + achtergrond of een ander geschikt model dat identificatie van Lgr5 + cellen2mogelijk maakt.
- Tel het totale aantal crypten in de geselecteerde breuk als volgt.
- Pipetteer 50 μL van de geselecteerde Fractie in een hemocytometer en Tel het aantal crypten met behulp van een omgekeerde lichtmicroscoop (4x). Plaats ~ 100 crypten per put bij het gebruik van een 48-Wells plaat om toe te staan voor de transductie experimenten waarin 3 \ u20126 putten zullen worden getransduceerde per experimentele toestand voor gen uitschakeling of overexpressie.
- Op basis van het aantal crypten per 50 μL, bereken het volume van de Crypt dissociatie buffer nodig en breng dat volume over in een buis van 1,5 mL.
Opmerking: bijvoorbeeld, 10 crypten per 50 μL worden geteld, 6 x 50 μL of 300 μL zijn nodig voor 300 crypten.
- Centrifugeer de crypten in de 1,5-mL tubes bij 300 x g gedurende 5 minuten.
- Gooi het supernatant voorzichtig weg door de bovenste vloeistof laag zachtjes te pipetteren en breng de pellet in 100 μL groeifactor verlaagde kelder membraan matrix op ijs (tafel van materialen).
- Zaai de matrix-bevattende crypten in een 37 °C voorverwarmde 48-goed plaat (30 μL/goed, ~ 100 crypten/goed). Incueren van de plaat in een standaard weefselkweek incubator voor 5 \ u201215 min voor het toestaan van matrix gelatie (37 °C, 5% CO2).
- Overlay elke gel met 250 μL organoïde Culture (ENR) medium (tabel 1) en plaats de 48-well-platen terug in een standaard incubator voor weefselkweek (37 °c, 5% Co2). Controleer de culturen voor crypt organisatie in kleine, ronde, cystische vormen na 24 h; knoppen worden na 2 \ u20125 dagen vorm.
- Vervang de ENR-media voorzichtig elke 3 dagen. Verwijder oude ENR-media met zachte zuigkracht, zorg dat u de matrix niet aanraakt bij het vervangen van media.
- Passage organoïde culturen elke 4 \ u20127 dagen zoals eerder beschreven11.
4. voorbereiding organoïde fragment
- Het vormen van organoïden zodra ze vorm hebben (binnen 1 \ u20122 weken) of nadat ze zijn gepasseerde. Voor een enkele transductie-experiment, bereid 2 \ u20123 putten van gekweekte organoïden in een 48-goed plaat per aandoening met ~ 100 \ u2012200 organoïden/goed of ~ 200 \ u2012600 organoïden per experimentele transductie conditie.
- Exchange ENR met 250 μL transductie media (tabel 1) en cultuur in de transductie media gedurende 3 of meer dagen of totdat de organoïden een Cystic morfologie aannemen. Zowel Wnt3a als ROCK remmer (Y27632) in het transductie medium opnemen om het aantal stam-en Paneth cellen te verhogen; Nicotinamide (NIC) verbetert de efficiëntie van de cultuur (Zie transductie medium in tabel 1).
- Mechanisch ruptuur de koepel-achtige kelder membraan matrixstructuur met media en een pipetpunt met behulp van een 1 mL pipet.
- Breng de organoïden en de media over naar een steriele 1,5 mL Tube.
- De matrix verder mechanisch verstoren door pipetteren met een pipet van 200 μL ~ 10 \ u201215 keer.
- Centrifugeer de organoïde fragmenten bij RT bij 500 x g gedurende 5 minuten.
- Gooi het supernatant voorzichtig weg met een pipet en regeer de pellet in 1 mL DMEM/F12 medium (tabel 1).
- Voeg Dispase I (6 μL bij 10 mg/mL) en DNase I (2,5 μL bij 10 mg/mL) toe. Meng goed door Pipetteer zachtjes met een pipet van 1 mL.
- Inincuberen organoïden bij 37 °C gedurende 20 minuten in de buis van 1,5 mL.
- Voeg 500 μL ENR-media toe om de dissociatie reactie te beëindigen; het serum in de ENR beëindigt de reactie.
- Passeer de organoïde cellen door een celzeef van 20 μm en centrifugeer de organoïde fragmenten gedurende 5 minuten bij 400 x g .
- Respendeer organoïde fragmenten met 150 μL transductie medium (tabel 1).
5. genetische manipulatie van Organoïden of crypte cellen door virale transductie
Opmerking: Zie Figuur 2.
- Zaad organoïde-celclusters met 200 μL transductie medium/well in een 48-well-plaat en incueren in een standaard kweek-incubator (37 °c, 5% Co2). U ook vers geïsoleerde crypt cellen (~ 1.000 crypten) in 200 μL transductie medium/well in een 48-well-plaat plaatsen en incueren in een standaard kweek-incubator (37 °C, 5% CO2).
- Ontdooien injectieflacons met virus voor transductie voor ~ 50 μL geconcentreerd virus voor transductie van elk goed in 48-put platen of ~ 100 μL geconcentreerd virus per put in 24-Well platen.
- Incuberen virus met 12 μL magnetische nanodeeltjes oplossing gedurende 15 minuten bij RT in een buis van 1,5 mL (tabel 3).
- Voeg de magnetische nanodeeltjes oplossing/virus mengsel toe aan de cellen die moeten worden transduced.
- Plaats de celkweek plaat op een magnetische plaat en inculeer gedurende ten minste 2 uur (en tot ~ 6 h) in een standaard kweek couveuse (37 °C, 5% CO2).
6. zaaien van geïnfecteerde Organoïde fragmenten
- Breng de geïnfecteerde organoïde celclusters en transductie media van elke put over in een tube van 1,5 ml.
- Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 min.
- Gooi het supernatant met zachte zuigkracht weg en koel de buis met de pellet op ijs gedurende 5 minuten.
- Voeg 120 μL van de kelder membraan matrix toe en breng de pellet door en Pipetteer langzaam op en neer.
- Zaad 30 μL druppels van het matrix-celmengsel in een nieuwe 48-well plaat.
- Inincuberen van de plaat bij 37 °C gedurende 5 \ u201215 min totdat de matrix stolt.
- Voeg transductie medium toe aan elk goed en incueren in een standaard weefselkweek incubator voor 3 \ u20124 dagen (37 °C, 5% CO2).
- Inspecteer na 3 \ u20124 dagen culturen onder een lichte Microscoop (10x) om de organisatie van celclusters in organoïde structuren te verzekeren. Vervang vervolgens de transductie media voorzichtig door 250 μL ENR medium.
- Vervang media elke 3 \ u20124 dagen.
7. selectie (indien van toepassing)
- Voeg na 2 \ u20123 dagen relevante antibiotica of hormonen toe voor selectie naar het transductie medium, indien van toepassing.
Opmerking: We gebruikten puromycine (2 μg/ml) voor de selectie van de lentivriale transductie omdat plasmiden een puromycine resistentie gen2,14verveeld.
8. bevestiging van succesvolle transductie en genexpressie of uitschakeling
- Bij gebruik van fugw lentivirus2,14, schatting transductie efficiëntie door het meten van GFP signalen via fluorescerende Microscoop of flow cytometrie.
- Valideer genen overexpressie of uitschakeling met behulp van kwantitatieve reverse transcriptase polymerase kettingreactie (RT-PCR) voor kwantitatieve vergelijking van mRNA in de controle en experimentele organoïde culturen.
- Bevestig de eiwit niveaus voor genexpressie of uitschakeling door Western Blot of immunokleuring2met eiwit codering.
9. organoïde Cryosectie in kelder membraan matrix
Opmerking: Zie Figuur 3.
- Verwijder ENR medium door zachte zuigkracht, wees voorzichtig niet te perturb de kelder membraan matrix en voorzichtig wassen eenmaal met 500 μL PBS.
- Repareer organoïden met 1,0 mL 4% Paraformaldehyde (PFA) oplossing (tabel met materialen) bij RT gedurende 30 min.
- Verwijder PFA door afzuiging en spoel zachtjes tweemaal met 1 mL PBS.
- Verwijder PBS door afzuigen en voeg 1,0 mL 30% sacharose buffer toe aan elk monster. Incuberen vaste organoïden in sucrose gedurende 1 uur bij 4 °C in een koude ruimte, koelkast of op ijs om monsters te dehydraat.
- Verwijder de sacharose buffer door afzuiging en voeg net genoeg insluit verbinding (Inhoudsopgave) toe om de matrix laag (~ 300 μL/well) in elke put te bedekken.
- Incuberen bij RT gedurende 5 min.
- Plaats de monsters in een vriezer van 80 °C gedurende 10 minuten, of totdat de inbedding vast en wit brandt.
- Plaats de schaal met bevroren insluitings verbinding bij RT om het minimale smelt van de verbinding langs de randen mogelijk te maken. Gebruik een scalpel om het blok van de wanden van de put te scheiden.
- Verwijder het samengestelde blok met behulp van een tang en plaats het in een preparaat blok (bv. cryomold), dat snel werkt om smelten te voorkomen.
- Vul de mal volledig met insluitings verbinding en Vries gedurende 30 minuten bij-80 °C.
- Gebruik het blok is voor het snijden of opslaan in-80 °C vriezer voor verder gebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier beschrijven we een snelle en zeer efficiënte transductie techniek die magnetische nanodeeltjes die worden blootgesteld aan een magnetisch veld, maakt om lentivirus aan cellen van belang te leveren. Met gemakkelijk verkrijgbare hulpmiddelen hebben we deze aanpak niet alleen toegepast om vers geïsoleerde crypt cellen (Figuur 1a) te leiden, maar ook voor organoïden (Figuur 2) en andere cellen die ongevoelig zijn voor meer routine transductie benaderingen. Linvirale deeltjes kunnen gemakkelijk worden geconjugeerd aan magnetische nanopartikels en de resulterende virusnanoparticle-complexen worden efficiënt geleverd door het aanbrengen van een magnetisch veld met behulp van een magnetische plaat. Om deze aanpak te optimaliseren, testten we eerst linvirale vectoren gekoppeld aan GFP, zodat GFP kan worden gebruikt om getransduceerde cellen te identificeren met fluorescentiemicroscopie. De GFP kan in elke fase van de organoïde ontwikkeling worden gevisualiseerd, met inbegrip van vroeg wanneer crypte cellen zich organiseren in cyste achtige structuren (figuur 4a), of op latere tijdstippen wanneer organogeniden de knoppen (figuur 4b) vormen. Met succes getransduceerde intestinale organoïden kunnen vervolgens een functionele analyse ondergaan voor veranderingen in ontwikkeling door kleurings celmembranen en kernen om het totale celnummer te inventariseren naast Lineage markers, zoals lysozym om paneth cellen te identificeren ( Figuur 4C).
De genetisch gemanipuleerde organoïden kunnen worden gebruikt voor verdere analyse door het genereren van bevroren secties zoals hier beschreven (Figuur 3). Na het insluiten van organoïden kunnen bevroren blokken worden opgeslagen en later worden opgesplitst voor toekomstige studies. Deze aanpak is ook efficiënt (geschat op ~ 95% op basis van percentage van GFP (+) organoïden voor totale organoïden). Deze aanpak kan worden uitgevoerd met standaard laboratoriumreagentia, waardoor weefsels worden verschaft die vatbaar zijn voor divers onderzoek, waaronder het aantal cellen, het lot van cellen, en de aanwezigheid en het niveau van specifieke eiwitten2. We gebruikten bijvoorbeeld bevroren secties en immunofluorescentie kleuring om individuele cellen te identificeren en celtype te bepalen (figuur 4c).
Figuur 1: geïsoleerde crypten en Villi met cartoons die een typische morfologie vertonen. A) geïsoleerde crypten vormen ronde of ovale structuren. B) Villi worden geïdentificeerd als vinger-achtige structuren. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: schematische weergave van virale transductie van organoïden met behulp van magnetische nanodeeltjes en blootstelling aan een magnetisch veld. De meest kritische stappen van het transductie protocol worden getoond. A) incuberen virus en magnetische nanodeeltjes oplossing gedurende 15 minuten bij RT in een buis van 1,5 ml. B) Voeg het magnetische nanodeeltjes-/virusmengsel toe aan de cellen die moeten worden transduced. C) plaats de celkweek plaat op de magnetische plaat en incuberen gedurende 2 uur in een standaard incubator voor weefselkweek. Er kunnen ook langere incubatie tijden worden gebruikt (~ 6 uur); de representatieve put wordt hier op de magnetische plaat getoond. D) een cel met het virus en een magnetisch nano artikel wordt afgebeeld. (E) Breng de geïnfecteerde organoïde-celclusters en transductie media van elke put over in een buis van 1,5 ml en centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 minuten. Gooi het supernatant met zachte zuigkracht weg en koel de buis met de pellet op het ijs gedurende 5 min. (F) Voeg 120 μL van de kelder membraan matrix en hervat de pellet door het pipetteren langzaam op en neer. G) zaad druppels van 30 μL met matrix-celmengsel in elk goed in een nieuwe 48-goed plaat. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: schematische weergave van bevroren snede van organoïden in 3D-matrix. De meest kritieke stappen van het bevroren snij-protocol worden weergegeven. A) een enkele put binnen een 24-Well celkweek plaat wordt afgebeeld. B) Voeg net voldoende inbedding toe om de matrix laag (~ 300 μL/well) te bedekken en inincuberen bij RT gedurende 5 min. (C) plaats monsters bij-80 C in een vriezer gedurende 10 min of totdat de inbedding vast en wit draait. Plaats het gerecht vervolgens op RT om licht te smelten langs de randen van het monster. D) gebruik een scalpel om het blok van de wanden van de put te scheiden. E) Verwijder het samengestelde blok met behulp van een tang en plaats in een geschikte ondiepe container of mal voor het bevriezen van weefsels. Vul de mal volledig met inbedding Compound (OCT). F) blokkade bij-80 C in een vriezer gedurende 30 min. (G) het blok is klaar voor het snijden of opslaan in-80 C vriezer voor verder gebruik. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: representatieve beelden van getransduceerde intestinale organoïden. A) representatief beeld van kleine intestinale organoïden onder lichte Microscoop met (linker) fluorescentiemicroscopie en, (rechts) standaard microscopie van de transgen expressie (EGFP) op dag 3 na transductie. Schaalbalk = 50 μm. (B) voorbeeld van overexpressie van GENENCODING GFP in organoïde na transductie met behulp van magnetische nanodeeltjes. Organoïde cellen werden met lentivirus in de uitdrukking GFP (FUGW; Boven) of lentivirus die Hmga1 overexpressie (fugw-Hmga1; Onderkant) zoals weergegeven op dag 12 na transductie. Schaal staaf = 50 μm.C) immunofluorescentie beeldvorming van formaline vast bevroren gedeelte van organoïden. Organoid secties (4 μm) werden bevlekt met anti-lysozyme (rood), anti-EpCAM (groen) en DAPI (blauw). Epcam afbakent celgrenzen, DAPI gaf individuele kernen aan en lysozym vlekken paneth cellen. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Organoïde kweekmedium (ENR) | 100 mL |
| DMEM/F12 + | 96 mL |
| L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement (bijv. Glutamax) | 1 mL |
| NEAA | 1 mL |
| Pen/Strep | 1 mL |
| HEPES | 1 mL |
| EFG (100 μg/mL) | 5 μL |
| Noggin (100 μg/mL) | 10 μL |
| R-spondin (100 μg/mL) | 10 μL |
| of R-spondin voorwaarde medium (CM) | 20 mL |
| Humane recombinant insuline (10 mg/mL) | 5 μL |
| Transductie medium | 5 mL |
| ENR medium | 2,4 mL |
| WNT voorwaarde medium (CM) | 2,5 mL |
| Nicotinamide (1M) | 100 μL |
| Y27632 (10 μM) | 10 μL |
| Crypts dissociatie buffer | 100 mL |
| PBS (zonder CA2 +, mg2 +) | 99 mL |
| Pen/Strep | 1 mL |
| 0,5 M EDTA | 100 μL |
| 0,1 M DTT (dithiothreitol) | 100 μL |
| 293T gemiddeld | 100 mL |
| DMEM | 90 mL |
| FBS | 10 mL |
| Virus Collection medium | 100 mL |
| DMEM | 99 mL |
| FBS | 1 mL |
| Organoïde-vergistings buffer | 1 mL |
| DMEM/F12 + | 1 mL |
| Dispase I (10 mg/mL) | 6 μL |
| DNase I (10 mg/mL) | 2,5 μL |
Tabel 1: media die in het protocol worden gebruikt.
| Platen | 10 cm | 15 cm |
| Lentivirus transducing vector | 6 μg | 9 μg |
| CMVΔR 8.91 | 8 μg | 12 μg |
| Md. G | 2 μg | 3 μg |
| Totaal aantal vectoren | ≤ 16 μg | ≤ 24 μg |
Tabel 2: hoeveelheid plasmide DNA voor Transfectie.
| Plaat | Magnetische kralen (μL) | Volume van het virus (μL) | Eind TransductionVolume (μL) |
| 48-well | 6 | 50 | 250 |
| 24-Well | 12 | 100 | 500 |
Tabel 3: volume van de magnetische kraal oplossing en vector.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Primaire cultuur van volwassen intestinale epitheel als organoïden biedt een krachtig hulpmiddel om moleculaire mechanismen te bestuderen die betrokken zijn bij stamcel functie, intestinale epitheliale homeostase en pathologie1,2,3, 4. Hoewel CRISPR/Cas9 technologie kan worden gebruikt voor genetisch gemanipuleerde organoïden9, wordt het beperkt door de noodzaak van uitgebreide screening en selectie op basis van sequentieanalyse voor de gewenste genetische veranderingen. Het doel van dit protocol is om duidelijke en beknopte instructies te geven met video-gebaseerde tutorials voor magnetische nanodeeltjes levering van Lenti-of retrovirus aan intestinale organoïden, gevolgd door bevroren snijden voor verdere analyse.
Dit protocol is een snelle en efficiënte methode om genetisch ingenieur intestinale organoïden en analyseren van de gevolgen van genen overexpressie of uitschakeling van bevroren secties. Kritische stappen worden geschetst in Figuur 2, Figuur 3. Deze strategie maakt onderzoek mogelijk naar de biologische significantie van genetische veranderingen (overexpressie of silencing) in intestinale stamcellen en hun nakomelingen gekweekt onder 3D-condities2,13. We hebben deze magnetische nano-article-gebaseerde levering van virale vectoren ook gebruikt om celtransductie en transgenexpressie in vitro in verschillende primaire cellen2,13te verbeteren.
Met deze aanpak worden virale deeltjes bekleed met magnetische nanopartikels en geleverd aan cellen door blootstelling aan een magnetisch veld. Vergeleken met de huidige transductie methoden, zoals poly Brene met of zonder spinoculatie10,15, zijn magnetische nanodeeltjes-virale complexen minder giftig voor cellen omdat de opname van het genetisch materiaal wordt gemedieerd door endocytose en Pinocytose, twee natuurlijk voorkomende biologische processen die geen aanzienlijke schade aan celmembranen veroorzaken. Dus, zowel de levensvatbaarheid van de cel en de efficiëntie van de transductie worden verbeterd. Transductie-efficiëntie kan verder worden verhoogd met behulp van kleine crypte fragmenten of enkele cellen (zie stap 4,8) in plaats van grotere crypten of volledige organoïden zoals eerder gerapporteerd2,10,13,16. Magnetisch geleide nanodeeltjes levering resulteert in een snelle accumulatie, penetratie en opname van virale vectoren in de doelcellen2,13. De magnetische nanodeeltjes zijn gemaakt van ijzeroxide, dat volledig biologisch afbreekbaar is en bekleed met specifieke gepatenteerde kationische moleculen. Nanodeeltjes associatie met virale vectoren wordt bereikt door zout-geïnduceerde colloïdale aggregatie en elektrostatische interacties. De nanodeeltjes worden vervolgens geconcentreerd op cellen door een extern magnetisch veld dat wordt gegenereerd door de magnetische plaat die onder het cultuur gerecht is geplaatst. Terwijl transductie-efficiëntie 95% nadert, zijn niet alle cellen transduced, wat een beperking is voor deze techniek. Daarnaast worden endogeen uitgesproken genen van belang veranderd zoals bij CRISPR/Cas9 benaderingen.
Na gen-overexpressie of uitschakeling kunnen de organoïden worden gebruikt voor een groot aantal studies, afhankelijk van de wetenschappelijke doelstellingen, waaronder analyse van genexpressie, proteïomische veranderingen in cellen of uitgescheiden door cellen, metabole veranderingen, en morfologische veranderingen. Net als bij levende weefsels, kunnen bevroren delen worden verkregen voor immunohistochemische en immunofluorescentie studies van specifieke eiwitten zoals transcriptiefactoren, cytoplasmische moleculen of celoppervlak markeringen. Ons artikel bevat een effectieve aanpak om bevroren secties van organoïden te verkrijgen zonder hun positie en organisatie in de 3D-cultuur te verstoren. Dit is voordelig omdat voor het invriezen van de organoïde uit de kelder membraan matrix voor de voorafgaande technieken moet worden verwijderd16. Het verwerken van organoïden door verwijdering uit matrix kan de structuur organisatie van de organoïde verstoren in plaats van de in vitro groei en ontwikkeling weerspiegelen.
Dit protocol aan genetisch ingenieur intestinale organoïden kan ook worden aangepast om andere cel-gebaseerde modellen en organoïde systemen te bestuderen. Bijvoorbeeld, pancreatic, Colon, hepatische, cardiale, en cerebrale organoïde systemen kunnen worden getransduceerde met deze aanpak. Zelfs cellen die onder meer standaard kweektechnieken groeien, zijn vatbaar voor nano-article-technologie. Bovendien kan deze aanpak worden toegepast om de moleculaire mechanismen van ziekten te bestuderen, niet alleen in de context van stamcel-afgeleide organoïde systemen, maar ook in tumor organoïden.
Samengevat, de belangrijkste wijzigingen beschreven in deze protocollen voor intestinale organoïde studies zal hopelijk machtigen wetenschappers om de rol van belangrijke factoren en downstream trajecten die betrokken zijn bij de biologie van intestinale stamcellen en hun nakomelingen te verheldoen . Deze benaderingen moeten de middelen bieden om meer te leren over moleculaire mechanismen die onderliggende zelf vernieuwing zijn, bepaling van het lot van cellen, weefselhomeostase en intestinale epitheliale regeneratie, onder zowel fysiologische als pathologische omstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door subsidies van het National Institute of Health (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), het Maryland stamcel Research Fund (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), de American Lung Association, het Allegheny Health Network-Johns Hopkins Research Fund en de Hopkins spijsverterings ziekten Basic Research core Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Base medium for 293T cells |
| DMEM/F12+ | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer |
| OPTI-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Virus plasmids transfection medium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | Component of virus collection medium and 293T medium |
| Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer |
| PBS (without Ca2+, Mg2+) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | A wash buffer and component of crypt dissociation buffer |
| Mem-NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Component of organoid culture medium |
| GlutamaxII | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Component of organoid culture medium |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Component of organoid culture medium |
| EGF | Millipore Sigma | E9644 | Component of organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 250-38 B | Component of organoid culture medium |
| R-spondin | R&D | 7150-RS-025/CF | Component of organoid culture medium |
| Human recombinant insulin | Millipore Sigma | I9278-5ml | Component of organoid culture medium |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N3376-100G | Component of Transduction medium |
| Wnt3A | R&D | 5036-WN-010 | Component of Transduction medium |
| Y27632 | Millipore Sigma | Y0503-1MG | Component of Transduction medium |
| 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Component of Crypts dissociation buffer |
| DTT (dithiothreitol) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | Component of Crypts dissociation buffer |
| Dispase I | Millipore Sigma | D4818-2MG | Component of organoid digestion buffer |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Component of organoid digestion buffer |
| matrigel(Growth factor reduced) | Corning | 356231 | Used as a matrix to embed organoids |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Medium for transfection in viral production |
| ViralMag R/L | Oz Biosiences | RL40200 | Magnetic particles of viral transduction |
| Magnetic plate | Oz Biosiences | MF10000 | Magnetic plate to facilitate viral transduction |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Transfection agent in viral production |
| Poly-D-Lysine | Millipore Sigma | A-003-E | Coating for plates before seeding 293T cells |
| 4% Formaldehyde Solution | Boster | AR1068 | Solution to fix organoids |
| O.C.T embedding compound | Thermo Fisher Scientific | 4583S | For embedding of the the organoids |
| 5 mL Falcon polystyrene tubes | Corning | 352054 | |
| 50 mL Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.100 | |
| Orbitron rotator II Rocker Shaker | Boekel Scientific | 260250 | |
| Olympus Inverted microscop CK30 | Olympus | CK30 | for scanning and counting crypts |
| Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence | Nikon | Axiovert 200 | for viewing fluorescence in the crypts |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane | Milipore Sigma | UFC910024 | For concentrating viruses |
| pluriStrainer 20 µm (Cell Strainer) | pluriSelect | SKU 43-50020 | For preparing organoid fragments |
| Falcon Cell Strainer | Fisher Scientific | 352340 | For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid) | Millipore Sigma | M8937-100EA | ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments |
| Animal strain: C57BL/6J | Jackson Lab | #000664 | For organoid culture |
References
- Cheung, E. C., et al. TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis. Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).
- Xian, L., et al. HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche. Nature Comm. , (2017).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).
- Kabiri, Z., et al. Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts. Development. 141, 2206-2215 (2014).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. J Vis Exp. (120), (2017).
- Muñoz, J., et al. The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent '+4' cellmarkers. EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).
- Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture. J Vis Exp. (90), e51765 (2014).
- Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).
- Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells. Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Tesfaye, A., et al. The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis. Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).
- Haim, H., et al. Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus. J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).
- Xue, X., Shah, Y. M. In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors. J Vis Exp. (75), e50210 (2013).
